INDICE
Riassunto
IVAbstract
VSezione 1: Introduzione
11.1: Caratteristiche generali dell’ambiente salmastro 1 1.2: Associazioni simbiotiche fra protozoi ciliati e procarioti 6
1.3: Scopo della tesi 9
1.4: Approccio sperimentale utilizzato 11
Sezione 2: Materiali e Metodi
16 2.1: Raccolta e conservazione dei campioni 16 2.2: Isolamento delle cellule e tentativi di coltura 17 2.3: Caratterizzazione morfologica degli organismi 20 2.4: Caratterizzazione molecolare degli organismi 30Sezione 3: Risultati dello screening
63 3.1: Specie di ciliati rinvenute nell’ambiente oggetto di studio 63Sezione 3-Capitolo I: Euplotes parawoodruffi e simbionti
65Parte Prima: Introduzione
65 I.1.1: Caratteristiche generali del gen. Euplotes 65Parte Seconda: Risultati dell’analisi
69I.2.1: Isolamento e messa in coltura di E. parawoodruffi 69 I.2.2: Caratterizzazione morfologica 69 I.2.3: Caratterizzazione molecolare 70 I.2.4: Individuazione e caratterizzazione del simbionte principale 71 I.2.5: Individuazione e caratterizzazione del simbionte secondario 77
Parte Terza: Discussione dei risultati ottenuti
84 I.3.1: Caratterizzazione morfologica e molecolare 84 I.3.2: Caratterizzazione del simbionte principale 88I
Sezione 3-Capitolo II: Frontonia salmastra e simbionti
91Parte Prima: Introduzione
91 II.1.1: Caratteristiche generali del gen. Frontonia 91Parte Seconda: Risultati dell’analisi
94II.2.1: Isolamento e messa in coltura di F.salmastra 94 II.2.2: Caratterizzazione morfologica 95 II.2.3: Caratterizzazione molecolare 96 II.2.4: Individuazione e caratterizzazione del simbionte principale 98 II.2.5: Individuazione e caratterizzazione del simbionte secondario 103
Parte Terza: Discussione dei risultati ottenuti
109II.3.1: Caratterizzazione morfologica e molecolare 109 II.3.2: Caratterizzazione del simbionte principale 110 II.3.3: Considerazioni sul simbionte secondario 115
Sezione 3-Capitolo III: Pseudomicrothorax dubius e simbionti
119Parte Prima: Introduzione
119III.1.1: Caratteristiche generali del gen. Pseudomicrothorax 119
Parte Seconda: Risultati dell’analisi
122III.2.1: Isolamento e messa in coltura di P. dubius 122 III.2.2: Caratterizzazione morfologica 123 III.2.3: Caratterizzazione molecolare 124 III.2.4: Indagine ultrastrutturale 124 III.2.5: Caratterizzazione del simbionte 125
Parte Terza: Discussione dei risultati ottenuti
133III.3.1: Considerazioni sull’allevamento di P. dubius 133 III.3.2: Caratterizzazione morfologica e molecolare 134 III.3.3: Caratterizzazione del simbionte 134
Sezione 3-Capitolo IV: Sonderia cfr. vorax e simbionti
142Parte Prima: Introduzione
142 IV.1.1: Caratteristiche generali dei ciliati plagiopilidi 142Parte Seconda: Risultati dell’analisi
146IV.2.1: Mantenimento di popolazioni di Sonderia cfr. vorax 146 IV.2.2: Caratterizzazione morfologica 149
II
IV.2.3: Caratterizzazione molecolare 150 IV.2.4: Indagine ultrastrutturale 151 IV.2.5: Individuazione e tentativi di caratterizzazione del simbionte
principale 152
Parte Terza: Discussione dei risultati ottenuti
160IV.3.1: Considerazioni sull’allevamento di Sonderia cfr. vorax 160 IV.3.2: Caratterizzazione morfologica e molecolare 161 IV.3.3: Considerazioni sui batteri ectosimbionti di Sonderia cfr. vorax 166
Sezione 4: Conclusioni e Prospettive Future
169 4.1: Considerazioni sui risultati ottenuti nel presente lavoro 169 4.2: Prospettive future e possibili sviluppi dei temi analizzati 173Sezione 5: Riferimenti Bibliografici
178Ringraziamenti
187Appendice Fotografica
188III
RIASSUNTO
Il presente lavoro ha come obiettivo l’identificazione e la caratterizzazione, da un punto di vista morfologico e molecolare, sia di protozoi ciliati mesopsammici presenti in uno specifico ambiente salmastro confinato che dei loro eventuali batteri simbionti. L’attenzione è stata focalizzata sui ciliati quantitativamente dominanti nell’ambiente e che, ad uno screening preliminare, risultavano associati a batteri ecto- od endosimbionti. La caratterizzazione di batteri simbionti obbligati e facoltativi, presenti in uno specifico ambiente, e la messa a punto di strumenti utilizzabili per un loro rapido riconoscimento qualitativo e quantitativo in campioni fissati rappresenta un punto di partenza indispensabile per possibili studi futuri di tipo ecologico volti a determinare la variabilità spaziale e temporale delle associazioni simbiotiche all’interno della comunità oggetto di studio.
