Preparazione e caratterizzazione di miscele di polimeri naturali e sintetici per applicazioni come materiali biocompatibili e/o a basso impatto ambientale

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UNIVERSITÀ DI PISA

Dipartimento di Ingegneria Chimica, Chimica Industriale e Scienze dei Materiali

Dottorato di ricerca in Ingegnera Chimica e dei Materiali

Anno 2003 - Ciclo XVIII

ING-IND/34

Preparazione e caratterizzazione di miscele di

polimeri naturali e sintetici per applicazioni

come materiali biocompatibili e/o a basso

impatto ambientale

Relatori:

Prof. Giusti Paolo

Prof. Lazzeri Luigi

Prof. Ciardelli Gianluca

Dr. Pracella Mariano

Dottorando:

Chiono Valeria

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ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

2-D = bidimensionale 3-D = tridimensionale 3DP = 3D printing A = amido

An = valore logaritmico dell’assorbanza ABS = acrilonitrile-butadiene-stirene AFM = microscopia a forza atomica AP = amido elasticizzato con PEG C = modalità in contatto

C27 = copolimero PCL-POE-PCL le cui caratteristiche sono descritte nel Capitolo 2 CAMs = molecole di adesione cellulare

CDM = 1,4-cicloesandimetanolo CH = chitosano

CL = caprolattone

CS = chitosano salificato con solfato sodico D = destrano

DD = grado di deacetilazione

DHT = trattamento deidrotermico (trattamento termico condotto sotto vuoto) DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

DMSO = dimetilsolfossido DR = rapporto di stiro

DSC = calorimetria differenziale a scansione ECM = matrice extra-cellulare

EDTA = acido etilendiamminicotetracetico FDM = fused deposition modeling

FTIR = spettroscopia all’infrarosso secondo la trasformata di Fourier ATR = modalità in riflessione totale attenuata

G = gelatina

GAGs = glicosamminoglicani

GDNF = fattore di crescita derivato dalla linea cellulare gliale GL = gellano

GP = genipina

GPC = cromatografia a permeazione di gel HDI = esametilendiisocianato

HDPE = polietilene ad alta densità HV = idrossivalerato

IKAV = sequenza peptidica di isoleucina – lisina – alanina - valina LDI = diisocianalto a base di L-lisina

LDPE = polietilene a bassa densità LOM = laminated object manufacturing

Mη = peso molecolare medio viscosimetrico

MA = anidride maleica

Mn= peso molecolare medio numerale

Mw= peso molecolare medio ponderale NC = modalità non in contatto NGF = fattore di crescita nervoso O/W = emulsione olio in acqua OD = diametro esterno PAA = acido poliacrilico

PAM = pressure assisted microsyringe PAN = poliacrilonitrile

PBS = poli(butilensuccinato) PBS = tampone fosfato PC = policarbonato PCL = policaprolattone

PCL-g-MA = PCL aggraffato con MA

PCL-PEG-PCL = copolimero a tre blocchi a base di PCL e PEG PCL-POE-PCL = copolimero a tre blocchi a base di PCL e POE

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PDLA = acido poli-D,L-lattico PE = polietilene

PEG = polietilenglicole PEO = polietilenossido PET = polietilentereftalato PGA = acido poliglicolico PHA = poli(idrossialcanoati) PHB = poli(idrossibutirrato)

PHBHV = poli(idrossibutirrato-co-idrossivalerato) Phe diestere =1,4-di(L-fenilalanil-ossimetilen)-cicloesano PHEMA = poli(2-idrossietilmetacrilato)

PLA = acido polilattico

PLGA = copolimero poli(acido lattico –co- acido glicolico) PLLA = acido poli-L-lattico

