2 - Materiali e Metodi

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2 - Materiali e Metodi

2.1 - Campioni di DNA

I campioni di DNA, su cui abbiamo condotto il nostro studio provengono da due differenti centri francesi: Lione e Nantes. I DNA che abbiamo genotipizzato appartengono a 55 pazienti, ai diversi stadi della malattia, trattati con un unico protocollo terapeutico. Il protocollo terapeutico utilizzato prevedeva la somministrazione di tre cicli VAD separati da intervalli di 4 settimane:

I primi due cicli, VAD 1 e VAD 2, vengono effettuati secondo il seguente schema:

Somministrazione

Dose

Vincristina

Endovenosa

dal giorno 1 al giorno 4

0,4

mg/giorno

Adriblastina

Endovenosa

9

mg/m2/giorno

Desametasone

Via orale:

- dal giorno 1 al giorno 4 - dal giorno 9 al giorno 12 - dal giorno 17 al giorno 20

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Il terzo ciclo, VAD 3, diverge dai precedenti per quanto riguarda la posologia del desametasone:

Somministrazione

Dose

V

incristina

Endovenosa

0,4

mg/giorno

Adriblastina

Endovenosa

9

mg/m2/giorno

Desametasone

Per via orale

40 mg/giorno

Successivamente si procede alla raccolta delle cellule staminali periferiche (CSP) in seguito alla somministrazione dei loro fattori di crescita, seguita in alcuni casi dalla somministrazione di ciclofosfamide (Endoxan) con una posologia inferiore o uguale a 4 g/m2 . Il periodo di arruolamento nello studio va dal 2001 al 2002 e il follow up dei pazienti è di circa 5 anni.

2.2 - Scelta degli SNPs

Sono stati scelti 121 polimorfismi a singolo nucleotide in 61 geni della riparazione del DNA e del ciclo cellulare e 93 polimorfismi in circa 31 geni coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici di fase I e di fase II.

La liste complete dei geni indagati sono le seguenti :

Geni del metabolismo di fase I:

ADH1B – ADH2: alcol deidrogenasi 2 3’UTR A>G

Ser60Thr Arg48His

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ADH1C – ADH3: alcol deidrogenasi 3 Ile349Val

AHR: recettore per gli idrocarburi arilici

Arg554Lys

CYP1A1: citocromo P450 1A1

T3801C Ile462Val Thr461Asn G3229A T606G C728T

CYP1A2 : citocromo P450 1A2

G3858A T740G A164C Asn516Asn CYP1B1 : citocromo P450 1B1 Arg48Gly C13T Ala119Ser Val432Leu Asp449Asp Asn453Ser

CYP2A6 : citocromo P450 2A6

Leu160His T48G

CYP2D6 : citocromo P450 2A6 V11M P34S L91M T98T 1846 G>A V136V R296C

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S486T CYP2C9 : citocromo P450 2C9 Arg430Cys Ile359Leu CYP2C18 : citocromo P450 2C18 Thr385Met CYP2C19 : citocromo P450 2C19 G681A

CYP2E1 : citocromo P450 2E1

C893G G1293C C1053T T7632A T333A G71T

CYP3A4: citocromo P450 3A4

G20230A

EPHX1: epossido idrolasi microsomale 1

T17540C Tyr113His His139Arg C114G

Geni del metabolismo di fase II:

ABCG2: trasportatore di membrana G2

Gln141Lys Val12Met

ALDH2: aldeide deidrogenasi 2

A355G T348C T483C G69A

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COMT: catecol-O-metil trasferasi

Val158Met Leu136Leu His62His G98A

GSTA2: glutatione S-trasferasi A2

Ser111Thr

GSTA4: glutatione S-trasferasi A4

Gln117Gln C668T GSTM1: glutatione S-trasferasi M1 A/B e nullo GSTM3: glutatione S-trasferasi M3 Val224Ile G30T 3bpdel GSTP1: glutatione S-trasferasi P1 Ile105Val Ala114Val A/B and null

GSTT2: glutatione S-trasferasi T2

Met139Ile 3’UTR G>T

MDR1 – ABCB1: trasportatore di membrana B1 T3435C

Gly411Gly Ser892Ala

MnSOD2: superossido desmutasi 2

Val16Ala

NAT1: N-acetil trasferasi 1

C344T A40T

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Thr153Thr Val149Ile Arg187Stop Arg187Gln T1088A C1095A

NAT2: N-acetil trasferasi 2

C282T Ile114Thr Arg197Gln Leu268Arg Gly286Glu Leu161Leu

NQO1 – DIA4 : NAD(P)H ossido reduttasi 1 Pro187Ser

Arg139Trp

SULT1A1: S-trasferasi 1A1

Arg213His Met223Val

SULT1A2: S-trasferasi 1A2 N235T

3’ UTR T>C

UGT1A7: UDP-glucoronil trasferasi 1A7

Asn129Lys Trp208Arg

Geni della riparazione del DNA e del Ciclo Cellulare:

XRCC1: X-ray repair complementing detective

repair in Chinese hamster cells 1

repair in Chinese hamster cells 2.

