Capitolo 2
Risultati e Discussione
2.1 Sintesi di nuovi liquidi Ionici
Nel corso di questa tesi per esfoliare e solubilizzare la melanina sono state preparate tre serie di liquidi ionici aventi come catione un eterociclo aromatico azotato (N-metilimidazolo, Piridina o Isochinolina), alchilato all’azoto aromatico con una catena alchilica lineare a quattro o otto atomi di carbonio, C4 o C8. In particolare, considerando la natura della melanina abbiamo cercato di sfruttare al meglio l’eventuale capacità di liquidi ionici aromatici di interagire con la macromolecola biologica mediante interazioni π – π stacking; in letteratura sono stati infatti riportati non solo diversi studi di binding che dimostrano un’affinità marcata di alcuni composti azaaromatici (piridina, chinolina e acridina) per l’eumelanina [91], ma è stata anche dimostrata la possibilità di interazione fra la melanina e due insetticidi diquat e paraquat [92], entrambi caratterizzati dalla presenza di nucleo piridinico carico positivamente sull’atomo di azoto. In altri termini, due composti che presentano una spiccata analogia con i liquidi ionici preparati e utilizzati in questa tesi. E’ da notare che sia i composti studiati per il binding, sia i cationi dei liquidi ionici, hanno un sistema aromatico elettron povero, che dovrebbe interagire ancor più intensamente con le porzioni aromatiche della melanina, rese elettronricche dalla presenza di funzionalità fenoliche.
L’obiettivo di questo lavoro di tesi, ovvero la solubilizzazione di melanine di tipo DHN e DHI, imponeva tuttavia alcune restrizioni per quanto concerne la scelta dei liquidi ionici da utilizzare come solventi; questi composti dovevano essere liquidi a temperatura ambiente, in quanto le melanina possono andare incontro a degradazione a temperature superiori ai 40° e non dovevano possedere caratteristiche spiccate di acidità o basicità, sempre per evitare l’eventuale degradazione della melanina.
Pertanto la scelta dei contro-anioni è ricaduta su anioni neutri o debolmente acidi o basici. In particolare sono stati utilizzati gli anioni: Tf2N-, PF6-, BF4-e N(CN)2- . Di questi, i primi duedanno in genere liquidi ionici con caratteristiche idrofobiche mentre il BF4- e N(CN)2-
liquidi ionici idrosolubili. La scelta di questi anioni, e l’associazione con i sovramenzionati cationi, ci consentiva pertanto di avere una serie di solventi ionici caratterizzati da una polarità variabile in un intervallo relativamente ampio. Inoltre, almeno alcuni di questi anioni erano in grado di assicurare una buona mobilità ionica anche a basse temperature; in altri termini erano in grado di dare composti ionici liquidi in un intervallo ampio di temperature e con una viscosità a temperatura ambiente moderata.
2.1.1 Metodi di Sintesi
I liquidi ionici utilizzati nel corso di questa tesi sono stati sintetizzati per reazione di Menshutkin [93] dell’isochinolina, N-metilimidazolo e piridina con l’opportuno alogenuro alchilico. Come alogenuri alchilici sono stati scelti dei bromuri, in quanto il Br- è un migliore leaving group del Cl- nelle reazioni di sostituzione nucleofila, SN2.
Con R = C4H9 , C8H17
Per la quaternarizzazione dell’isochinolina le reazioni sono state effettuate utilizzando come solvente l’acetonitrile e il grezzo di reazione è stato purificato per cristallizazione da acetone. I sali di piridinio sono stati invece sintetizzati in acetato di etile. Per quanto riguarda la sintesi dell’1-butil-3-metilimidazolio bromuro, per questa reazione è stata messa a punto una procedura sintetica di più basso impatto ambientale; lo stesso sale di imidazolo in quantità stechiometrica con reagenti è stato infatti utilizzato come solvente. In queste condizioni (solvente liquido ionico, temperatura 100 °C), la reazione arriva a completezza in due giorni, mentre utilizzando l’acqua come solvente alla temperatura di riflusso la completezza si raggiunge in sei giorni e tempi superiori sono necessari nel caso in cui si utilizzi l’acetonitrile.
Con l’eccezione del N-ottilpiridinio e del 1-ottil-3-metilimidazolio bromuro, che si presentano a temperatura ambiente come dei liquidi viscosi di color arancio, tutti i sali bromuro era dei solidi cristallini a temperatura ambiente.
2.1.2 Reazioni di Metatesi
I liquidi ionici utilizzati nel corso di questa tesi sono stati sintetizzati per reazione di Menshutkin [93] dell’isochinolina, N-metilimidazolo e piridina con l’opportuno alogenuro alchilico. Come alogenuri alchilici sono stati scelti dei bromuri, in quanto il Br- è un migliore leaving group del Cl- nelle reazioni di sostituzione nucleofila, SN2.
Con R = C4H9 , C8H17
Per la quaternarizzazione dell’isochinolina le reazioni sono state effettuate utilizzando come solvente l’acetonitrile e il grezzo di reazione è stato purificato per cristallizazione da acetone. I sali di piridinio sono stati invece sintetizzati in acetato di etile. Per quanto riguarda la sintesi dell’1-butil-3-metilimidazolio bromuro, per questa reazione è stata messa a punto una procedura sintetica di più basso impatto ambientale; lo stesso sale di imidazolo in quantità stechiometrica con reagenti è stato infatti utilizzato come solvente. In queste condizioni (solvente liquido ionico, temperatura 100 °C), la reazione arriva a completezza in due giorni, mentre utilizzando l’acqua come solvente alla temperatura di riflusso la completezza si raggiunge in sei giorni e tempi superiori sono necessari nel caso in cui si utilizzi l’acetonitrile.
Con l’eccezione del N-ottilpiridinio e del 1-ottil-3-metilimidazolio bromuro, che si presentano a temperatura ambiente come dei liquidi viscosi di color arancio, tutti i sali bromuro era dei solidi cristallini a temperatura ambiente.
