1.2 La regolazione dell’espressione genica

1.2 La regolazione dell’espressione genica

Il codice genetico può essere definito come il linguaggio molecolare basato su l’ordine delle quattro basi azotate che si susseguono nella molecola di DNA, il codice ha una valenza universale motivo per cui è stato indicato come la chiave per conoscere l’intima struttura degli organismi. La possibilità di individuare e sequenziare acidi nucleici ha portato ad una crescita esponenziale del numero di sequenze di DNA e di RNA conosciute e depositate nelle banche dati. L’entusiasmo per la determinazione delle sequenze è stato tuttavia frenato dalla constatazione che questo approccio si è rivelato piuttosto riduzionistico, portando all’acquisizione di un’enorme mole di dati ferma ad un primo livello di caratterizzazione: la semplice conoscenza della sequenza genica non permette di individuare quali siano i meccanismi che influenzano i tratti e le funzioni di un organismo. Un ruolo determinante, inoltre, è svolto sicuramente dai meccanismi di regolazione dell’espressione genica. I geni infatti sono sottoposti a rigidissimi controlli che ne modulano l’espressione tanto che sebbene tutte le cellule abbiano lo stesso corredo genetico, non tutte esprimono gli stessi geni. I meccanismi di modulazione possono essere genetici o epigenetici e sono in grado di stabilire con estrema precisione sotto quale condizione (stadio di sviluppo, tessuto specifico, condizioni ambientali) il gene può essere espresso o deve rimanere silente (Fig. 1.2.1).

Fig. 1.2.1. Differenti livelli della regolazione genica.

1-Blocco della decondesazione della fibra del DNA, più è condensata e complessata a proteine, più il gene sarà inattivo.

2-Blocco della trascrizione, primo livello: meccanismi che impediscono l’attacco del complesso di trascrizione tramite modificazioni in siti particolari della sequenza di DNA. 3-Blocco della trascrizione, secondo livello: interruzione di maturazione, processamento dell’mRNA, inefficiente traslocazione.

1.2.1 La regolazione della trascrizione: promotore e

sequenze regolatrici

La trascrizione è il processo che media il trasferimento dell’informazione genica, contenuta nel DNA, in una molecola complementare di RNA che sarà tradotto in un prodotto proteico rappresentante l’espressione dell’informazione iniziale. La regolazione della trascrizione negli organismi eucarioti è esercitata prevalentemente attraverso l’azione di fattori di trascrizione che rappresentano elementi attivatori e repressori, ma anche con meccanismi diversi che influenzano l’accesso degli stessi fattori di trascrizione ai geni. I fattori di trascrizione sono elementi proteici in grado di incrementare il tasso di trascrizione di un gene grazie al legame con particolari sequenze del DNA, dette siti di regolazione, che possono trovarsi anche molto distanti dal sito di inizio della trascrizione (TSS) sia a monte che a valle del gene. Possiamo distinguere 3 classi fondamentali di fattori di trascrizione:

1. Fattori di trascrizione basali, coinvolti nel processo di preiniziazione. Sono ubiquitari e interagiscono aspecificamente con la regione del promotore prossimale di tutti i geni di classe II, schematizzati in Tab.1.2.1.

2. Fattori di trascrizione che legano specifici siti a monte o a valle del sito di inizio della trascrizione e che sono in grado di stimolare o reprimere la trascrizione stessa.

3. Fattori di trascrizione inducibili, simili ai precedenti, ma che sono a loro volta attivati o inibiti.

Tab. 1.2.1. Proteine coinvolte nel complesso dei fattori basali della trascrizioni di assemblaggio a livello del TATA box.

1.2.1a IL PROMOTORE

La regione fondamentale per la trascrizione di un gene eucariotico è detta promotore, entro il quale possiamo distinguere due zone (Yamamoto et al. 2007;

Molina et al. 2005; Shahmuradov et al. 2003, 2005).