PMMA = polimetilmetacrilato POE = poliossietilene

POM = microscopia ottica a luce polarizzata PP = polipropilene

PS = polistirene

PTFE = politetrafluoroetilene PU = classe dei poliuretani

PU1 = poliuretano a base di PCL, HDI e CDM

PU4 = poliuretano a base di PCL, LDI e CDM a basso peso molecolare PU4-H = poliuretano a base di PCL, LDI e CDM ad alto peso molecolare

PU5 = poliuretano a base di PCL-PEG-PCL (PCL/PEG 50/50 mol/mol), LDI e CDM PU6 = poliuretano a base di PCL-PEG-PCL (PCL/PEG 65/35 mol/mol), LDI e CDM PUU = classe dei poliuretani-uree

PUU4 = poliuretani-uree a base di PCL, LDI e Phe diestere

PUU5 = poliuretani-uree a base di PCL-PEG-PCL (PCL/PEG 50/50 mol/mol), LDI e Phe diestere PUU6 = poliuretani-uree a base di PCL-PEG-PCL (PCL/PEG 65/35), LDI e Phe diestere

PVA = polivinilalcool PVC = polivinilcloruro PVP = polivinilpirrolidone

Q = portata della pompa volumetrica per la filatura da soluzione RGD = L-arginina, L-glicina, acido L-aspartico

RGDS = L-arginina, L-glicina, acido L-aspartico, L-serina RP = prototipazione rapida

SCs = cellule di Schwann

SEM = microscopia elettronica a scansione SIS = sottomucosa intestinale piccola SL = soft lithography

SLG = solid ground curing SLS = selective laser sintering SLT = stereolitografia TE = ingegneria tissutale TGA = analisi termogravimetrica

TIPS = separazione di fase indotta termicamente TPC = collagene termoplastico

TPS = amido plasticizzato con glicerolo UV = raggi ultravioletti

v = velocità del motore di raccolta delle fibre nel sistema di filatura da soluzione Vf = velocità di raccolta delle fibre

Vi = velocità di estrusione delle fibre WAXD = analisi di diffrazione ai raggi X

YIGSR = sequenza peptidica di tirosina – isoleucina - glicina – serina - arginina YKVAV = sequenza peptidica di tirosina – lisina – valina – alanina – valina

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INDICE

PARTE INTRODUTTIVA

Capitolo 1 ... 1

Introduzione generale ... 1

1.1 Miscele polimeriche... 1

1.2 Materiali polimerici eco-compatibili... 1

1.2.1 Il problema dell’impatto ambientale dei materiali polimerici ... 1

1.2.2 Materiali polimerici biodegradabili... 2

1.2.2.1 Principali sistemi biodegradabili... 4

1.3 Materiali polimerici biocompatibili ... 7

1.3.1. Ingegneria Tissutale... 7

1.3.1.1 Principi per la rigenerazione dei tessuti ...10

1.3.1.2 Principi di biologia molecolare ...11

1.3.1.2.1 Microambiente tessutale...12

1.3.1.2.2 Interazioni cellulari ...13

1.3.1.2.3 Architettura dei tessuti ...13

1.3.1.2.3.1 Risposte di motilità diretta in vivo...14

Interazioni cellulari con la fase fluida ...14

Interazioni cellulari con la fase solida acellulare 14 Interazioni cellulari con altre cellule 14 1.3.1.2.3.2 Risposte di motilità diretta in vitro ...14