2.1.3 Stato fisico dei liquidi ionici
I liquidi ionici ottenuti dalle procedure sopra descritte sono stati selezionati sulla base del loro stato fisico a temperatura ambiente. I processi di dissoluzione sono stati infatti condotti a temperatura ambiente, utilizzando composti liquidi a 20 °C. In Tab 2.1 è stato riportato la stato fisico a temperatura ambiente di ogni liquido ionico sintetizzato nel corso di questa tesi evidenziando quelli utilizzati per la dissoluzione della melanina:
Catione Anione Stato fisico a temperatura ambiente Utilizzo per la dissoluzione della melanina 1-Butil-3-Metil Imidazolio Tf2N Liquido ✔ PF6 Liquido ✔ BF4 Liquido ✔ N(CN)2 Liquido ✔ 1-Ottil-3-Metil Imidazolio Tf2N Liquido ✔ PF6 Liquido ✔ BF4 Liquido ✔ N(CN)2 Liquido ✔ N-ButilPiridinio Tf2N Liquido ✔ PF6 Solido ✖ BF4 Liquido ✔ N(CN)2 Liquido ✔ N-OttilPiridinio Tf2N Liquido ✔ PF6 Solido ✖ BF4 Liquido ✔ N(CN)2 Liquido ✔
N-Ottil Isochinolinio Tf2N Liquido ✔
PF6 Solido ✖ BF4 Solido ✖ N(CN)2 Solido* ✖ N-Butil Isochinolinio Tf2N Solido ✖ BF4 Solido ✖
Tab 2.1 stato fisico a temperatura ambiente dei liquidi ionici sintetizzati
Come prevedibile molti dei liquidi ionici a catione isochinolinio sono risultati solidi a temperatura ambiente, probabilmente quale conseguenza dell’aumentata entità delle interazioni intermolecolari che si vengono a generare all’interno di questi composti, e pertanto non sono stati utilizzati per le prove di dissoluzione. Per queste prove sono stati quindi utilizzati tra gli isochinolinici, l’[OIsoq][Tf2N] e l’[OIsoq][N(CN)2], sebbene quest’ultimo sia solo parzialmente liquido a temperatura ambiente.
2.2 Solubilizzazione della melanina
2.2.1 Problematiche inerenti alla dissoluzione della melanina
Sulla base di quanto riportato in letteratura, la dissoluzione delle melanine nei solventi classici è un processo particolarmente difficoltoso. La solubilità dipende dalla tipologia dei monomeri che costituiscono la melanina e quindi dall’organismo di provenienza. Inoltre, nella maggior parte dei casi la solubilizzazione della melanina avviene per degradazione ed implica l’utilizzo di mezzi acidi o basici. Fra i pochi solventi che sono risultati particolarmente efficaci è da menzionare il Soluene-350[94] e l’acqua ossigenata. Il Soluene-350 è un solvente industriale, in pratica una soluzione 0,1 N di un sale di ammonio quaternario, l’N,N-dimetil-N-undecil-N-dodecilammonio idrossido, in toluene. La solubilizzazione sfrutta sia l’affinità dell’ammonio quaternario per la melanina, che la presenza di un solvente a struttura aromatica. Il meccanismo alla base del processo di dissoluzione rimane tuttavia al momento sconosciuto, anche se si è dimostrato che non è dovuto semplicemente alla basicità del soluene: se la soluzione viene neutralizzata con acido acetico non si ha la riprecipitazione della melanina. La solubilità in questo ambiente appariva tuttavia un efficace incentivo verso l’utilizzo di liquidi ionici che possono combinare in una sola molecola entrambe le caratteristiche e generare interazioni soluto-solvente di efficacia paragonabile.
Un ulteriore solvente che ha portato buoni risultati nella dissoluzione di queste macromolecole è la miscela ammoniaca-DMF che associa caratteristiche basiche alla capacità di formare legami a idrogeno fra le funzioni chinol-chinoidi della melanina e gli atomi di azoto e ossigeno presenti nel solvente. Tale miscela si è però rivelata efficace esclusivamente per l’Eumelanina sintetica, che presenta significative differenze strutturali rispetto al suo analogo naturale.
Per evitare i problemi relativi alla termolabilità della melanina, le prove di solubilità sono state condotte a temperatura ambiente utilizzando ultrasuoni. Lo scopo di questa tesi era infatti quello di solubilizzare la melanina preservando la sua struttura e proprietà, in modo da poterla utilizzare quale sostituto di origine naturale del grafene, un materiale recentemente molto studiato anche in liquidi ionici e con molte potenziali applicazioni, che vanno dal campo della medicina all’elettronica. Particolarmente interessante è l’utilizzo del grafene come carrier di farmaci antitumorali. In virtù di un affinità strutturale fra il grafene e le melanine, soprattutto dovuto all’estesa presenza di nuclei aromatici, si può pensare che le melanine potrebbero trovare in un futuro non troppo lontano applicazioni simili a quelle ipotizzate per il grafene. Alcune di queste possibili applicazioni trovano fondamento nell’affinità della melanina per molti farmaci a struttura aromatica, come ad esempio la clorochina, la clorpromazina[95], il metotrexato e la gentamicina [37]. Considerando inoltre che recentemente è stata dimostrata una certa tossicità ambientale del grafene, la melanina potrebbe costituire un’alternativa “green” a questo materiale [3].
2.2.2 Sonicazione dei campioni
Il processo che è stato scelto per fornire alla melanina un’energia sufficiente per la sua dissoluzione in liquidi ionici è la sonicazione, un processo che entra nell’ambito della sonochimica e prevede l’utilizzo degli ultrasuoni. Gli ultrasuoni sono le onde sonore con frequenza compresa tra 20 kHz e 10 MHz. Esse si propagano in un mezzo sotto forma di onde di pressione che inducono un movimento vibratorio alle molecole la cui struttura viene alternativamente compressa ed estesa: la distanza tra le molecole varia, oscillando intorno alla loro posizione media. Allorché l'intensità degli ultrasuoni viene incrementata, si raggiunge un punto in cui le forze intermolecolari non sono più in grado di mantenere intatta la struttura molecolare, che collassa[96],[97].
