4. Risultati
4.1 Profilo di espressione di ZNF367 e MEX3A
Tramite ibridazioni in situ “whole mount” e su sezione applicate a embrioni di Xenopus laevis a vari stadi, ho cercato di ricostruire il profilo di espressione genica di ZNF367 e MEX3A. Nei rispettivi esperimenti ho usato come sonde i trascritti antisenso ottenuti dai cDNA dei due geni.
Esponiamo i risultati ottenuti dall’analisi di espressione di ZNF367. Allo stadio di neurula precoce si osserva che il trascritto è presente: nel tubo neurale, nei territori presuntivi dell’occhio e nella regione putativamente corrispondente all’ectoderma preplacodale. Si osserva anche un leggero segnale nei territori delle creste neurali. A stadi più tardivi di bottone caudale o “tailbud” ritroviamo il nostro trascritto in aree discrete del sistema nervoso: nell’occhio, nella vescicola otica, nelle regioni più anteriori del sistema nervoso centrale e negli archi branchiali (Fig. 4.1).
Fig. 4.1: Profilo di espressione genica di ZNF367 in embrioni di Xenopus. A stadio 18
osserviamo in posizione dorsale-anteriore la presenza del trascritto: nel tubo neurale, nei territori presuntivi dell’occhio, nel territorio pre-placodale e nella regione delle creste neurali. A stadio 27 osserviamo lateralmente la presenza del segnale: nell’occhio, nella vescicola otica, nelle regioni più anteriori del sistema nervoso centrale e negli archi branchiali.
Ho quindi analizzato il profilo di espressione genica di MEX3A. Allo stadio di neurula precoce e tardiva osserviamo una netta presenza del trascritto in tutto il tubo neurale, nei territori presuntivi dell’occhio, nell’ectoderma pre-placodale e nelle creste neurali (Fig. 4.2).
Allo stadio di “tailbud”, di cui osserviamo una fase più precoce (stadio 27) e una più tardiva (stadio 35), il nostro trascritto è diffusamente espresso nel sistema nervoso: nella vescicola otica, nei gangli dei nervi cranici, nell’occhio, negli archi branchiali e sistema nervoso centrale. Allo stadio di larva precoce possiamo osservare l’espressione di MEX3A in una sezione trasversale dell’encefalo di Xenopus laevis. Esperimenti di ibridazione in situ condotti su sezioni di embrioni a stadio 42 mostrano l’espressione di MEX3A: nella CMZ (zona marginale ciliare) della retina, nel mesencefalo dorsale, nei gangli dei nervi cranici e nella regione sottoventricolare del romboencefalo (Fig. 4.3).
St.18 St.18 St.21
Fig. 4.2: Profilo di espressione di MEX3A in embrioni di Xenopus. A stadio 18 osserviamo in
posizione prima dorsale e poi anteriore la localizzazione del trascritto a livello del tubo neurale, dei territori dell’occhio e dell’ectoderma pre-placodale. A stadio 21 è ben visibile anteriormente il segnale nel territorio delle creste neurali.
4.2 Sovraespressione di ZNF367 e MEX3A
Tramite microiniezione ho iniettato un blastomero su due in embrioni di Xenopus laevis, utilizzando gli specifici trascritti precedentemente ottenuti dai cDNA dei due geni di interesse. Per selezionare e procedere all’analisi fenotipica dei soli embrioni correttamente iniettati, ho selezionato gli embrioni in base alla presenza e alla localizzazione della GFP co-iniettata insieme al trascritto. Per saggiare gli eventuali fenotipi delle sovraespressioni ho fatto delle ibridazioni in situ “whole mount” utilizzando vari marcatori molecolari implicati in diverse fasi della
St.27 St.35
St.42
Fig. 4.3: Profilo di espressione di MEX3A in embrioni di Xenopus. Nei due quadranti
sopra osserviamo agli stadi 27 e 35 la presenza in posizione laterale del trascritto a livello: della vescicola otica, dei gangli cranici, dell’occhio, degli archi branchiali e del sistema nervoso centrale. Nei due quadranti sotto osserviamo due sezioni trasversali di encefalo, in esse il trascritto è rivelato con il Fast Red e lo visualizziamo in rosso. E’ localizzato nella CMZ della retina, nel mesencefalo dorsale, nelle regioni periventricolari dei gangli cranici e nella regione sottoventricolare del romboencefalo. In blu osserviamo l’Hoechst, un marcatore fluorescente nucleare.
neurogenesi. Gli embrioni manipolati e da analizzare sono stati fissati, nei diversi esperimenti, alla fase di neurula, fra gli stadi 16 e 18.