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CDA Cytidine Deaminase

ERCC1: Excision repair cross-complementing

rodent repair deficiency,

complementation group 1.

XPD/ERCC2: Xeroderma pigmentosum, complementation group D/ Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation

group 2.

XPF/ERCC4: Xeroderma pigmentosum, complementation group F/ Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation

group 4.

XPG/ERCC5: Xeroderma pigmentosum, complementation group G/ Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group5.

NT5E 5' nucleotidase

XPA: Xeroderma pigmentosum, complementation

group A.

XPC: Xeroderma pigmentosum, complementation

group C.

LIG1: DNA ATP-dependent Ligase I.

LIG3: DNA ATP-dependent Ligase 3.

LIG4: DNA ATP-dependent Ligase 4.

POLB: DNA polymerase beta.

APEX/APE1: DNA polymerase beta.

PCNA: Proliferating cell nuclear antigen.

OGG1: 8-oxoguanine DNA glycosylase

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Angiotensinogen proteinase inhibitor.

GADD45A: Growth arrest and DNA-damage-inducible,

alpha.

MLH1: MutL homolog 1 (E. Coli).

MSH2: MutL homolog 2 (E. Coli).

MYH: MutY homolog (E. Coli).

PMS2: DNA mismatch repair gene homologue.

RAD9: RAD9 homolog A (S. pombe).

RAD 23: RAD23 homolog A (S. pombe).

RAD51: RAD51 homolog (Rec A homolog E. Coli)

RAD52: RAD52 homolog (S. cerevisiae).

RAD54B: RAD54 homolog B (S. cerevisiae).

NBS1: Nijmegen breakage syndrome 1.

RECQL: Rec Q protein-like (DNA helicase Q1-like).

BARD1: BRCA1 associated ring domain 1.

BRCA1: Breast cancer 1.

BRCA2: Breast cancer 2.

PARP/ADPRT: Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 1.

TPMT: Thiopurine S-methyltransferase

MTHFR: 5,10 methilenetetrahydrofolate reductase

TERT Telomerase Reverse Transcriptase

TERC Telomerase RNA Component

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Geni implicati nel controllo del ciclo cellulare e apoptosi:

TP53: Tumor protein p53.

CDKN1A/P21 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A.

CDKN2A/P16: Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A.

CDKN1B: Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B.

CDKN2B: Cyclin-dependent kinase inhibitor 2B.

CCND1: Cyclin D1.

CDK7: Cyclin-dependent-kinase 7.

CHEK2: CHK2 checkpoint homolog (S. pombe).

MDM2: Murine double minute 2.

ATM: Ataxia telangiectasia mutated.

CASP-3: Caspase 3. CASP-8: Caspase 8. CASP-9: Caspase 9. CASP-10: Caspase 10. RB1: Retinoblastoma 1.

ATR: Ataxia telangiectasia and Rad 3 related.

NOD2/CARD15: Caspase recruitment domain family, member 15.

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2.3 - Amplificazione con PCR

L’amplificazione dei frammenti di DNA di nostro interesse è avvenuta attraverso multiplex-PCR (Polymerase Chain Reaction) che prevede l’utilizzo di diverse coppie di primers nella stessa miscela di reazione (massimo quattro coppie) per minimizzare il numero totale di reazioni. L’amplificazione serve per ottenere un quantitativo di DNA necessario alla successiva genotipizzazione. A questo scopo sono stati progettati e utilizzati primers specifici per amplificare le regioni di DNA relative ai geni di interesse.

Il protocollo di amplificazione tramite multiplex-PCR prevede: 2 µl di Taq buffer 10X, 2.4 µl di tampone contenente MgCl2 (25 mM per

una concentrazione finale di 1.5µM), 2µl di dNTPs (2mM), 1 µl di primers (forward e reverse di 1, 2, 3 o 4 coppie a seconda della reazione) (10µM per una concentrazione finale di 0.5µM), 0.2 µl di enzima Hotfire® Taq polimerasi, 1µl (20ng) di DNA da amplificare e H2O per un volume finale di 20µl.

Per quanto riguardano i dNTPs, viene utilizzata una miscela composta da dATP, dCTP, dGTP 200 µM ciascuno, da dTTP 150 µM e si aggiunge anche dUTP a 50 µM: con questa miscela si sintetizzano frammenti di PCR in cui il 25% delle Timine è sostituito (casualmente) con degli uracili. Questo si rende necessario al fine di permettere nelle fasi successive una frammentazione dei prodotti di PCR. Infatti, i prodotti di PCR sono normalmente troppo lunghi e avrebbero un ingombro sterico che renderebbe difficile l’ibridazione con le sonde ancorate sul vetrino (o “chip”). La riduzione dei prodotti di PCR in frammenti di piccole dimensioni riduce l’ingombro sterico e rende più facile l’appaiamento tra le sonde e i frammenti contenenti i polimorfismi amplificati.