La sonochimica è oggi una branca della chimica che studia gli effetti dell’applicazione degli ultrasuoni sui sistemi chimici. Si ritiene che alla base della sonochimica ci sia un fenomeno di cavitazione acustica, legato alla formazione, sviluppo ed collasso implosivo di bolle (o cavità) all’interno di un liquido sottoposto ad un intenso campo ultrasonoro [96], [98]. In un mezzo liquido, infatti, le onde ultrasoniche generate da un trasduttore creano onde di pressione e di depressione ad altissima velocità. Quando la pressione negativa supera la resistenza a trazione molecolare del liquido (soglia di cavitazione) parte la cavitazione: si formano milioni di bolle che, durante le fasi di compressione e rarefazione crescono fino ad implodere, liberando energia e provocando un violento ed improvviso cambiamento della temperatura e della pressione nella zona interessata.
In letteratura è riportato l’utilizzo degli ultrasuoni per la disgregazione della struttura supramolecolare della melanina, che si presenta sottoforma di globuli. A nostro avviso la sonicazione poteva quindi essere considerata la tecnica più affidabile per migliorare la dissoluzione della melanina nei liquidi ionici, per i seguenti motivi:
1) Essa causa la miscelazione e l’aumento dell’energia cinetica della soluzione pur permettendo il controllo della sua temperatura
2) La sonicazione era già stata utilizzata per degradare la struttura globulare della melanina [99]
3) La sonicazione ha dato buoni risultati per l’esfoliazione del grafene in solventi come i liquidi ionici [100]
Ai liquidi ionici che si presentavano allo stato liquido a temperatura ambiente, è stato aggiunto un milligrammo di melanina (DHI, monomero 5-6-diidrossindolo; DHN, monomero 1,8-diidrossinaftalene) e i campioni sono stati sottoposti a sonicazione. Anche il liquido ionico è stato sonicato nelle identiche condizioni senza l’aggiunta di melanina (bianco) per verificare eventuali effetti di questo trattamento sul solvente.
Dopo la sonicazione si è osservato un’opacizzazione più o meno marcata nei campioni di liquido ionico con la melanina sebbene la presenza di un corpo di fondo sia stata osservata nella quasi totalità dei campioni.
Nei recipienti (provette in vetro) contenenti i liquidi ionici con anione esafluorofosfato ([BMIm][PF6] e [OMIm][PF6]) si osserva una degradazione a carico del vetro: si suppone che l’azione degli ultrasuoni possa liberare HF.
2.2.3 Analisi dei campioni mediante Spettroscopia UV-Vis
La spettroscopia di assorbimento UV-visibile riguarda l'assorbimento della radiazione luminosa dello spettro elettromagnetico che comprende il campo del visibile (350 nm-700 nm) e il vicino ultravioletto (200 nm-350 nm).
Quando un fotone possiede una quantità di energia sufficiente da indurre una transizione elettronica, si verifica un assorbimento che segue la Legge di Lambert- Beer : A= εCl , dove A è l'assorbanza, ε (L/cm mol) è il coefficiente di estinzione molare, l è il cammino ottico (cm) e C è la concentrazione molare (mol/L).
Gli elettroni coinvolti nella transizione sono: • di tipo σ ;
• di tipo π;
• di tipo n, ovvero gli elettroni di non legame.
Sono riportati in questa tabella le tipiche transizioni dei composti organici visibili mediante spettroscopia UV-Vis :
Tipo di transizione Lunghezza d'onda della radiazione
necessaria per ottenere una
transizione σ → σ* 110 – 135 nm π → π* n → σ* 160 – 255 nm n → π* > 285 nm
La melanina presenta uno spettro monotono, senza picchi di assorbimento, che decresce dall’UV al vicino infrarosso, dunque la presenza di eventuali altri picchi che discostano dall’andamento monotono dello spettro generalmente indica un’eventuale degradazione dell’analita. La banda di assorbimento della melanina è data dalle transizioni π → π* dei nuclei aromatici presenti in entrambe le specie di melanine e dalle transizioni n → π* degli elettroni sugli atomi di azoto aromatici nelle melanine DHI. Un esempio dello spettro di assorbimento UV-Vis della melanina è riportato in fig 2.2
Fig 2.2. Spettri UV-vis dell’eumelanina umana (linea continua) e della feomelanina (linea tratteggiata) [101].
Bisogna comunque considerare che questo spettro è relativo all’Eumelanina, che presenta anche funzioni carbossiliche e quindi l’andamento dello spettro può essere influenzato dalle relative transizioni. Dobbiamo inoltre tenere presente che nell’intervallo 200-250 nm il liquido ionico utilizzato come solvente assorbe considerevolmente (cut-off 230 nm), quindi l’assorbimento del campione si sovrappone in maniera più o meno rilevante a quello del liquido ionico.
I campioni dopo il trattamento con ultrasuoni sono stati analizzati mediante spettroscopia UV-vis, per verificare l’entità del processo di dissoluzione. Gli spettri sono stati registrati con sottrazione del bianco, utilizzando come bianco il liquido ionico sonicato nelle medesime condizioni.
Catione Anione Assorbimento DHN Assorbimento DHI λ (nm) A λ (nm) A 1-Butil-3-metilimidazolio Tf2N 258 0,129 238 0,570 BF4 251 0,280 265 0,258 N(CN)2 296 0,365 295 0,193 1-Otti-3-metilimidazolio Tf2N 238 0,070 258 0,243 BF4 242 0,299 280 0,095 N(CN)2 362 0,359 N-Butilpiridina Tf2N 287 0,158 BF4 Picco Assente Picco Assente Picco Assente Picco Assente N(CN)2 Picco Assente Picco Assente Picco Assente Picco Assente N-Ottilpiridina Tf2N Picco Assente Picco Assente Picco Assente Picco Assente BF4 Picco Assente Picco Assente Picco Assente Picco Assente N(CN)2 Picco Assente Picco Assente Picco Assente Picco Assente N-OttiliIsochinolin a Tf2N 432 0,245 434 0,343
Tab 2.3 Assorbimenti UV-melanine
Gli spettri di assorbimento UV delle melanine nei liquidi ionici a catione piridinio non presentano bande di assorbimento significative pur mostrando un opacizzazione del campione dopo sonicazione. Al contrario, negli altri liquidi ionici è possibile evidenziare bande di assorbimento, generalmente di forma allargata, la cui intensità dipende dalla quantità di melanina disciolta. Il massimo di assorbimento varia al variare della composizione del mezzo probabilmente quale conseguenza della variazione nelle interazioni liquido ionico-melanina, sebbene non sia possibile escludere l’insorgenza di eventuali fenomeni di degradazioni a carico della melanina per azione degli ultrasuoni. È da notare che le bande di assorbimento delle melanine si possono osservare in maniera distinta solo a lunghezze d’onda superiori rispetto alla banda di assorbimento dei liquidi ionici, che corrisponde ai 250 nm per i liquidi ionici a base imidazolo e si protrae fino ai 450 nm per i liquidi ionici a base isochinolinio. In altri termini, eventuali assorbimenti delle melanine al
di sotto dei valori sopra riportati, potrebbero coperti, che nonostante si lavori con uno strumento a doppio raggio sottraendo il bianco.