1. Il promotore prossimale situato nella regione a cavallo del sito di inizio della trascrizione, entro il quale avviene il legame con l’RNA polimerasi e i fattori di trascrizione basali. Il core del promotore prossimale è la minima regione del promotore che è capace di iniziare la trascrizione basale, contiene il sito d’inizio della trascrizione e si estende tipicamente nel tratto da -60 a +40 relativamente al TSS.

2. una parte addizionale distale situata ancora più a monte del sito di inizio, solitamente intorno a 1Kbp, che controlla l’attività del promotore stesso attraverso l’interazione con fattori di trascrizione specifici.

Fattore di trascrizione N. di Subunità peso molecolare Funzioni

TF II D - TBP 1 38 riconosce il "core promoter” richiama il TF II B

TF II D - TAFs 12 15-250 Coopera al processo di attivazione,coopera al

processo di riconoscimento del promotore TF II A 3 12, 19, 35 Stabilizza il legame tra il TF II D ed il promotore

TF II B 1 35 richiama la RNA polimerasi II ed il TF II F

TF II F 2 30, 75 aiuta la RNA polimerasi II a raggiungere il

promotore

TF II E 2 35, 57 richiama il TF II H, modula l'azione elicasica del

TF II H e l'azione delle attività ATPase e chinasica

TF II H 9 89, 80, 62, 52

44,40, 38, 34, 32

Melting del promotore (apertura doppia elica) per azione della attività elicasica intrinseca,

silencing (Barton et al., 1997; Rombauts et al. 2003). Questi elementi possono essere

ritrovati sia nelle regioni a monte del TSS che negli introni, ma anche a valle dei geni che essi regolano (Larkin et al., 1993; Wasserman et al., 2000).

Fig. 1.2.2. Elementi regolatori della trascrizione.

All’interno del promotore troviamo elementi distali e prossimali a secondo che essi siano localizzati vicini o lontani rispetto al sito di inizio della trascrizione. A livello del sito di inizio della trascrizione, nel core promoter, troviamo il TATA-box sito di legame del complesso dei fattori di trascrizione basali e dell’RNA polimerasi. Elementi cis sono interposti in tutta la sequenza e sono riconosciuti da fattori di trascrizione che attivano o reprimono l’attività genica. All’estremità 3’ del gene è presente il sito di poli-Adenilazione entro il quale si trovano sequenze particolari con il segnale di inizio della coda poli-A nell’mRNA maturo pronto per essere tradotto.

1.2.1B CARATTERISTICHE CONSERVATE DEL PROMOTORE PROSSIMALE

Studi compiuti da Yamamoto et al. 2007 e Molina et al. 2005 hanno rilevato un’architettura del promotore caratterizzata da “motivi” conservati nella sequenza e talvolta anche nella localizzazione. La conservazione è sia in senso intra-specifico, tra promotori di geni di uno stesso organismo, che inter-specifico non solo tra monocotiledoni e dicotiledoni, ma anche tra piante e metazoi.

La regione del promotore prossimale, fino a -100 pb a monte del sito di inizio della trascrizione (TSS) (Fig. 1.2.3.), è caratterizzata da elementi sensibili all’orientamento e determinanti per la direzione della trascrizione che includono le sequenze Y-Patch, o Striscie di pirimidine, e i TATA-box (“uniq” in figura 1.2.4). Una regione più distale invece, oltre -100 pb dal TSS, è ricca in sequenze insensibili all’orientamento e contiene il gruppo REG (Regulatory Elements Group) (“comp” in figura 1.2.4).

Fig. 1.2.3. Schema degli elementi prossimali del promotore: regola YR, elementi Y-Patch, TATA box, e REG.

Le posizioni relative al TSS sono le seguenti: YR-Rule (-1/+1), Y-Patch (-100;-1), TATA-box (-50; -20), REG (-20;-400). Tra queste, solo i REG sono insensibili all’orientamento. In molti casi le Y Patch sono localizzate tra il TATA-box e il TSS, ma spesso sono state osservate a monte del sito del TATA-box (modificato da Yamamoto et al., 2007).

Fig. 1.2.4. Distribuzione dei motivi più o meno sensibili all’orientamento situati a monte del sito di inizio della trascrizione.