Le sovraespressioni dei due geni sono state fatte almeno tre volte per ogni gene, in modo da avere un numero di embrioni correttamente iniettati sufficiente per poter ritenere il fenotipo osservato significativo.
Osserviamo i risultati ottenuti per MEX3A.
Ho utilizzato il marcatore molecolare pan-neurale Sox2 il quale marca i precursori neurali. Agli stadi osservati lo ritroviamo espresso in tutta la piastra neurale. In seguito a sovraespressione di MEX3A osserviamo nel lato iniettato un’espansione del territorio di espressione di Sox2 sia anteriormente che dorsalmente (Fig. 4.4 A, B e
C). Questo fenotipo è stato osservato con una frequenza del 54% negli embrioni
analizzati (n = 116). A B C D Fig. 4.4: Sovraespressione di MEX3A in embrioni di Xenopus a stadio di neurula. Il lato iniettato è il destro, indicato con “Inj.” e lato di controllo è indicato con “Cont.” La marcatura è con Sox2, visione
dorsale-anteriore. La linea tratteggiata indica l’aumento del territorio di espressione di Sox2. (A,B e C) Espressione di GFP su lato iniettato, utilizzata per selezionare gli embrioni manipolati. (D) D Inj.
Cont. Cont. Inj.
Inj.
Cont. Cont. Inj.
Altri marcatori molecolari utilizzati sono stati: p27, XelrC e Twist.
p27 induce nelle cellule l’uscita dal ciclo cellulare. Allo stadio di neurula lo troviamo espresso all’interno della piastra neurale, in quelle cellule che sono in procinto di smettere di dividersi. Nel lato con sovraespressione di MEX3A si osserva in generale un territorio di espressione del marcatore più esteso e meno definito. In particolare più anteriormente si ha una parziale perdita della marcatura. Inoltre nel lato di controllo si osserva dorsalmente una striscia di cellule ben delineata a lato della piastra neurale; evidentemente sono cellule in uscita dal ciclo cellulare. Nel lato iniettato questa striscia appare meno densa. Questo fenotipo lo osserviamo nel 45% degli embrioni analizzati (n = 78) (Fig. 4.5, A e B).
XelrC marca i precursori neurali post-mitotici, cioè i primi neuroni che escono dal ciclo cellulare e iniziano a differenziare. Dunque coglie il momento successivo a quello colto da p27. Lo vediamo espresso nella neurula in tre file di cellule che originano da entrambi i lati della piastra neurale. Dalla fila più interna originano i motoneuroni, da quella intermedia gli interneuroni e da quella più esterna i neuroni sensoriali. XelrC lo ritroviamo anche in due regioni situate ai due lati anteriori del tubo neurale, esse costituiscono i placodi del trigemino. La sovraespressione di MEX3A comporta nel lato iniettato una riduzione della densità cellulare nelle tre file laterali che appaiono scompaginate. Si osserva inoltre la scomparsa o la consistente riduzione del placode del trigemino. Questo fenotipo è stato riscontrato con una frequenza del 40% negli embrioni osservati (n = 114) (Fig. 4.5, C e D).
Un altro marcatore molecolare utilizzato è Twist che marca le cellule delle creste neurali. Agli stadi osservati lo troviamo ai margini della piastra neurale, nelle specifiche regioni in cui sono presenti queste cellule. La sovraespressione di MEX3A comporta nel lato iniettato un territorio di espressione del marcatore che evidenzia la perdita della segregazione degli “streams” di creste neurali e talvolta un’espansione del dominio di espressione stesso. Questo fenotipo è stato osservato con una frequenza del 40% negli embrioni analizzati (n=80) (Fig. 4.5, E e F).
In ultima analisi abbiamo utilizzato una doppia marcatura con il gene Engrailed che marca le cellule del mesencefalo e il gene Krox20 che invece marca le cellule dei rombomeri 3 e 5. La loro espressione allo stadio di neurula è localizzata in tre regioni distinte che si espandono lateralmente a partire dalla linea mediana. La prima in
A B
C D
Fig. 4.5: Sovraespressione di MEX3A in embrioni di Xenopus a
stadio di neurula su lato sinistro. Il lato iniettato è indicato con “Inj.” e il lato di controllo con “Cont.” Osserviamo le regioni di espressione: di p27 con visione sia anteriore (A) che dorsale (B), di XelrC con visione dorsale (C e D) e di Twist con visione anteriore (E e F) Le linee tratteggiate mostrano un’espansione nel territorio di espressione di p27.