Considerando questi risultati è stato deciso di aggiungere un’ulteriore milligrammo di melanina ai campioni nei liquidi ionici riportati in Tab 2.4 e ripetere il processo di sonicazione, nelle stesse condizioni:
Liquido Ionico Secondo carico di
Melanina DHN Secondo carico di Melanina DHI [BMIm][BF4] ✔ ✔ [BMIm][N(CN)2] ✔ ✔ [BPyr][Tf2N] ✔ ✖ [OMIm][BF4] ✔ ✖ [OMIm][N(CN)2] ✔ ✔ [OMIm][Tf2N] ✔ ✔ [Oisoq][Tf2N] ✔ ✔
Tab 2.4 Liquidi ionici selezionati per il secondo carico di melanina
Come si può evincere dai dati di Tabella 2.4, da questo secondo screening sono stati esclusi i liquidi ionici a catione piridinio (con eccezione del [BPyr][Tf2N) in quanto i campioni di melanina qui dispersi non mostravano alcun assorbimento nella regione UV-vis anche dopo sonicazione. E’ stato inoltre escluso il [BMIm][Tf2N], in quanto gli spettri delle melanine presentano in questo mezzo molteplici picchi di assorbimento, alcuni dei quali con una larghezza a metà banda particolarmente ridotta, che sembravano suggerire una possibile degradazione dei biopolimeri. Gli spettri UV-Vis di questi campioni sono riportati in fig.2.4.
Fig.2.5 Spettri di Assorbimento UV-Vis dei campioni di Melanina DHI in [BMIm][Tf2N] (sopra) e del [BMIm][Tf2N] (sotto).
I campioni, dopo la seconda sonicazione, sono stati nuovamente analizzati mediante spettroscopia UV-vis e i picchi di massimo assorbimento, in tutte e due le loro variabili sono riportati in Tab 2.6
Liquido Ionico Melanina utilizzata λ (nm) A λ (nm) A ΔA
Primo carico Secondo carico
[BMIm] [BF4] DHN 251 0,280 258 0,492 + 0,212 DHI 265 0,258 260 0,372 + 0,114 [BMIm] [N(CN)2] DHN 296,00 0,365 296 0,682 + 0,317 DHI 295 0,193 295 0,563 + 0,370
[BPyr] [Tf2N] DHN 287 0,158 281 0,629 + 0,330 [OMIm] [BF4] DHN 242 0,299 247 0,617 + 0,318 [OMIm] [N(CN)2] DHN 362 0,359 363 0,907 + 0,548 DHI 396 0,145 394 0,436 + 0,291 [OMIm] [Tf2N] DHN 238 0,070 231 1,200 + 1,130 DHI 259 0,243 239 0,808 + 0,565 [Oisoq] [Tf2N] DHN 432 0,255 425 0,411 + 0,156 DHI 434 0,343 426 0.432 + 0.089
Tab 2.6 Assorbimenti dei campioni Liquido Ionico-Melanina dopo il secondo carico
E’ da notare l’intenso assorbimento dei campioni in 1-ottil-3-metilimidazolio, per i quali si osserva per altro un rilevante aumento dell’assorbanza dopo la seconda aggiunta di melanina; in particolare, per la melanina DHN l’assorbanza passa da 0,070 a 1,200. Inoltre, la variazione minima che si osserva nel massimo di assorbimento della banda all’aumentare della quantità di melanina fa presupporre che non si abbia alcun fenomeno di decomposizione, né a carico del solvente né dell’soluto durante il trattamento con ultrasuoni.
Infine, per quanto concerne l’uso del liquido ionico a catione isochinolinio è da notare che, sebbene la banda di assorbimento dei relativi liquidi ionici arrivi a circa 430 nm e questo andamento possa rendere difficile l’invividuazione di un eventuale attribuibile alla melanina, la dissoluzione del biopolimero in questo mezzo può essere considerata come almeno parzialmente avvenuta in quanto l’assorbimento differenziale aumenta considerevolmente dopo l’aggiunta di dosi crescenti di melanina
2.2.3 Misure di conducibilità dei campioni
Sulla base di quanto riportato in letteratura le varie specie di melanina possono essere considerate dei semiconduttori organici[102]. Considerando la natura ionica e conduttrice del mezzo di dissoluzione utilizzato in questa tesi, abbiamo deciso di verificare l’eventuale variazione di conducibilità nei campioni di melanina disciolti nei diversi liquidi ionici. Per questa analisi abbiamo utilizzato esclusivamente i campioni contenenti 2 mg di melanina, che avrebbe duvoto essere caratterizzati da cambiamenti di conducibilità più evidenti. In
Tab. 2.8 sono riportati i valori di conducibilità dei liquidi ionici puri e dei campioni du
melanina DHN, e melanina DHI negli stessi mezzi.
Liquido Ionico Conducibilità
liquido ionico (mS/cm2) a 25° Conducibilità Melanina DHN in liquido ionico (mS/cm2) a 25° Conducibilità Melanina DHI in liquido ionico (mS/cm2) a 25° [BMIm][BF4] 0,779 0,608 0,724 [BMIm][N(CN)2] 15,16 17,35 17,45 [BPyr][Tf2N] 4,92 4,85 ✖ [OMIm][BF4] 0,97 1,46 ✖ [OMIm][N(CN)2] 1,98 2,34 2,15 [OMIm][Tf2N] 1,593 1,76 1,77 [Oisoq][Tf2N] 0,23 0,26 0,22
Tab 2.8 Misure di conducibilità dei campioni
Come atteso, considerando la modesta quantità di melanina disciolta le variazioni di conducibilità sono nella maggior parte dei casi modeste (a volte nulle) anche se rilevabili. Sui campioni di melanina in liquidi ionici sono attualmente in corso analisi al microscopio a trasmissione elettronica (TEM) e mediante spettroscopia EPR .