Il numero degli elementi posizionati tra -100 e -50 pb è caratteizzato da sequenze in grado di funzionare a prescindere dal loro orientamento (“comp” barre in nero) mentre il numero delle sequenze sensibili all’orientamento cresce all’avvicinarsi del sito di inizio della trascrizione (“uniq” barre in grigio). Nel grafico in basso è riportato il numero completo delle sequenze “uniq” (modificato da Yamamoto et al., 2007).

1.2.1c CARATTERISTICHE DEL SITO DI INIZIO DELLA TRASCRIZIONE (TSS)

Studi sui promotori di mammiferi hanno evidenziato sequenze caratterizzanti il sito di inizio della trascrizione conosciute come motivo Initiator (Inr: YYAN(T/A)YY), un particolare sito di riconoscimento per la TFIID, che può essere funzionale anche nelle piante. Indagini più approfondite su i TSS di Arabidopsis hanno rivelato che solo un limitato numero di promotori (meno del 10%) possiede il motivo Inr intorno al TSS, e successive mappature sulla frequenza delle basi presenti nella posizione -1/+1 tra i TSS di Arabidopsis hanno evidenziato che: la posizione -1 è preferibilmente occupata da una C o una T, mentre la posizione +1 è occupata da una A o una G. Questa “YR-Rule” (Y=C o T, R= A o G) è applicabile ad oltre il 77% dei promotori di

(Shahmuradov et al. 2003, 2005). Recentemente, Carninci et al. 2006 hanno riportato la stessa regola come applicabile per promotori umani e di topo, rivelando come sia possibile l’estensione della regola YR dalle piante ai mammiferi.

Un altro elemento caratterizzante il core promoter dei geni di organismi animali: l’elemento di riconoscimento della polimerasi (TFIIB Recognition Element-BRE), solitamente localizzato appena a monte del TATA box con una sequenza ricca in GC-(G/C)(G/C)(G/C)CGCC. Questo elemento BRE non è stato ritrovato da Yamomoto e colleghi (2007) come LDSS-positivo nelle piante; piuttosto nelle sequenze ai lati del TATA box viene preferito il dimero CC sia nei promotori di Arabidopsis che di riso.

Striscie di pirimidine (Y-Patch)

Sono sequenze composte da sole C e T, ritrovate nella gran parte dei promotori di

Arabidopsis, localizzate da -100 a -13 pb risultate conservate sia in monocotiledoni e

dicotiledoni, presentano tipicamente un picco nella regione monte del promotore, distribuita tra -13 e -60 pb. Un esempio, CTCTTC ha un picco di apparenza al TSS, mentre il suo complementare GAAGAG ha una distribuzione distinta, mostrando che la sequenza è sensibile alla direzione della trascrizione. Anche se esameri di questo tipo del profilo di distribuzione tendono ad avere solo C e T nella sequenza, non tutte le sequenze con C e T mostrano una distribuzione picco-positiva. Il ruolo biochimico delle Y-Patch non è conosciuto, ma la loro posizone, sensibile alla direzione e la grande abbondanza in natura suggeriscono che sono una componente del core del promotore. L’analisi LDSS (Local Distribution of Short Sequences) di

Yamamoto et al. 2007 suggerisce che uomo e topo non condividono con le piante

TATA box

In A. thaliana approssimativamente il 30%-50% di tutti i promotori conosciuti contiene un TATA-box locatizzato tra 45 e 25 bp a monte del TSS. Il TATA-box è apparentemente il più conservato segnale funzionale nei promotori eucariotici e in alcuni casi può dirigere un’accurata trascrizione da parte della Pol.II, anche in assenza di altri elementi di controllo. Molti geni fortemente espressi contengono un potente TATA-box nel loro promotore prossimale, ma grandi gruppi di geni

housekeeping e della fotosintesi mancano del TATA-box e sono indicati come

promotori TATA-less. In questi promotori, l’esatta posizione del sito di inizio della trascrizione può essere controllata dalla sequenza nucleotidica della regione nell’intorno del TSS stesso, o da un elemento del promotore (DPE), che è tipicamente osservato 30 bp a valle del TSS (Smale, 1997, Burke e Kadonaga 1997, Shahmuradov

et al. 2003, 2005).

