Siamo tutti diversi

(1)

1

Siamo tutti diversi

• In media due persone

differiscono in 1 ogni 1000 coppie di basi

(2)

Polimorfismo

Differenza genetica

relativamente comune in una popolazione

(3)

Nota:

Una persona puo’ avere solo 1 o 2 alleli di un

particolare gene.

In una popolazione, ci

possono essere molti alleli diversi di un particolare

gene

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Qualche tipo di polimorfismo

• Alleli

• RFLP- restriction fragment length p…

• SNP- single nucleotide p…

• Tandem repeat p…

(5)

RFLPs

Polimorfismi che alterano la lunghezza dei frammenti di restrizione

restriction fragment length polymorphisms

Risultano da:

• cambiamenti (e.g. SNPs) che introducono o alterano un sito di restrizione

• differenze nel numero di copie di un Tandem Repeats (TRPs)

(6)

H&J Fig. 4.19

(7)

H&J Fig. 4.20

(8)

(9)

Come trovare differenze in due campioni di DNA…

• Sequenziare i due campioni

– Poco pratico

– Necessita’ di grosse quantita’ di DNA

• Cariotipo

– Rivela solo grossi cambiamenti

• Delezioni molto grandi, trisomie, etc.

• Cercare RFLPs o TRPs usando dei marker

– Miglior metodo attualmente disponibile

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10

Gel Elettroforesi

• L’elettroforesi separa il DNA in base alle dimensioni

• DNA migra verso il polo positivo

• Le molecole piu’ grandi si muovono piu’

lentamente

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12

Visualizzare il DNA

• DNA si visualizza con molecole che lo legano (bromuro d’etidio)

• Metodi usati per visualizzare piccole quantita’ di DNA specifico:

– Southern blot

– Polymerase chain reaction (PCR)

(13)

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(14)

14

Southern Blot - I

• DNA tagliato con enzimi di restrizione

• DNA separato con elettroforesi

• DNA trasferito su filtro e denaturato

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15

Southern Blot - II

• Il filtro e’ mescolato con una sonda radioattiva (a singolo filamento)

complementare alla sequenza da rivelare

• ibridazione = si formano legami idrogeno fra basi complementari

• DNA ibridato con la sonda e’ rivelato con una lastra fotografica

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Un plasmide 5 kb, 2 siti EcoRI

* * * *

E E

probe

plasmid

Cut with EcoRI --> gel --> blot

Stained

gel X-ray

film

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GAATTC CTTAAG GAATTC

CTTAAG

cromosoma

Cut with EcoRI restriction enzyme Gel--> blot

GAATTC CTTAAG

sonda

* * * *

3 kb 2 kb

X-ray film

campione di DNA

Altre ~ 750,000 bande non si vedono perche’

non ibridizzano con la sonda

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H&J Fig. 6.27

Read H&J section 6.6 & 6.7

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19

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Usa primer (oligonucleotidi) che

fiancheggiano la regione di interesse

• Cicli ripetuti di polimerizzazione risultano in una amplificazione esponenziale della regione di interesse

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20

Risultato…

del Southern blot o della PCR

– Rivelazione di una o poche bande in un background di molte migliaia di bande

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Campione di DNA

Reazione di PCR

Elettroforesi

(22)

H&J Fig. 4.21

(23)

Figlio Madre Padre x Padre y

(24)

Crime scene Sample:

Victim + perp

Victim AJ OJ DJ

Suspects

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Due reazioni di PCR

Per due zone diverse sul DNA

L’individuo donatore di

questo DNA e’ eterozigote

per tutti e due i siti di DNA

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Primers 1 Primers 2

(27)

Cercare un legame tra un polimorfismo ed una malattia

• Analizzare ogni membro della

famiglia per un polimorfismo ed il fenotipo della malattia

• Trovare un polimorfismo che si

associa sempre con il fenotipo della malattia

(28)

Marker

Gene della Fibrosi Cistica

Chrm 1

Chrm 7

cM 50 {

Marker strettamente collegato

Marker collegato Marker non

collegati

Una piccola (200-1000 bp) regione di

DNA di un particolare cromosoma

(29)

(30)

H&J Fig. 4.24 plus autosomal dominant disease

Supports linkage of disease to marker

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H&J Fig. 4.24 plus autosomal dominant disease

Does not support linkage of disease to marker

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