2.3 Studio computazionale
Dopo aver testato la capacità dei liquidi ionici di portare in soluzione le due specie di melanina sono state effettuate delle indagini teoriche per poter razionalizzare un meccanismo di dissoluzione e poter dare delle indicazioni per sviluppare solventi più efficaci per questo scopo.
Sono stati effettuati dei calcoli utilizzando il metodo DFTB (Density Functional Tight
Binding). Il metodo DFTB è un metodo semi-empirico quanto-meccanico, che è simile al
tradizionale tight-binding empirico ma al posto della procedura di fitting empirica per gli elementi della matrice è presente una procedura ben definita di integrazione[13]. Esso origina dalla teoria funzionale della densità (DFT) ed è avvantaggiata dalla semplicità del metodo tight-binding tradizionale, il quale riduce i costi computazionali .
Il DFTB si basa su un espansione dell’equazione di Kohn-Sham dell’energia totale , una delle formule fondamentali che regolano il DFT, rispetto alla densità di carica , infatti per
un sistema di M elettroni nel campo di N nuclei alle posizioni R l’energia totale è scritta in funzione della densità di carica n(r):[14][15]
= ∑21$$ − + + 1/2 ( ) !′ # + $%&'! () + ∑ */+,, +*,/-.+− .,-.
Oltre ai classici termini di “band structure” e di repulsione, questa approssimazione dell’energia di Kohn-Sham include inoltre le interazioni Coulombiane fra le fluttuazioni di cariche. Per le interazioni con lunghe distanze si tiene anche conto delle interazioni elettrostatiche a lungo range fra due cariche puntiformi . E’ importante come questa derivazione del secondo ordine sia modificata da una redistribuzione auto consistente delle cariche di Mulliken (SCC) [105]. Questo approccio ha superato il classico metodo del Tight Binding e infatti è stato esteso per il calcolo delle proprietà ottiche e dello stato eccitato, caratteristica utile per lo studio strutturale della melanina.
Il nostro scopo è di poter calcolare con questo metodo l’energia dell’interazione fra le specie di melanina e i cationi dei liquidi ionici. La scelta di analizzare esclusivamente il catione è dovuta sia ad alcune difficoltà nello studio degli anioni, sia alla scarsa interazione di questi con i modelli di melanina studiati.
2.3.1 modelli dei cationi dei liquidi ionici
Fra i cationi che abbiamo utilizzato nel corso di questa tesi abbiamo scartato solo il catione N-Butil-Isochinolinio per quanto riguarda questi calcoli, in quanto nessun liquido ionico avente questo catione è risultato liquido, quindi utilizzabile per lo screening.
I restanti cationi : N-Metil Imidazolio, N-Ottil-N-Metil-Imidazolio, N-Butil-Piridinio, N-Ottil N-Butil-Piridinio, N-Ottil Isochinolinio sono stati disegnati con GaussView 5.0 (fig 2.8).
fig 2.8. Cationi dei liquidi ionici disegnati con Gaussview 05. A. N-Butil N-Metil Imidazolio, B N-Butil Piridinio, C N-Ottil Isochinolinio D N-Ottil N-Metil Imidazolio E. N-Ottil Piridinio.
Dopo aver disegnato i rispettivi composti sono stati effettuati calcoli mediante Gaussian 09 [106] utilizzando il metodo DFTB. Ogni struttura è stata ottimizzata.Così è stata calcolata l’energia di ogni singolo catione che viene riportata in tab 2.10
Cationi Azaaromatici Energia ( Kcal /mol)
N-Buti N-Metil Imidazolio 147,7446
N-Ottil Isochinolinio 155,6232
N-Ottil N-Metil Imidazolio 127,7485
N-Ottil Piridinio 137,9669
Tab 2.10 Energie calcolate per i cationi azaaromatici dei liquidi ionici.
I valori risultanti erano stati calcolati in Hartree mentre i valori riportati sono stati trasformati in Kilocalorie per mole (1 Hartree equivale a 627,503 Kcal/mol) .
2.3.2 Modelli di oligomeri della Melanina
In questa parte di tesi abbiamo costruito e calcolato dei modelli di melanina che corrispondono ad alcuni oligomeri riportati in letteratura. Non tutti questi oligomeri presi a modello possono corrispondere a oligomeri effettivamente riscontrati e isolati nella melanina ma alcuni sono ricavati da ipotesi teoriche. Per quanto riguarda la Melanina DHN è stato riportato un possibile dimero ipotizzato da Nicolaus e da Blois [5], [18] e successivamente disegnato, questo composto è riportato in fig 2.11 . Riguardo questa specie di Allomelanina non si conoscono altri eventuali oligomeri.
Fig 2.11 Dimero della melanina DHN
Abbiamo più informazioni invece sugli oligomeri che costituiscono la melanina DHI, appartenente alla vasta famiglia delle Eumelanine . Di questa specie sono stati ipotizzati vari oligomeri, però principalmente trimeri, tetrameri e esameri . La scelta è ricaduta sui tetrameri, in quanto sono i più comuni e inoltre è stata dimostrata una maggiore stabilità di questi rispetto ad altri oligomeri . [13], [14] . Riguardo alla struttura di questi tetrameri è
stato ipotizzato dal gruppo di E. Kaxiras un modello di tetramero simile alla porfirina. Questi tetrameri sono composti dalle combinazioni dei tre stati d’ossidazione del monomero DHI : 5,6-diidrossi-indolo (DHI), 5,6 indol-chinone(IQ) e i suoi due tautomeri chinone-immina(NQ) e chinone-metide(MQ)[107]. Questi ultimi due tautomeri sebbene risultino energeticamente sfavoriti migliorano la situazione della repulsione sterica degli atomi di idrogeno interni al tetramero Queste combinazioni sono state calcolate a livello DTF ed è stato simulato lo spettro dell’assorbimento ottico. Lo spettro simulato è stato confrontato con lo spettro sperimentale con risultati interessanti, osservabili in fig 2.12
Fig 2.12 Spettro d’assorbimento simulato della sovrapposizione dei tetrameri dominanti. Ai tetrameri individuale sono state date diversi colori per la distinzione e lo spettro dei monomeri è stato abbassato come assorbimento per chiarezza.
