INDICE
RIASSUNTO pag. 1
ABSTRACT pag. 4
1. INTRODUZIONE pag. 7
1.1 Sistema modello: la planaria Dugesia japonica
pag. 7
1.2 Cellule staminali adulte e rigenerazionepag.
91.3 Neoblasti e raggi X
pag. 13
1.4 Eterogeneità dei neoblasti: suddivisione in sottopopolazioni
pag. 13
1.5 Analisi del profilo genetico dei neoblastipag. 16
1.6 Proteine associate al retinoblastoma: RbAp48pag. 17
1.6.1 RbAp48 e Ras
pag. 19
1.6.2 RbAp48 e le cellule staminali
pag. 19
2. SCOPO DELLA TESI pag. 21
3. MATERIALI E METODI pag. 22
3.1 Animali
pag. 22
3.2 Isolamento di DjRbAp48
pag. 22
3.3 Clonaggio dei prodotti di amplificazione in plasmide e
screening delle colonie
pag. 23
3.4 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante
lisi alcalina (mini-prep)
pag. 25
3.5 Estrazione di DNA plasmidico su media scala (midi-prep)
pag. 26
3.6 Digestione di DNA con enzimi di restrizionepag. 26
3.7 Estrazione di RNA totale e produzione di cDNApag. 26
3.8 Esperimenti di RNA interference
pag. 27
3.9 Protocollo per iniezione dsDjRbAp48
pag. 28
3.10 Produzione di sonde a RNA
pag. 30
3.10.1 “Template” per i geni DjMCM2, DjSyt, DjPiwi-1,
DjAHNAK, Djinx e Djnos pag. 30
3.10.2 “Template” per il gene DjRbAp48
pag. 30
3.10.3 Produzione di sonde
pag. 31
3.11 Ibridazione in situ whole-mount
pag. 32
3.12 Trattamento con colchicina
pag. 34
3.13 Conta delle mitosi
pag. 34
3.14 Inclusione in paraffina ed immunoistochimica
pag. 35
3.15 Microscopio elettronico a trasmissionepag. 37
3.16 Rivelazione di cellule marcate con BrdUpag. 37
4. RISULTATI pag. 40
4.1 Isolamento di DjRbAp48
pag. 40
4.2 Studio di espressione
pag. 44
4.2.1 Analisi dell’espressione di DjRbAp48 su animali intatti
pag. 44
4.2.2 Analisi dell’espressione di DjRbAp48 su animaliin rigenerazione
pag. 45
4.3 Studio di funzione
pag. 47
4.3.1 Ruolo di DjRbAp48 in planarie in rigenerazione