REG (Regulatory Elements Group)

La regione che si estende da -20 a-400 contiene usualmente numerosi siti di legame con fattori responsabili di una regolazione specifica della trascrizione. Si localizzano in questa regione i siti del gruppo REG (Yamamoto et al. 2007) che comprende più di 200 sequenze, metà dei quali corrispodono a conosciuti cis-element. La loro sequenza complementare mostra lo stesso picco di distribuzione suggerendo un’indifferente sensibilità all’orientamento. Il principale REG trovato comune tra Arabidopsis e riso è la sequenza GGCCCA, con una posizione preminente intorno a -80 pb, conosciuta come Elemento II PCNA-2 di Arabidopsis, necessario nell’espressione del ciclo cellulare correlato all’espressione meristematica. Questa sequenza indica un buon grado di conservazione tra le specie; una mutazione nella sequenza TGAACC ne cancella l’espressione.

Motivi ricorrenti che corrispondono a brevi sequenze di 6-10 bp e che possono rappresentare siti di legame per proteine si ritrovano anche a valle del TSS, da +1 a +50, in posizioni variabili o conservate. Nella Fig. 1.2.5 sono riportate alcune caratteristiche dei motivi più ricorrenti sia a monte che a valle del TSS.

Fig. 1.2.5. Motivi presenti nelle regioni [-50,-1] e [+1,+50] di 12.749 geni di Arabidopsis.

I motivi sono numerati da 1 a 13 e ordinati secondo il grado di maggior rilevanza, sotto il nome del motivo. Il primo ed il secondo numero corrisondono al numero di hits generati utilizzando rispettivamente il database MEME o il database AlignACE. La seconda colonna di mostra la frequenza nucleotidica di distribuzione rappresentata graficamente con WebLogo, la grandezza rappresenta la frequenza. La terza colonna è il grafico delle frequenze di distribuzione (asse -y)

Motivi 1, 2, 4, 6, 9

Comunementi trovati in Arabidopsis, mostrano una simile e frequente distribuzione nelle regioni [-50, -1] e [+1, +50]; i motivi corrispondono al microsatellite (CA)n (con n = 5). La potenziale partecipazione dei microsatelliti nel controllo della regolazione non è ancora chiaro ma recenti studi in riso e Arabidopsis, mostrano che la loro distribuzione potrebbe seguire un gradiente crescente all’avvicinarsi del sito di inizio della trascrizione.

Motivo 5

E’ il revertito complementare del Motivo 12, con la sequenza consenso AAACCCTA ed è similmente presente nelle regioni [-50, -1] e [+1,+50]; il motivo non è conforme alle sequenze tipiche dei microsatelliti.

Motivi 3, 7

Mostrano una chiara sovraespressione nell’intervallo [-50, -1] con un incremento intorno ai bordi a destra dell’intervallo: il Motivo 3 ha tutte le caratteristiche del TATA box ed è stato trovato in 1899 geni, rappresentando circa il 15% di tutti i geni investigati mentre il Motivo 7 è stato trovato in un piccolo numero di geni, 153. Il motivo 7 è presente nei geni dell’orologio circadiano e nelle regioni a monte della sequenza codificante dei geni di Arabidopsis indotti dal buio.

Motivo 8

Conformi ai microsatelliti (CG)n, frequenti in monocotiledoni come il riso e meno frequenti in dicotiledoni come Arabidopsis, nella quale è consistente con una bassa ma comparabile frequenza in tutte e tre le regioni esaminate. L’apparente alta frequenza del motivo nella regione [+1,+50], comparata alla regione [-50,-1] (421 contro 282),

Motivo 10

Microsatellite (GAA)n trovato in 340 sequenze è presente nelle regioni [+1,+50], a prescindere che sia codificante o 5' UTR, ma non è ancora associato ad un ruolo funzionale in Arabidopsis.