In seguito a questi studi abbiamo scelto di riportare un tetramero con soli monomeri DHI e dei tetrameri con un monomero di DHI sostituito da una sua forma ossidata, cioè l’indol chinone e i suoi tautomeri NQ e MQ. Queste forme sono alquanto improbabili in natura però la nostra idea è di poter studiare la variazione energetica dell’interazione fra catione azaaromatico e monomero della melanina a vari stadi di ossidazione nell’ambiente di un tetramero. Le quattro forme di tetrameri di DHI sono riportate in Fig 2.13
Fig 2.13 Modelli di Tetrameri ipotizzati di Kaxiras con un monomero rispettivamente ossidato . A Tetramero Ridotto , B. Tetramero con unità IQ C. Tetramero con unità NQ D. Tetramero con unità MQ.
Sebbene questo modello sia supportato da validi studi scientifici , altri studi sperimentali hanno riportato risultati diversi: nel 2007 dal gruppo di ricerca di D’Ischia è stato isolato un tetramero diverso, a catena lineare con legami diversi tra monomeri, fra i quali spicca un legame fra i carboni 2-3 appartenenti al ciclo a cinque [108] . Abbiamo applicato la stessa metodica utilizzata con il modello di Kaxiras e sono stati disegnati sia il tetramero con soli monomeri DHI, sia i tetrameri con i monomeri ossidati, e sono riportati in Fig 2.14.
Fig 2.14 Tetrameri Isolati della Melanina DHI . A. Tetramero Ridotto. B. Tetramero con unità IQ C. Tetramero con unità NQ D. Tetramero con unità MQ.
Dopo aver disegnato tutti gli oligomeri sono state calcolate le energie con metodo analogo rispetto alle energie calcolate per i cationi . Questi dati sono riportati in tab 2.
Oligomeri Melanina Energia ( Kcal/mol)
Dimero Melanina DHN -60,2903
Tetramero DHI modello Kaxiras -177,1539
tetramero DHI modello Kaxiras IQ -137,7348
tetramero DHI modello Kaxiras NQ -126,9684
tetramero DHI modello Kaxiras MQ -129,8624
tetramero DHI isolato IQ -145,6602
tetramero DHI isolato NQ -130,1802
tetramero DHI isolato MQ -126,9684
Si può anche osservare una piccola differenza fra il tetrameri del modello Kaxiras e i tetrameri isolati, infatti quest’ultimo ha un energia di circa 10 Kcal/mol inferiore al tetramero isolato.
2.3.4 Calcolo delle interazioni tra catione del liquido ionico e oligomeri
della melanina
Una volta individuati e calcolati i modelli per le interazione si è proceduto a disegnare le due molecole assieme ed individuare una possibile interazione. Ad esempio riportiamo i sistemi disegnati con dimero di melanina DHN e catione dei liquidi ionici in Fig 2.15
Fig 2.15 Disegno dell’interazione dei dimeri di melanina DHN con A. BMIm , B. BPyr C. OIsoq D. OMIm E. OPyr
Come si può osservare dalle immagini il tipo di interazione che sembra predominare è il π-π stacking fra i sistemi aromatici, specialmente per i cationi piridinio e isochinolinio. Nei cationi a catena lunga sono visibili anche interazioni di tipo idrofobo, mentre forze di tipo elettrostatico potrebbero causare un interazione specialmente nelle figure A e D, cioè tra i cationi a core imidazolico e i gruppi chinol-chinoidi del dimero melaninico .
Sono state disegnate inoltre anche le possibili interazioni sia con il tetramero ipotizzato sia con il tetramero isolato e sono riportate nelle seguenti figure fig 2.16 e fig 2.17
Fig 2.16 Disegno dell’interazione dei Tetrameri di melanina DHI ipotizzata da Kaxiras con A. BMIm , B. BPyr C. OIsoq D. OMIm E. OPyr.
Fig 2.17 Disegno dell’interazione dei Tetrameri isolati di melanina DHI con A. BMIm , B. BPyr C. OIsoq D. OMIm E. OPyr.
Anche in questo caso sono evidenti le interazioni di stacking fra il catione azaaromatico e i monomeri di tipo indolico. È osservabile che la forza di questi stacking è incrementata in quanto la porzione aromatica del catione è influenzata dalla presenza di atomi di azoto
all’interno del ciclo, che causa un effetto elettron-attratore e quindi un impoverimento elettronico del ciclo e nel mentre il ciclo aromatico degli indoli è arricchito dalla presenza di gruppi fenolici; quindi i due composti aromatici interagiscono adeguatamente . Nel caso del tetramero isolato vediamo come il liquido ionico si inserisca in una “tasca” all’interno dell’ambiente del tetramero. Sono visibili da queste immagini anche dei legami idrogeno fra l’idrogeno sul C2-C4 dei cationi azaaromatici e l’ossigeno dei sistemi chinol-chinoidi. Anche se il donatore di legame idrogeno risulta inusuale, tale possibilità dei liquidi ionici di donare il protone per il legame idrogeno è comprovata sperimentalmente [109]
Sono state successivamente calcolate le energie del sistema liquido ionico-melanina in modo da poter poi estrapolare la differenza di energia che ci può dare informazioni sull’entità dell’interazione. Tali valori sono riportati in Tab2.18.
Oligomero Melanina Catione Liquido Ionico Energia (Kcal/mol) Differenza E2 -E1 Tetramero DHI ipotizzato BMIm -45,6335 -16,2241 BPyr -36,0557 -16,8814 OIsoq -41,1078 -19,5770 OMIm -6,5544 42,8509 OPyr -5,6026 33,5843
isolato BPyr -39,8956 -0,7085 OIsoq -50,9034 -19,4192 OMIm -76,3053 -16,9464 OPyr -61,3206 -12,1800 Dimero DHN BMIm 78,5425 -8,9117 BPyr 73,5851 -24,1042 OIsoq 79,0528 -16,2801 OMIm 52,7151 -14,7430 OPyr 69,3640 -8,3125
Tab 2.18 Energie calcolate per le interazioni fra cationi dei liquidi ionici e oligomeri della melanina allo stato ridotto. Nelle quarta colonna è riportata la differenza d’energia del sistema, che ci permette di individuare l’entità energetica dell’interazione.