E F
Inj. Cont. Inj. Cont.
Inj. Cont. Inj. Cont.
Inj. Cont. Inj. Cont.
p27
Xe
lrc
T
wi
st
posizione più anteriore costituisce il mesencefalo, la seconda in posizione intermedia costituisce il rombomero 3 e la terza più posteriore costituisce il rombomero 5. Il lato con sovraespressione di MEX3A presenta queste tre regioni leggermente più espanse, in particolare la regione del mesencefalo presenta una marcatura meno intensa rispetto al lato di controllo. Le tre regioni sono però invariate nella loro regionalizzazione antero-posteriore, cioè mantengono le loro posizioni (Fig. 4.6). L’aumento di dimensione potrebbe essere associato all’espansione dell’espressione di Sox2 ed è stato osservato con una frequenza del 36% (n = 80).
Osserviamo adesso i risultati ottenuti per ZNF367 per il quale ho utilizzato gli stessi marcatori molecolari dello studio di MEX3A.
La sovraespressione di ZNF367 risulta comportare sul lato iniettato un aumento della regione di espressione di Sox2. Questo fenotipo ha una frequenza del 50% negli embrioni osservati (n = 80) (Fig. 4.7, A e B).
Il marcatore molecolare p27 nel lato iniettato risulta leggermente espanso rispetto al controllo, questo in accordo con l’aumento dell’espressione di Sox2. Inoltre con la sovraespressione si osserva un’interruzione in una striscia di cellule in uscita dal ciclo
Fig. 4.6: Sovraespressione di MEX3A in embrioni di Xenopus a stadio di
neurula. Il lato iniettato è il sinistro ed è indicato con “Inj.”, il lato di controllo è indicato con “Cont.” Osserviamo le regioni di espressione di E/K. Visione anteriore.
Cont.
Inj. Cont. Cont.
cellulare e laterale alla piastra neurale. Questa striscia appare compatta e continua nel lato di controllo. Tale fenotipo lo ritroviamo con una frequenza del 40% negli embrioni analizzati (n = 70) (Fig. 4.7, C e D).
Per quanto riguarda XelrC la sovraespressione sembra comportare nel lato iniettato una lieve espansione ed una minore densità nella regione occupata dalle tre linee cellulari in differenziamento. Questo fenotipo lo ritroviamo con una frequenza del 50% negli embrioni osservati (n = 68) (Fig. 4.7, E e F).
Il territorio di espressione di Twist, nel lato con sovraespressione di ZNF367, risulta leggermente alterato. Tale fenotipo ha una frequenza del 50% (n = 68) (Fig. 4.7, G e
H).
A B
C D
E F
G H
Fig. 4.7: Sovraespressione di ZNF367 in embrioni di
Xenopus a stadio di neurula. Il lato iniettato è il destro ed è indicato con “Inj.”, il lato di controllo è indicato con “Cont.” Osserviamo i territori di espressione di: Sox2 con visione anteriore (A) e dorsale (B), di p27 con visione dorsale (C e D), di XelrC con visione dorsale (E e F) e di Twist con visione dorsale (G e H). Le linee tratteggiate indicano un’espansione dei territori di Sox2 e p27. La freccia indica il punto di interruzione della linea di cellule in uscita dal ciclo cellulare nel lato manipolato.
Inj. Inj. Inj. Inj. Inj. Inj. Inj. Inj. Cont. Cont. Cont. Cont. Cont. Cont. Cont. Cont.
p27
Sox2
Xe
lrC
T
wi
st
Il territorio di espressione di Engrailed/Krox20 nel lato iniettato risulta leggermente allungato, specialmente le regione che identifica il rombomero 5, ma invariato nella sua regionalizzazione antero-posteriore. Questo fenotipo ha una frequenza del 40% (n = 60) (Fig. 4.8).