1.3.1.2.3.3 Ambienti con specifiche proprietà della fase fluida...15

Gradiente lineare di concentrazione...15

Gradiente di sforzi di taglio...15

1.3.1.2.3.4 Ambienti con specifiche proprietà della fase solida ...15

Forme e architetture specifiche...15

Zone del substrato con specifiche proprietà di adesione...16

Specifiche proprietà meccaniche...16

1.3.1.2.3.5 Ambienti con specifici arrangiamenti delle cellule vicine...16

1.3.1.3. Strutture polimeriche per l’ingegneria dei tessuti o scaffold...16

1.3.1.3.1 Tecniche utilizzate per la realizzazione degli scaffolds ...17

1.3.1.3.1.1 Principali tecniche convenzionali...17

Tecnologia tessile...17

Tecniche di filatura...18

Solidi cellulari...18

Solvent leaching...19

Gas foaming ...19

Emulsion freeze-drying method...19

Polymer-solvent phase separation...19

1.3.1.3.1.2 Principali tecniche non convenzionali o di prototipazione rapida...20

Stereolitografia (SLT)...20

Selective Laser Sintering (SLS) ...21

Fused Deposition Modeling (FDM)...22

Laminated Object Manufacturing (LOM)...22

Solid Ground Curing (SGC)...23

3D Printing (3DP) ...24

Soft Lithography (SL)...25

Pressure Activated Microsyringe System (PAM)...25

1.3.1.3.2. Materiali utilizzati per la realizzazione degli scaffolds...26

1.3.1.3.2.1 Aspetti generali...26

1.3.1.3.2.2.Classi di materiali comunemente adoperate nell’Ingegneria Tissutale...27

1.4 Miscele polimerico eco-biocompatibili ... .50

1.4.1 Miscele PCL/Amido...32

1.4.2 Miscele PCL/chitosano...33

1.5 Oggetto del lavoro...33

(6)

SEZIONE A

MATERIALI BIOSINTETICI PER MICROFABBRICAZIONI DI SCAFFOLDS

A.1 Presentazione della Sezione A...1

B.1.1 Obiettivi del lavoro sviluppato nella Sezione A...1

Materiali sintetici per applicazione nella deposizione assistita tramite microsiringa (PAM)... 1

2.1 Introduzione ... 1

2.2 Parte sperimentale ... 2

2.2.1 Materiali ... 2

2.2.1.1. Preparazione di film per casting... 4

2.2.1.2. Tecnica di deposizione assistita tramite microsiringa (PAM) ... 4

2.2.2 Caratterizzazione fisico-chimica e biologica ... 10

2.2.2.1 Calorimetria differenziale a scansione (DSC)... 10

2.2.2.2 Microscopia ottica ... 10

2.2.2.3 Prove di degradazione/erosione ... 10

2.2.2.4 Test di citotossicità... 11

2.2.2.5 Microscopia a forza atomica (AFM)... 11

2.2.2.6 Angoli di contatto... 11

2.2.2.7 Tecnica di ellissometria: misura dell’indice di rifrazione, della costante dielettrica e dello spessore di film polimerici. ... 12

2.2.2.8 Misura della carica superficiale (Tecnica Kelvin-Probe)... 12

2.2.2.9 Caratterizzazione meccanica delle strutture ottenute per deposizione tramite microsiringa... 13

2.2.2.10 Test di adesione cellulare su film per casting e microfabbricazioni 2D ... 13

2.2.2.11 Test in vivo con strutture 3D ottenute per deposizione tramite microsiringa 14 2.3 Risultati e Discussione ... 15

2.3.1 Analisi calorimetria (DSC)... 15

2.3.2 Analisi tramite microscopio ottico ... 18

2.3.3 Prove di degradazione/erosione ... 23

2.3.4 Test di citotossicità... 27

2.3.5 Analisi tramite microscopio a forza atomica (AFM) ... 28

2.3.6 Misurazione dell’angolo di contatto... 30

2.3.7 Risultati derivanti dalla tecnica di ellissometria ... 30

2.3.8 Risultati derivanti dalla tecnica di Kelvin-Probe ... 31

2.3.9 Scaffolds prodotti tramite deposizione assistita tramite microsiringa (PAM) ... 31

2.3.10 Caratterizzazione meccanica degli scaffolds... 34

2.3.11 Test di adesione cellulare ... 35

2.3.12 Test in vivo ... 36

2.4 Conclusioni ... 38

(7)