Motivo 11

Posto nel Kozak consenso (ACCATGG) per la traduzione del codone ATG di inizio. Questo motivo è presente in sole 213 sequenze del 5' UTR [+1, +50], ma, considerando che delle 1.352 sequenze prese in considerazione in cui è stato trovato 1.139 hanno un breve 5' UTR, questo dato rappresenta un buon controllo interno sulla validità della ricerca tra i motivi nelle regioni [- 50, -1] e [+1, +50].

Motivo 12

Sequenza presente nei telomeri di Arabidopsis, sito di legame per le proteine MYB collegate ai telomeri. Questo elemento è presente nella 5' UTR o nella regione promotrice di molti geni codificanti prodotti associati con l’apparato traduzionale (fattori di trascrizione basali), o coinvolti nell’espressione di geni dei meristemi radicali.

Motivo 13

Con il consenso T/A CCGGCGA, è stato trovato solo nella regione [+1, +50]. Non identifica nessun sito di legame con nessun fattore di trascrizione conosciuto.

1.2.2 Isole CpG

Una caratteristica strutturale ricorrente nei promotori dei geni umani sono le così dette isole CpG, ovvero regioni particolarmente ricche in C e G (oltre il 50% ) della lunghezza media di circa 200 bp (Rombauts et al. 2003). Esse rappresentano regioni di regolazione della trascrizione che viene esercitata attraverso la possibilità dei residui di citosina di essere metilati: uno stato di ipermetilazione è generalmente associato a DNA inattivo trascrizionalmente (Rombauts et al. 2003).

Molti programmi sono stati sviluppati per la ricerca delle isole CpG nelle regioni al 5’ dei geni (Rombauts et al. 2003). Tuttavia, l’applicazione di essi alle piante è molto limitata a causa delle differenze nella distribuzione delle basi, i parametri usati per individuare le isole CpG nell’uomo e in altri vertebrati non possono essere usati per le piante. Solo abbassando la percentuale di contenuto in CpG e variando il valore del rapporto CpG/CpNpG è possibile individuare nelle piante sequenze CpG nella regione del promotore che si differenzino dalla generale distribuzione delle due basi nelle regioni degli esoni e degli introni. In realtà in accordo con l’osservazione che nelle piante anche regioni a valle del TSS, per esempio il primo introne, possono essere sede di elementi di regolazione, (Zhang et al., 1994; Gidekel et al., 1996; de

Boer et al., 1999), la distribuzione delle isole CpG e CpNpG differisce tra i promotori

e gli introni da una parte e gli esoni dall’altra, indipendentemente se codificanti o no. Quindi una maggiore accuratezza è richiesta per l’identificazione di “putative” isole CpG e CpNpG nelle piante.

1.2.3 Sequenze regolatrici dell’estremità 3’ del gene:

segnali di poli adenilazione

Nelle cellule eucariotiche l’RNA polimerasi II trascrive un lungo RNA pre-messaggero che prima di essere traslocato nel citoplasma e tradotto in proteina deve andare incontro a tre principali modificazioni post-trascrizionali: aggiunta di un gruppo 7- metil-guanina all’estremità 5’ (5’capping), eliminazione degli introni e poliadenilazione all’estremità 3’ che consiste nell’aggiunta di una coda poli(A). Fig.1.2.6). Ognuno di questi passaggi è altamento regolato da particolari fattori proteici e utilizza i segnali codificati nel 3’UTR dei precursori dell’mRNA.

Fig. 1.2.6. Schematizzazione dei principali eventi di maturazione del pre-mRNA.