In Tab 2.19 sono invece riportate le distanze atomiche relative alle interazioni di stacking e i legami a idrogeno fra la melanina e il liquido ionico
Oligomero Melanina Catione Liquido Ionico Distanza media di stacking Distanza Legame Idrogeno Δ Legame C-H partecipante al legame a idrogeno Tetramero DHI ipotizzato BMIm - 2,04 0,02 BPyr 4,175 - -OIsoq 4,08 - -OMIm 3,98 - -OPyr 4,16 -
-Tetramero DHI isolato BMIm 4,105 - -BPyr 5,59 - -OIsoq 5,14 - -OMIm 5,045 2,45 0,01 OPyr 5,22 - -Dimero DHN BMIm - 2,11 0,03 BPyr - 1,98 0,02 OIsoq 4,185 - -OMIm 4,705 - -OPyr 3,45 -
-Tab 2.19 distanze atomiche delle interazioni, espresse in Angstrom (Å)
Da un punto di vista energetico possiamo individuare risultati confrontabili con le analisi UV: infatti risultato energeticamente favorite le interazioni con cationi imidazolici e isochinolinici rispetto alle interazioni con i liquidi ionici a catione piridinio. Un legame con alto valore energetico è il legame idrogeno fra [BPyr] e l’ossigeno chinonico del dimero DHN, confermato sperimentalmente dai buoni risultati ottenuti con il liquido ionico [BPyr][Tf2N], a prova di ciò anche il legame a idrogeno risulta più corto del normale. Bisogna precisare che le interazioni di stacking invece risultano alquanto lontane in quanto poche si aggirano sotto i 4 Angstrom di distanza media. Nonostante ciò alcune di esse risultano essere energeticamente favorevoli , come ad esempio i legami di stacking dell’N Ottil Isochinolino, che vanta di una porzione aromatica più ampia. Inoltre è osservabile un’interazione più efficace dei liquidi ionici nei confronti del tetramero di DHI sperimentale rispetto a quello ipotizzato.
La conclusione più importante da trarre da questi risultati è però l’interazione sfavorita dei cationi piridinici con gli oligomeri di melanina (specialmente il catione N-Ottil Piridinio), dato che risulta anche dalle misure effettuate con spettrometro UV-Vis. Quindi in questo caso risultati sperimentali e risultati teorici combaciano, e questo può convalidare le nostre ipotesi teoriche.
2.3.5 Interazioni dei cationi con Tetrameri DHI ossidati
Per saggiare ulteriormente l’interazione degli oligomeri con i liquidi ionici bisogna considerare che queste molecole di cui è composta la melanina possono andare incontro sia a fenomeni di ossidazione che a fenomeni di tipo radicalico. La formazione di funzionalità chinoniche è possibile anche solo con l’irraggiamento da parte di una fonte luminosa [52]. Per tale motivo è stato pensato di studiare come variano da un punto di vista energetico le interazioni fra i cationi dei liquidi ionici e gli oligomeri in parte ossidati. E’ stata trascurata in questo caso l’interazione fra il catione organico e i monomeri non adiacenti ad esso ( che sono ridotti) puntando per lo più a valutare come varia l’energia se il catione va a solvatare una porzione ossidata della melanina: ci si aspetta infatti un interazione più debole per il motivo citato nel paragrafo antecedente .
Un altro motivo di questo approfondimento è il voler paragonare i due modelli di tetramero della melanina DHI da un punto di vista energetico e verificare quale di questi due tetrameri si dimostra il più energeticamente favorito , anche alla luce degli stati di ossidazione a chinone.
Sono stati quindi riportati i dati in Tab 2.20
Melanina Catione liquido ionico Energia Differenza E2-E1 Differenza energia con tetramero ridotto + ils (E2-E1) differenza energia con tetramero analogo Tetramero DHI modello KG – IQ BMIm -12,7904 -33,5666 32,8430 -20,0585 BPyr -1,8387 -32,8499 34,2170 -17,4020 OIsoq -9,01738 -37,6722 32,0904 -12,8253 OMIm -33,8394 -34,6195 -27,2850 -11,9809 OPyr -24,3639 -35,3624 -18,7612 -20,1446 Tetramero DHI modello BMIm -0,2202 -10,2300 45,4133 -7,4883 BPyr 12,2524 -7,9924 48,3081 24,9430 OIsoq 8,5157 -9,3726 49,6235 28,1940
KG – NQ OMIm -21,5438 -11,5575 -14,9894 24,0546 OPyr -3,5904 45,5500 2,01220 27,1977 Tetramero DHI ipotizzato MQ BMIm 7,2680 -10,2962 64,1453 20,0585 BPyr 15,5633 -12,2360 55,4590 17,4020 OIsoq 3,8079 -21,6350 54,7114 12,825 OMIm -21,8585 -19,4268 39,4620 11,9809 OPyr -4,2192 -12,0059 72,0860 20,1446 Tetramero dhi isolato IQ BMIm 9,6180 7,53366 66,4952 9,8382 BPyr -12,6906 -25,0100 27,2050 -24,9430 OIsoq -19,6783 -29,6412 31,2251 -28,1940 OMIm -45,5984 -27,6867 15,7221 -24,0546 OPyr -30,7882 -23,0948 45,5170 -27,1977 Tetramero dhi isolato NQ BMIm 4,7553 -13,1267 50,3889 5,7929 BPyr 16,0480 -12,0692 52,1037 2,3430 OIsoq 10,7407 -15,01999 51,8485 -9,9310 OMIm -12,7610 -10,6470 -6,2065 4,8826 OPyr -0,0091 -8,1135 8,9381 5,5936 Tetramero DHI isolato MQ BMIm -1,03753 -21,8137 55,8397 -5,7929 BPyr 13,7049 -17,3063 53,6005 -2,3430 OIsoq 20,6718 -7,9829 71,5753 9,9310 OMIm -17,6436 -18,4238 58,6616 -4,8826 OPyr -8,9472 -19,9457 52,3734 118,0212
Tab 2.20 In questa tabella sono riportate l’energie dell’interazione fra liquidi ionici e tetrameri ossidati della melanina DHI , sia ipotizzati sia isolati. Nelle altre colonne ci sono le due differenze analoghe alla tabella precedente, la differenza fra questa interazione e l’interazione dello stesso catione e il tetramero corrispettivo completamente ridotto e nell’ultima tabella la differenza dell’interazione fra tetrameri analoghi appartenenti a serie opposte.