Capitolo 3 ...1

Miscele di polimeri naturali per applicazioni nella soft lithography (SL) ...1

3.1 Introduzione...1

3.2 Parte sperimentale ...4

3.2.1 Materiali...4

3.2.1.1 Preparazione delle miscele tra chitosano e gelatina per reticolazione termica (DHT)...5

3.2.1.2 Preparazione delle miscele chitosano/gelatina per reticolazione chimica con genipina. ...6

3.2.1.2.1 Reticolazione della gelatina ...6

3.2.1.2.2 Reticolazione delle miscele chitosano/gelatina e del chitosano...6

3.2.2 Metodi...6

3.2.3.1 Analisi termogravimetrica ...6

3.2.2.2 Analisi all’infrarosso in modalità ATR (FTIR-ATR)...6

3.2.2.3 Microscopia elettronica a scansione (SEM) ...6

3.2.2.4 Misura dell’angolo di contatto ...6

3.2.2.5 Prove di rigonfiamento...7

3.2.2.6 Prove di solubilità...7

3.2.2.7 Proprietà meccaniche...7

3.2.2.8 Soft lithography (SL)...7

3.2.2.8.1 Microscopia ottica (OM)...8

3.2.2.9 Coltura cellulare ...8

3.2.2.9.1 Prove in vitro con fibroblasti ...8

3.2.2.9.2 Prove in vitro con neuroblasti ...8

3.3 Risultati...9

3.3.1 Valutazione della concentrazione ottimale di genipina nella reticolazione delle miscele chitosano/gelatina ...9

3.3.2 Analisi termogravimetrica (TGA)...12

3.3.3 Analisi all’infrarosso (FTIR-ATR) ...15

3.3.4 Analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM)...19

3.3.5 Risultati della misura dell’angolo di contatto...19

3.3.6 Risultati delle prove di rigonfiamento e di dissoluzione...20

3.3.7 Caratteristiche meccaniche...25

3.3.8 Caratteristiche morfologiche degli scaffolds prodotti attraverso la tecnica di soft lithography...28

3.3.9 Risultati delle prove cellulari in vitro...29

3.4 Conclusioni...32

(8)

Miscele “bioartificiali” per applicazioni nella tecnica di Selective Laser Sintering (SLS)... 1

4.1 Introduzione ...1

4.2 Parte sperimentale ...2

4.2.1 Materiali ...2

4.2.2 Preparazione di microparticelle...2

4.2.3 Tecniche di caratterizzazione fisico-chimica delle micro-particelle ...3

4.2.3.1 Analisi calorimetrica ...3

4.2.3.2 Analisi microscopica...3

4.2.3.3 Analisi termogravimetrica ...3

4.2.3.4 Analisi ai raggi X (WAXD)...3

4.2.3.5 Analisi all’infrarosso (FTIR) ...4

4.2.3.6 Analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM)...4

4.2.4 Selective Laser Sintering (SLS) ...4

4.2.4.1 Caratterizzazione fisico-chimica delle microstrutture sinterizzate...5

4.2.4.1.1 Analisi SEM...5

4.2.4.1.2 Misurazione dell’angolo di contatto ...5

4.2.4.1.3 Analisi all’infrarosso (FTIR-ATR) e calorimetrica (DSC) ...5

4.2.4.1.4 Analisi all’infrarosso tramite mappatura chimica ...6

4.2.5 Coltura di fibroblasti e successive caratterizzazioni...6

4.3 Risultati e discussione ...6

4.3.1 Proprietà termiche delle miscele PCL/polisaccaride risultanti dall’analisi DSC e dal supporto dell’analisi tramite microscopio ottico. ...7

4.3.2 Analisi termogravimetrica (TGA) ...17

4.3.3 Analisi di diffrazione ai raggi X (WAXD)...18

4.3.4. Analisi FTIR-ATR...20

4.3.5. Caratteristiche degli scaffolds ottenuti mediante Selective Laser Sintering...20

4.3.6 Prove di adesione cellulare...32

4.4 Conclusioni ...34

4.5 Riferimenti bibliografici...35

SEZIONE B MATERIALI BIOSINTETICI PER LA RIGENERAZIONE DEL SISTEMA NERVOSO PERIFERICO B.1 Presentazione della Sezione B ...1