Dopo la rimozione degli introni e l’aggiunta del cap all’estremità 5’, si ha il taglio (Cleavage) nel sito specifico di poliadenilazione nel 3’ UTR, segnale di addizione dei residui di adenosina per

Introne Capping\ splicing

Pre-mRNA

5’ UTR esone introne esone 3’ UTR

AAAAAAAA…. Cleavage

Poliadenilazione A

mRNA Maturo

La formazione della coda poli(A) richiede una prima rimozione di un frammento 3’ UTR, effettuata attraverso il taglio endonucleolitico ATP-dipendente di un punto preciso del pre-mRNA, seguito da una immediata polimerizzazione dei residui di adenosina all’estremità 3’-OH al prodotto tagliato al 5’. Un processo apparentemente così semplice coinvolge numerosi interazioni tra cis-acting factors e una moltitudine di proteine trans-acting in modo piuttosto differente tra i vari organismi eucarioti. I segnali che permettono la poliadenilazione sono dunque cis-acting sequences particolari, raggruppabili in tre elementi comuni a mammiferi, piante e lieviti: il sito di taglio (CS), una sequenza upstream vicina al sito di taglio detta NUE (Near

Upstream Element) nelle piante e AAUAAA negli animali, ed un altro elemento

localizzato maggiormente a monte del CS suddetto, nelle piante, FUE (Far Upstream

Element) (Fig. 1.2.7). Nei mammiferi troviamo un segnale addizionale localizzato a

circa 20 pb a valle del CS non comunemente osservato né in piante né in lieviti. Negli animali le sequenze NUE e FUE sono state ben caratterizzate tramite analisi comparative in quanto risultano piuttosto conservate mentre nelle piante e nei lieviti il grado di conservazione tra le specie è molto basso ed è possibile comparare, in termine di sequenze, solo gli elementi segnali del sito CS (Guoli et al., 2007).

Recentemente diversi studi compiuti sull’analisi delle sequenze caratterizzanti le regioni 3’UTR dei geni di Arabidopsis, hanno evidenziato delle caratteristiche ricorrenti nella composizione, ma soprattutto nella distanza delle sequenze che intervengono nella formazione della coda poli(A) (Loke et al., 2005; Guoli et al.,

2007). La regione NUE, che risulta avere una lunghezza compresa tra 6 e 10

nucleotidi ed è localizzata a circa 10-30 pb a monte del sito di taglio, sembra essere principalmente coinvolta nella regolazione del sito di taglio. Tra le sequenze più significative ritrovate nei geni di Arabidopsis spicca il pattern AAUAAA, coincidente

a circa 40-200 pb a monte del sito CS, di lunghezza intorno alle 100 pb, sembrerebbe piuttosto un elemento di controllo o di stimolazione composto da combinazioni di motivi UG piuttosto ambigui e decisamente differenti tra loro, come la sequenza UUGUAA. L’unico segnale decisamente conservato nelle piante rimane la composizione del segnale di taglio CS, formato da un dinucleotide YA (dove Y= C o U) fiancheggiato da due regioni ricche in U.

A complicare la rete dei segnali di poliadenilazione delle piante, si aggiunge la constatazione che, i geni di questi organismi, contengono comunemente siti multipli di poliadenilazione controllati non da un unico elemento NUE ma da diverse regioni regolatorie; ad esempio nel gene rbcS-E9 del pisello ogni sito di poli(A) è controllato dai propri NUE e CS, mentre un singolo FUE controlla tre dei quattro siti e un altro FUE (che si sovrappone con uno dei NUE) controlla il sito rimanente (Li e Hunt,

1997).

Fig. 1.2.7. Modello dei segnali di poliadenilazione per gli mRNa di piante, i numeri indicano la grandezza degli elementi o la distanza tra essi espressi in pb.

NUE: Near Upstream Element; AAUAAA, AAUGAA, AAUAUA, UAUAAA, AAUAAU, ecc..

FUE: Far Upstream Element; non sono state trovate particolare sequenze con un alto consenso piuttosto delle regione ricche in GU

CS: Cleavage Site o sito di poliadenilazione, con YA = CA o UA ORF: Open Reading Frame

ORF FUE NUE CS

60-100 13-100 10-40 6-10 0-80 YA +U +U

La lunghezza della coda poli(A) aggiunta all’mRNA maturo non ha solo un’importanza funzionale di stabilizzazione del trascritto, ma svolge anche un importante ruolo di percezione delle variazione metaboliche che richiedono una rapida alterazione dei livelli di mRNA, sia per accelerarne la degradazione dei trascritti, sia per aumentarne la disponibilità in caso di rapida sintesi proteica.