C-Melanina Liquido Ionico media di stacking Legame a Idrogeno H partecipante al legame a idrogeno Tetramero DHI modello KG – IQ BMIm - 2,01 0,02 BPyr - 2,01 0 OIsoq 4,88 - -OMIm - 2,09 0 OPyr 5,215 - -Tetramero DHI modello KG – NQ BMIm - 1,97 0,02 BPyr - 1,96 0,17 OIsoq - 2,08 0,02 OMIm - 1,98 0,03 OPyr - 1,95 0,01 Tetramero DHI ipotizzato MQ BMIm 3,48 - -BPyr - 2,2 -0,02 OIsoq - 1,98 0 OMIm 4,35 - -OPyr - - -Tetramero DHI isolato IQ BMIm 3,865 - -BPyr - - -OIsoq 5,69 - -OMIm 4,6 - -OPyr 5,215 - -Tetramero dhi isolato NQ BMIm 4,86 - -BPyr - 2,08 0,04 OIsoq 4,575 - -OMIm 3,865 - -OPyr - 2,04 0,01 Tetramero BMIm - 2,2 0,02
DHI isolato MQ BPyr - 1,9 0,01 OIsoq 6,33 - -OMIm 5,935 - -OPyr 5,105 -
-Tab 2.21 distanze atomiche delle interazioni di stacking e legame a idrogeno fra tetrameri del DHI con un monomero ossidato e cationi dei liquidi ionici. Le distanze sono misurate in Angstrom Å
Osservando questa tabella si vede come in pochi casi l’energia di interazione sia migliorata in rispetto all’interazione con il tetramero ridotto (vedi seconda colonna della Tab 2.20) quindi si può escludere l’ossidazione come un fenomeno che aiuti ad aumentare la solubilità della melanina nei solventi utilizzati in questo lavoro. Tuttavia si nota un cambiamento specialmente nel tipo di interazione: infatti la funzione chinonica orienta i cationi verso delle interazioni di tipo elettrostatico o, ancor più frequentemente, verso la formazione di un legame idrogeno. Un'altra osservazione interessante va fatta sulla differenza dell’energia fra i corrispettivi sistemi “tetramero con catione“ appartenenti alle due diverse serie: si vede come sia spesso favorito energeticamente il tetramero isolato. In questa seconda parte di calcoli continua a figurare la bassa energia di interazione fra tetrameri e catione N-Ottil Piridinio, che risulta l’unico catione su cui tutti i dati sperimentali hanno fornito una prova negativa nella dissoluzione della melanina
2.3.6 Considerazioni sugli studi computazionali
Questo studio teorico ci ha permesso di indagare sull’interazione fra un singolo liquido ionico e un oligomero dei tipi di Melanina studiati, però questo metodo, sebbene abbia dato risultati plausibili e confrontabili con le misure sperimentali presenta dei limiti per lo studio dell’effettivo meccanismo della dissoluzione della melanina in liquidi ionici :
1) La difficoltà di avere una visione delle interazioni supramolecolari a causa del disordine della struttura della melanina.
2) La variabilità del tipo di monomeri e oligomeri che la Melanina possiede, soprattutto in funzione della loro capacità di ossidazione o di generare radicali, anche tramite irradiazione di luce solare
3) La presenza all’interno della melanina di specie diverse, fra cui molti cationi metallici, che potrebbero influenzare l’azione dei liquidi ionici tramite un effetto chelante [9].
4) La difficoltà nello studiare alcuni anioni derivati dagli acidi di lewis come BF4 e PF6 Nonostante questi limiti si può ipotizzare un meccanismo di solubilizzazione analogo all’esfoliazione del grafene ossido in liquidi ionici[110] però con l’ostacolo del elevato grado di disordine della melanina, che evidentemente rallenta questa esfoliazione e successiva dissoluzione grazie a porzioni con delle interazioni più forti, e magari non costituite da semplici tetrameri.
Il bilancio di questo lavoro di tesi può essere considerato interessante da un punto di vista scientifico : innanzitutto sono stati sintetizzati un discreto numero di liquidi ionici per lo screening, alcuni dei quali inediti in letteratura , poi durante le prove di dissoluzione sono state verificate le potenzialità di alcuni liquidi ionici di portare in soluzione la melanina , sebbene non si sia mai verificato un fenomeno di dissoluzione completa in quanto sono presenti nel fondo della provetta delle discrete quantità di precipitato.
Successivamente tramite calcoli teorici effettuati con il metodo DFTB sono state ricavate delle energie di interazione che possono aiutare a far luce su eventuali meccanismi di dissoluzione di questa affascinante macromolecola . Infatti sono state verificate efficaci interazioni π-π stacking fra le porzioni aromatiche del solvente e del soluto che possono indirizzare la ricerca a migliorare i risultati qui ottenuti.
È doveroso precisare che approfondimenti analitici sui campioni con diverse tecniche come il microscopio TEM e la spettrometria EPR possono far luce sia sul grado di dissoluzione della melanina sia sul meccanismo di azione del solvente .
Concludendo, questo lavoro di tesi ha fornito alla comunità scientifica un punto di partenza per un nuovo ed efficace processo di dissoluzione della melanina . Questo passaggio può essere utile sia per approfondire gli studi strutturali e delle proprietà di questo affascinante e misterioso biopolimero sia per agevolarne le applicazioni nei campi di ricerca in cui sta dimostrando un buon potenziale, come nel campo tecnologico farmaceutico quale veicolo di farmaci oppure nel campo della biorobotica come semiconduttore biocompatibile.