B.1.1 Introduzione: rigenerazione del sistema nervoso periferico ...1

B.1.1.1 Strategie per la rigenerazione del sistema nervoso periferico...1

B.1.1.1.1 Cenni di biologia del sistema nervoso periferico (PNS)...1

B.1.1.1.2 Tecniche per la rigenerazione del sistema nervoso periferico...3

B.1.1.1.2.1 Autotrapianto ...3

B.1.1.1.2.2 Guide per la rigenerazione nervosa ...3

B.1.1.1.2.3 Materiali non-degradabili...4

B.1.1.1.2.4 Materiali biodegradabili...4

B.1.1.1.2.5 Cenni sull’uso di cellule staminali embrionali per la rigenerazione nervosa ...8

B.1.2 Obiettivi del lavoro sviluppato nella Sezione B...8

(9)

Capitolo 5. Produzione e caratterizzazione di fibre cave per estrusione dal fuso...1

5.1 Introduzione...1

5.2 Parte Sperimentale...1

5.2.1 Materiali impiegati ...1

5.2.1.1 Preparazione delle miscele bioartificiali...2

5.2.1.1.1 Miscele PCL/TPC 90/10 e PCL/TPS 90/10...2

5.2.1.1.2 Miscele PCL/CH 90/10 ...3

5.2.1.1.3 Miscele PCL/AP 95/05; 90/10; 80/20; 70/30 ...3

5.2.1.2 Estrusione in forma di fibre cave ...4

5.2.2 Caratterizzazione chimico fisica e funzionale ...4

5.2.2.1 Analisi termogravimetrica (TGA) ...4

5.2.2.2 Analisi morfologica (SEM) ...4

5.2.2.3 Analisi calorimetria (DSC)...4

5.2.2.4 Analisi all’infrarosso: FTIR-ATR e mappatura chimica (Chemical Imaging) ..5

5.2.2.5 Misura dell’angolo di contatto ...5

5.2.2.6 Prove cellulari in vitro con neuroblasti e fibroblasti...5

5.2.2.7 Test effettuati in vivo ...6

5.3 Risultati e Discussione...6

5.3.1 Analisi ai raggi X (WAXD) ...7

5.3.2 Analisi morfologica (SEM)...8

5.3.2 Analisi calorimetria (DSC)... 17

5.3.3 Analisi termogravimetrica (TGA)... 32

5.3.4 Analisi all’infrarosso: FTIR-ATR e mappatura chimica (Chemical Imaging) ... 38

5.3.5 Misura dell’angolo di contatto... 50

5.3.7 Prove cellulari in vitro ... 50

5.3.8 Prove in vivo... 56

5.4 Conclusioni... 61

5.5 Riferimenti... 62

Capitolo 6 ...1

Produzione e caratterizzazione ...1

di fibre cave porose...1

6.1 Miscele a base di polimeri commerciali per la produzione di fibre cave porose tramite la tecnica di dissoluzione selettiva...1