I parametri dei cicli di amplificazione sono i seguenti: denaturazione iniziale a 94˚C per 10 minuti, 20 cicli “touchdown” a 94˚C per 30

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cicli a 94°C per 30 secondi, 51°C per 30 secondi, 72°C per 30 secondi ed elongazione finale a 72°C per 10 minuti.

Per saggiare l’avvenuta reazione di amplificazione si esegue un’ elettroforesi su gel di agarosio al 2%. Vengono campionati un paio di pozzetti della placca da 96 e da questi sono estratti un piccolo quantitativo di amplificato che viene fatto correre sul gel. In caso affermativo si possono osservare bande fluorescenti: il numero di bande è specifico al numero di SNPs amplificati (singulex, duplex, triplex, quadruplex).

2.4 - Purificazione post-PCR

I prodotti delle varie PCR vengono inizialmente recuperati e messi insieme in un'unica provetta; dopodichè sono sottoposti a purificazione mediante l’utilizzo di filtri Microcon® Millipore Y 30 e frammentati utilizzando uracil N-glicosilasi (UNG; Epicentre Technologies, Madison, WI, USA) che riconosce gli Uracili incorporati e produce un sito abasico, idrolizzando il legame N-glucosidico dell’Uracile con la catena del DNA. Successivamente, previo trattamento ad alta temperatura, il sito abasico sara’ il sito di rottura a singolo filamento dell’elica del DNA e ciò causera’ la frammentazione del DNA stesso.

Il trattamento con UNG e’ abbinato anche a quello con la fosfatasi alcalina di gamberetto (sAP; Amersham Biosciences, Milwaukee, WI, USA), a cui aggiungiamo anche lo specifico tampone (UNG dilution buffer 10x). La sAP permette la rimozione dei gruppi trifosfato da eventuali residui di dNTP presenti nella miscela di reazione delle PCR. Infatti la APEX e’ una reazione di sequenziamento analoga a quella di Sanger e l’eventuale presenza di dNTP puo’ nuocere alla reazione, poiché, questi ultimi, sono molto piu’ affini alla DNA polimerasi di quanto non siano i ddNTP (terminatori della reazione di sequenziamento). Occorre eliminare ogni traccia di dNTP prima di effettuare la APEX.

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La miscela sAP+UNG viene lasciata in incubazione per 1 ora e mezzo a 37°C e per 30 minuti a 95°C, temperatura a cui sAP e UNG sono inattivate.

Passato questo tempo si pone il tutto in ghiaccio cosicchè il DNA frammentato resti in forma denaturata ed aperta, in modo da appaiarasi più facilmente con gli oligonucleotidi del chip.

2.5 - Preparazione dei Micro-Array

I vetrini SAL-type su cui avviene la reazione dell’ Apex sono acquistati dalla Asper Biotech Ltd. (Tartu, Estonia, www.asperbio.com).

Questi vengono preparati mediante silanizzazione e modificati con dei “5’–aminolinker” prodotti dalla Sigma Genosys (Sigma-Genosys Ltd, Cambridge, UK), costituiti da 12 idrocarburi (C12) e terminanti con un gruppo amminico, che permette il legame covalente degli oligonucleotidi, complementari alle sequenze adiacenti ai polimorfismi dei geni presi in analisi, sul vetrino stesso. La sequenza completa degli oligonucleotidi utilizzati nell’APEX è disponibile sul web (http://www-gan.iarc.fr/MetaboChip.html).

2.6 - APEX

Nove µl dei prodotti di PCR purificati vengono mescolati con 1µl di ciascun terminatore della reazione di Sanger (ddATP coniugato con Cy3, ddGTP coniugato con Cy5, ddCTP coniugato con Rox e ddUTP coniugato con Fluoresceina), 4 µl di tampone di reazione 10x e 0.125 µl di enzima Thermosequenasi (Amersham Biosciences) diluito nello specifico tampone (per un volume finale 1 µl). Si ottiene così un volume finale di 18 µl che deve essere posto sopra il vetrino. La deposizione va eseguita il più velocemente

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possibile a causa della sensibilità dell’enzima alle variazioni di temperatura.

Il vetrino deve essere precedentemente lavato con soluzione di NaOH 100 mM per essere pulito da eventuale polvere o altra sostanza depositatasi durante la fase di produzione, trasporto o conservazione. Il chip viene poi risciacquato in acqua a 95°C per lavare la soluzione di NaOH che rimane presente sopra il vetro. A questo punto il vetrino rimane ad incubare a 58°C per 15 minuti con la miscela di reazione.