Degradazione rapida del mRNA

La distruzione degli mRNA subito dopo la trascrizione è un meccanismo più efficiente, rispetto alla degradazione nel citoplasma, nel prevenire la sintesi di proteine tronche o eccessive. Questo è particolarmente importante per quei geni che possiedono dei codoni di terminazione prematuri (ad esempio geni del TCR o gli “early-response-genes” il cui mRNA è soggetto ad un “turn-over” rapido, in quanto traduce per dei potenti regolatori cellulari come, ad esempio, i fattori di trascrizione).

Studi su funghi e metazoi hanno definito 4 vie principali di degradazione:

1. Deadenilazione-dipendente e rimozione del capping seguita da una degradazione 5’-3’ .

2. Deadenilazione-dipendente e degradazione 3’-5’.

3. Degradazione non-senso mediata che bersaglia mRNA con codoni prematuri terminativi .

4. Degradazione non-stop che bersaglia gli mRNA mancanti del codone di terminazione.

Le vie 1, 2 e 4 prevedono un preliminare accorciamento o rimozione completa della coda poli(A) determinante per l’intero processo di degradazione.

esempio, elementi ricchi in AU, detti ARE, in grado di agire come siti di legame per specifici trans-acting factor, il cui reclutamento potrebbe influire sia direttamente sulla deadenilazione che indirettamente in diversi modi: richiamando altri enzimi deadenilasi, stimolandone la loro attività, alterando le strutture secondarie del mRNA, o infine proteggendolo da RNA-binding protein (Reverdatto et al., 2004).

Vi sono tre tipi di mRNA deadenilasi: il complesso Ccr4–Pop2–Not; il complesso Pan2–Pan3; e l’enzima PARN, tutti ritrovati omologhi nei geni di Arabidopsis.

AtPARN sembre essere il solo gene codificante l’enzima PARN in Arabidopsis

(Reverdatto et al., 2004).

L’enzima PARN viene considerato la principale mRNA deadenilasi negli animali, anche se l’assenza di geni codificanti in lieviti e Drosophila (Chiba et al., 2004;

Reverdatto et al., 2004), fa supporre che questo enzima non sia così indispensabile

negli eucarioti e che venga compensato dalle altre classi di deadenilasi.

Mutazioni in AtPARN causano difetti nella risposta a stress ambientali, a stimoli ormonali e nell’accrescimento, suggerendo che questi enzimi possiedano distinte funzioni o bersagli differenti di mRNA nelle piante. I complessi di rimozione del Poli(A) interagiscono con altre proteine, come poly(A)-binding proteins e AU-rich

element-binding proteins. In Arabidopsis l’enzima AtPARN svolge una funzione

essenziale di regolazione dei trascritti genici durante le fasi embrionali di piante ed animali, analisi su mutanti difettivi dell’enzima presentano trascritti embrione-specifici iperadenilati che vanno incontro a ritardi nello sviluppo, culminanti nel blocco dello stadio cotiledonare, questo suggerisce che l’enzima sia essenziale per lo sviluppo embrionale, anche se il suo ruolo non è ben chiaro (Chiba et al., 2004). Altri studi suggeriscono il suo coinvolgimento nella degradazione sistemica dell’mRNA legati a processi di risposta a stress mediati correlati ad ormoni come l’acido abscissico (ABA). I mutanti ipersensibili all’ABA ahg2-1, in grado di mantenersi

endogeno nei semi rispetto al wild type. Quando i mutanti venivano sottoposti a stress ambientali mostravano una maggiore espressione dei geni indotti da ABA, acido salicilico e da stress rispetto al wild type; studi ulteriori sul gene AHG2 hanno rivelato che questo codifica per una ribonucleasi poli(A)-specifica identificabile come AtPARN. Analisi dettagliate dimostrano inoltre che la mutazione ahg2-1 riducendo la produzione di AtPARN, altera il tempo di degradazione dei trascritti. Questi risultati suggeriscono una regolazione di alcuni geni in risposta agli stress grazie all’attività di destabilizzazione degli mRNA effettuato da AtPARN, anche se non è ancora chiaro quale siano esattamente i geni corrispondenti ai trascritti regolati (Nishimura

et al., 2005).