A stadio 16-18, in seguito a sovraespressione di MEX3A e di ZNF367, si è osservato un aumento del dominio di Sox2. Questa espansione potrebbe essere dovuta ad un aumento di espressione del marcatore stesso ma anche ad una mancata chiusura del tubo neurale nel lato iniettato rispetto a quello di controllo. Ho cercato dunque di definire questo aspetto valutando gli effetti della sovraespressione dei geni MEX3A e ZNF367 sul dominio di Sox2 in embrioni di Xenopus fissati a stadi più precoci rispetto a quelli finora analizzati. Ho scelto di fissarli fra stadio 13 e 14 quando la piastra neurale dell’embrione è ancora del tutto aperta. I fenotipi ottenuti e saggiati tramite ibridazioni in situ “whole mount” mostrano un aumento del territorio di Sox2 in seguito a sovraespressione sia di MEX3A che di ZNF367 (Fig. 4.9). Per MEX3A questa espansione è più evidente. Questi risultati potrebbero quindi confermare che la sovraespressione dei due geni non altera la chiusura del tubo neurale e probabilmente comporta un aumento dell’espressione di Sox2.
Fig. 4.8: Sovraespressione di ZNF367 in embrioni di Xenopus a stadio di
neurula. Il lato iniettato è il sinistro ed è indicato con “Inj.”, il lato di controllo è indicato con “Cont.” Osserviamo le regioni di espressione di E/K. Visione anteriore.
Inj. Cont. Inj. Cont.
4.3 Perdita di funzione di ZNF367 e MEX3A
Ho condotto un’analisi di perdita di funzione di ZNF367 e MEX3A andando a microiniettare i relativi morpholini dei due geni in un blastomero su due di embrioni di Xenopus laevis. Anche in questo caso, per selezionare soltanto gli embrioni manipolati, ho controllato la presenza e la localizzazione della GFP precedentemente co-iniettata con i morpholini. Gli embrioni manipolati sono stati fissati allo stadio di neurula (stadio 16-18) e per saggiare gli eventuali fenotipi ottenuti, sono stati sottoposti a ibridazione in situ “whole mount”, utilizzando marcatori molecolari usati
Cont. Cont. Cont. Cont. Inj. Inj. Inj. Inj.
M
EX
3A
ZNF36
7
Fig. 4.9: Sovraespressione di MEX3A (A e B) e di ZNF367 (C e D) in
embrioni di Xenopus a stadio di neurula precoce (stadio 14/15). Il lato iniettato è il destro ed è indicato con “Inj.”, il lato di controllo è indicato con “Cont.” Osserviamo le regioni di espressione di Sox2. Visione dorsale-anteriore.
A B
anche per la sovraespressione. Gli esperimenti sono stati replicati, ciascuno, almeno tre volte.
Per quanto riguarda l’analisi di MEX3A, ho utilizzato i marcatori molecolari: Sox2, p27 e XelrC. In tutti e tre i casi si osserva che la perdita di funzione del gene, indotta dal morpholino, non altera minimamente le regioni di espressione dei tre marcatori nel lato iniettato (Fig. 4.10). Gli stessi risultati sono stati ottenuti iniettando i due morpholini costruiti per MEX3A sia singolarmente che insieme.
L’analisi della perdita di funzione di ZNF367 è stata condotta con l’utilizzo degli stessi tre marcatori molecolari usati per MEX3A: Sox2, p27 e XelrC. Anche in questo caso osserviamo che l’iniezione dei due morpholini costruiti per ZNF367, singolarmente o insieme, comporta gli stessi risultati: non si ha alterazione dei territori di espressione dei tre marcatori (Fig. 4.11).
A B C
Fig. 4.10: Perdita di funzione di MEX3A in embrioni di Xenopus a stadio di
neurula tramite microiniezione di morpholino. Il lato iniettato è il sinistro ed è indicato con “Inj.” e il lato di controllo è indicato con“Cont.” Si osservano i marcatori: Sox2 (A), p27 (B) e XelrC (C). Di tutti e tre abbiamo una visione dorsale-anteriore.
Inj. Cont. Inj. Cont. Inj. Cont.
A B C
Fig. 4.11: Perdita di funzione di ZNF367 in embrioni di Xenopus a stadio di neurula tramite
microiniezione di morpholino. Il lato iniettato è il sinistro ed è indicato con “Inj.” e il lato di controllo è indicato con“Cont.” Si osservano i marcatori: Sox2 (A), p27 (B) e XelrC (C). Di tutti e tre abbiamo una visione dorsale-anteriore.