Terminato il tempo di incubazione il chip viene lavato con acqua a 95°C per eliminare gli eccessi del mix di reazione che non ha ibridato con gli oligo ma è rimasto sopra il vetrino. Viene aggiunta una soluzione “Antifade” (Slowfade® Light Antifade Reagent ; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) per poter leggere l’emissione della Fluoresceina.

Il chip viene infine coperto con un vetrino copri oggetto ed è ora pronto per la scansione che avviene mediante uno scanner a quattro raggi laser Genorama TM-003 (Asper Biotech, Tartu, Estonia). Successivamente l’acquisizione delle immagini viene eseguita con i programmi che fanno parte di Genorama Image Analysis Software (Asper Biotech, Tartu, Estonia).

Le quattro immagini corrispondenti a ciascun fluorocromo (e quindi a ciascun terminatore) vengono analizzate dal software con l’assistenza di un operatore. Viene misurata l’intensità della fluorescenza emessa per ogni posizione. I chip sono stampati in maniera che ciascuna sonda abbia una sua posizione specifica. La lettura della fluorescenza per una determinata posizione fornisce la variazione genetica dello SNP sotto studio.

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Figura 2.1 - rappresentazione schematica della tecnica “Apex”

- (A) L’estremità 5’ dell’oligonucleotide C12 amminolinker è ancorata al vetrino. (B) I prodotti di PCR frammentati si ibridano. (C) La reazione di estensione inserisce un ddNTP complementare al DNA del soggetto, marcato con un fluorocromo. (D) Il ddNTP incorporato (che corrisponde allo SNP del soggetto) viene legato covalentemente e non viene lavato via. A questo punto il vetrino è pronto per la scansione.

2.7 - Analisi Statistica

Le analisi statistiche delle associazioni tra genotipi e FFP (Freedom From Progression - intervallo libero dalla progressione: tempo che intercorre tra l’ottenimento della RC e la comparsa della recidiva) e con la OS (Overall Survival - sopravvivenza totale: intervallo di tempo trascorso fra la diagnosi o ottenimento RC e il decesso del paziente), sono state effettuate presso l’International Agency for Research on Cancer (IARC) di Lione dove sono depositati i dati

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relativi a ciascun paziente. Sono state analizzate le curve di sopravvivenza, dette anche curve di Kaplan - Meier.

Attraverso il metodo non parametrico di Kaplan - Meier possiamo descrivere le caratteristiche del processo in esame, come il follow-up dei pazienti, tenendo conto dei tempi di sopravvivenza troncati (censored) in intervalli di tempo, che terminano con la comparsa della recidiva o la morte del paziente dopo la RC.

Per verificare l’uguaglianza o meno delle curve di sopravvivenza relative a diverse categorie, come ad esempio due gruppi di pazienti caratterizzati dall’avere due diverse forme di uno SNP, viene utilizzato una analisi non parametrica conosciuta come Log - Rank test. Il Log - Rank test accentua le differenze nelle funzioni di sopravvivenza alla fine del processo in esame. L’ipotesi nulla H0

è che le funzioni di sopravvivenza ( dove per sopravvivenza intendiamo,la sopravvivenza ai fattori di rischio da noi considerati,come la comparsa della recidiva o la morte) siano uguali per tutte le categorie dello stesso gruppo ovvero che non vi siano differenze di sopravvivenza tra i gruppi considerati. Le curve di Kaplan - Meier si ottengono mettendo a confronto il tempo (suddiviso in intervalli precisi) e la Cumulative Proportion Surviving per i due gruppi presi in considerazione. La Cumulative Proportion Surviving non è altro che la proporzione dei casi sopravvissuti rispetto all’intervallo considerato. Le probabilità di sopravvivenza si suppongono come indipendenti attraverso gli intervalli di tempo, e vengono calcolate moltiplicando le probabilità di sopravvivenza con tutti gli intervalli precedenti.

Le curve di Kaplan - Meier sono tanto più significative, per dimostrare la correlazione di un particolare SNP con la FFP o con OS, quanto più piccolo è il valore di “p” nel Log - Rank test. I singoli valori statistici significativi, per ogni singolo SNP, possono essere analizzati utilizzando le stesse condizioni in un sistema multivariato, per valutare come i singoli valori di p si possono influenzare statisticamente tra loro. Dato che il numero di soggetti analizzati non era particolarmente elevato i confronti sono stati fatti

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tutti secondo un modello dominante: portatori vs omozigoti dell’allele piu’ comune.

La determinazione degli aplotipi è stata effetuata esaminando quei geni che presentano un’alta copertura di SNPs. I dati grezzi in nostro possesso sono stati rielaborati utilizzando il software “Phase”.