Sono stati effettuati tentativi di coltivabilità su ciascuna specie di ciliati presa in esame, ed in caso di esito positivo sono state allestite colture monoclonali. La caratterizzazione morfologica è stata effettuata mediante osservazioni in vivo (binoculare, D.I.C.) e colorazioni cellulari specifiche (colorazione nucleare di Feulgen, impregnazione argentica). Per un’osservazione più fine sono stati realizzati preparati per la microscopia a scansione (S.E.M.). La microscopia a trasmissione (T.E.M.) ha consentito una descrizione ultrastrutturale dei batteri simbionti. I marcatori molecolari utilizzati per la caratterizzazione degli organismi sono stati il 18S rDNA per i ciliati ospiti ed il 16S rDNA per i batteri simbionti. I geni sono stati caratterizzati tramite PCR e sequenziamento diretto (ove possibile) o PCR, clonaggio e sequenziamento di alcuni cloni rappresentativi. Sulla base delle sequenze del 16S rRNA desunte, sono state disegnate e fatte sintetizzare specifiche sonde oligonucleotidiche marcate con fluorocromi al fine di poter associare con certezza, in esperimenti di ibridazione in situ, una determinata sequenza di 16S rRNA ad uno specifico batterio simbionte.
Sei tipi di batteri simbionti sono stati ritrovati in quattro diversi ciliati: Euplotes parawoodruffi (Spirotrichea, Hypotrichia), che contiene due diversi simbionti batterici, Frontonia salmastra (Oligohymenophorea, Peniculia), anch’esso contenente due simbionti, Sonderia cfr. vorax (Plagiopylea, Plagiopylida), Pseudomicrothorax dubius (Nassophorea, Microthoracida). Sono state messe a punto specifiche tecniche per il mantenimento di colture monoclonali di F.
salmastra e di popolazioni di Sonderia cfr. vorax e P. dubius. I quattro organismi sono stati caratterizzati morfologicamente e molecolarmente. La scarsità di letteratura e l’ambiguità di interpretazione di alcune caratteristiche morfologiche non ha consentito di poter giungere in tutti i casi alla determinazione della specie. Sono state ottenute le sequenze del 16S rDNA del simbionte principale di E. parawoodruffi, un β-proteobatterio vicino al gen. Polynucleobacter, del simbionte di F. salmastra., un α-proteobatterio vicino al gen. Holospora, e del simbionte di P. dubius., un α-proteobatterio vicino al gen. Rickettsia; tali risultati sono stati confermati da esperimenti di ibridazione in situ utilizzando sonde genere-specifiche. La caratterizzazione dei simbionti di Sonderia cfr. vorax e del simbionte secondario di E. parawoodruffi, appartenenti alla cl. Gammaproteobacteria, è tuttora in corso.
IV
ABSTRACT
The aim of this work is the identification of symbiotic associations between interstitial ciliate protozoa living in a brackish coastal environment and prokaryotic symbionts. The characterization, from molecular and morphological point of view, of both ciliate hosts and symbionts was performed as well. The attention was focused on quantitatively dominant ciliate species showing associations with ecto- or endosymbiotic bacteria. The characterization of obligate or facultative symbionts provided specific molecular tools that allow the rapid identification, both quantitative and qualitative, of the bacteria in natural ciliate populations.
Using these tools, it will be possible to realize, for the future, ecological studies, in order to clarify temporal and spatial variability of this kind of associations into the selected ciliate assemblage.
Cultivability tests were applied on each ciliate species analysed in this work, and in some cases monoclonal strains were obtained. Morphological characterization was performed by in vivo observations (binocular, D.I.C.) and specific cytological stains (Feulgen staining, silver impregnation). Samples for S.E.M. microscopy were realized in order to obtain more fine observations. T.E.M. microscopy allowed the description of the ultrastructure of symbiotic bacteria. 18S rDNA (for eukaryotes) and 16S rDNA (for prokaryotes) are the molecular markers utilized in this work for the characterization of both hosts and bacterial symbionts. Genes were characterized by PCR and direct sequencing whenever it was possible; otherwise, the characterization was obtained by amplification, cloning procedures and sequencing of some representative clones. Specific fluorescent-labelled oligonucleotide probes were designed and synthesized on the basis of characterized sequences. These probes were used in FISH experiments, in order to combine each sequence of 16S rDNA with a specific symbiotic bacterium.
Six kinds of symbiotic bacteria were found in four different ciliates: Euplotes parawoodruffi (Spirotrichea, Hypotrichia), that harbours two different symbiotic bacteria, Frontonia salmastra (Oligohymenophorea, Peniculia), that also harbours two symbionts, Sonderia cfr. vorax (Plagiopylea, Plagiopylida), Pseudomicrothorax dubius (Nassophorea, Microthoracida). Specific cultivation techniques were performed in order to maintain monoclonal strains of F. salmastra and populations of Sonderia cfr. vorax and P. dubius. All the four species were characterized from both molecular and morphological point of view. Due to the scarcity of literature data and to the difficulty to have unambiguous interpretations of some morphological features, it was not possible to identify all the analysed species in an accurate way. 16S rDNA sequences were obtained for the primary symbiont of E. parawoodruffi, a betaproteobacterium close to Polynucleobacter genus, for that of F. salmastra, an alphaproteobacterium close to the Holospora genus, and for the symbiont of P. dubius, another alphaproteobacterium close to the genus Rickettsia. In situ hybridisation experiments using genus-specific probes confirmed these results. Characterization of Sonderia cfr. vorax’s symbiont and E. parawoodruffi’s secondary symbiont, both belonging to the class Gammaproteobacteria, is still ongoing.