6.1.1. Introduzione ...1

6.1.2 Parte Sperimentale ...2

6.1.2.1 Materiali impiegati ...2

6.1.2.1.1 Preparazione di miscele polimeriche ...2

6.1.2.1.1.1 Miscele PCL/PEG...2

6.1.2.1.1.2 Miscele PCL/PEO...3

6.1.2.1.2 Preparazione di condotti cavi a base di miscele polimeriche...3

6.1.2.1.3 Produzione di guide cave porose...3

6.1.2.2 Metodi sperimentali...4

6.1.2.2.1. Analisi all’infrarosso: spettri FTIR-ATR e mappatura chimica tramite IR-Chemical Imaging ...4

6.1.2.2.2 Analisi morfologica (SEM)...4

6.1.2.2.3 Analisi gravimetrica...4

6.1.2.2.4 Analisi calorimetria (DSC) ...4

6.1.2.2.5 Analisi termogravimetrica (TGA) ...4

6.1.3 Risultati e Discussione ...5

6.1.3.1 Analisi morfologica (SEM) ...5

6.1.3.2 Analisi gravimetrica... 23

6.1.3.3 Analisi calorimetria (DSC)... 25

6.1.3.4 Analisi FTIR-ATR e Chemical Imaging... 35

6.1.3.5 Analisi termogravimetrica (TGA) ... 38

(10)

6.2 Miscele a base di polimeri commerciali per la produzione di fibre cave porose tramite la

tecnica di “dry-jet-wet spinning”... 41

6.2.1 Introduzione... 41

6.2.1.1. Produzione di fibre cave porose da soluzioni polimeriche... 42

6.2.1.1.1 Separazione di fase ... 43

6.2.1.1.2 Filatura da soluzione (spinning) ... 47

6.2.1.1.3 Dry-jet wet spinning... 48

6.2.1.1.4 Esempi di letteratura ... 51

6.2.2 Parte sperimentale... 52

6.2.2.1 Materiali ... 52

6.2.2.1.1 Produzione delle miscele PHBHV/PCL... 52

6.2.2.2 Metodi ... 53

6.2.2.2.1 Sistema di filatura a umido (“wet spinning”)... 53

6.2.2.2.1.1. Condizioni di filatura adoperate... 55

6.2.2.2.2 Analisi SEM delle miscele in forma di films per casting e fibre... 56

6.2.2.2.3 Analisi calorimetria delle fibre... 56

6.2.2.2.4 Analisi al microscopio a luce polarizzata (POM)... 57

6.2.2.2.5 Analisi ai raggi X (WAXD)... 57

6.2.2.2.6 Analisi FTIR e mappatura chimica (Chemical Imaging) ... 57

6.2.2.2.7 Misurazione dell’angolo di contatto ... 57

6.2.2.2.8 Prove cellulari in vitro... 58

6.2.3 Risultati e discussione... 58

6.2.3.1 Caratteristiche morfologiche delle fibre e dei films per casting (analisi SEM) ... 58

Fibre ottenute a partire da PCL e PHBHV puri... 60

Fibre ottenute a partire dalla miscela PHBHV/PCL 20/80 ... 63

6.2.3.2 Risultati dell’analisi DSC... 67

6.2.3.3 Analisi ai raggi X (WAXD)... 73

6.2.3.4 Microscopia a luce polarizzata... 76

6.2.3.5 Analisi FTIR-ATR e mappatura chimica (Chemical Imaging)... 85

6.2.3.6 Angolo di contatto ... 93

6.2.3.7 Prove cellulari in vitro... 93

6.2.4 Conclusioni... 95

6.3 Riferimenti... 97

SEZIONE C CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI Capitolo 7 ... 1 Conclusioni... 1 Capitolo 8 ... 1 Sviluppi Futuri... 1 APPENDICI APPENDICE A

Definizione dei termini più comunemente usati nell’ingegneria tissutale ...A-1 APPENDICE B

Microscopia a forza atomica, AFM... B-1 APPENDICE C

(11)

Metodo diretto... C-2 Metodo della bolla d’aria ... C-2

APPENDICE D

Ellissometria e Tecnica di Kelvin-Probe ... D-1 D.1 Ellissometria... D-1 D. 2 Tecnica di Kelvin Probe ... D-4 APPENDICE E

Tecnica di light scattering...E-1 APPENDICE F

Formule chimiche dei polimeri naturali...F-1

F.1 Amido ...F-1 F.2 Chitosano ...F-2 F.3 Destrano ...F-2 F.4 Gellano...F-2