Meccanismi di poliadenilazione citoplasmatica

In particolari condizioni gli RNA messaggeri possono essere immagazzinati “dormienti” in particolari distretti cellulari e attivati successivamente, tramite un processo di estensione (fino a 1000 adenosine) della coda poli(A) che avviene nel citoplasma. Questo meccanismo di controllo post-trascrizionale consente, in presenza di un preciso segnale, un rapido incremento della sintesi proteica non più legata ai sistemi trascrizionali che necessiterebbero di tempi più lunghi. (Richter, 1999; Kim e

Richter, 2006). La poliadenilazione citoplasmatica è stata, infatti, caratterizzata in

contesti in cui è necessario un rigoroso controllo temporale o spaziale della produzione proteica, o un incremento molto rapido dei livelli proteici come è richiesto ad es. dall’oogenesi. Questi meccanismi sono stati ampiamente studiati in oociti di Xenopus, topo e Drosophila mentre per il regno vegetale non vi sono che studi preliminari.

subcellulare e da una estesa regione 3’UTR che ospita necessariamente, nella sua porzione terminale, due particolari elementi ARE (Mendez e Richter, 2001). Uno di questi è l’esanucleotide AAUAAA, noto come elemento CPS/PAE (Cleavage

Polyadenylation Signal/ Polyadenylation Element), già necessario nel processo nucleare

di taglio e addizione della coda corta di poliadenilazione sul pre-mRNA. L’altro, denominato CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element), si trova generalmente a breve distanza dal primo ed è costituito da una sequenza ricca di uridine con il consensus UUUUUAU (Piccioni et al., 2005). In Xenopus l’elemento CPE sul trascritto viene riconosciuto dalla proteina di legame CPEB che, previa fosforilazione del residuo serina 174 compiuto dalla chinasi Eg2, riconosce un’altra proteina: la CPSF. A questo punto il complesso ribonucleoproteico (messaggero-CPEB-CPSF) richiama sul 3’ dello stesso messaggero l’enzima poli(A)-polimerasi citoplasmatica (PAP) che catalizza l’allungamento della coda di poliadenilazione con un meccanismo del tutto simile a quello nucleare (Fig. 1.2.8). L’allungamento è generalmente molto cospicuo, determinando un incremento anche di diverse centinaia di residui di adenosina (Kim

et al., 2006). Una estesa coda di poliadenilazione consente il legame di molte unità di

proteine leganti la coda poli(A) (PABP) citoplasmatiche; queste hanno la proprietà di reclutare il fattore di iniziazione eIF4G che porta ad una torsione del messaggero in un anello chiuso agli estremi 5’ e 3’. Tale evento è stato messo in relazione con una notevole facilitazione della traduzione e del processo di riciclo del ribosoma (Mendez e Richter, 2001). Sembra inoltre che le PAP siano interessate nella facilitazione della formazione di una struttura di 5’ cap-I o 5’ cap-II, eventi che conferiscono una migliore competenza traduzionale al trascritto (Mangus et al.,

2003). Se il processo di poliadenilazione citoplasmatica non viene attivato, i trascritti

contenenti CPE e CPS/PAE vengono rigidamente inibiti, sia rimanendo immagazzinati in comparti sub-cellulari protetti dall’azione esonucleasica (Richter,

della famiglia delle eIF4G-BP (Eucariotic Initiation Factor 4G-Binding Protein, in

Xenopus: Maskin). Questi fattori contengono un dominio di legame per eIF4G,

omologo a quello presente nel fattore di iniziazione eIF4E ed agiscono da competitori, determinando una inibizione della traduzione (Fig. 1.2.9) (Mendez e

Richter, 2001).

Fig. 1.2.8. Attivazione della traduzione tramite poliadenilazione citoplasmatica in Xenopus. CPEB viene fosforilato dalla chinasi Eg2 richiamando i fattori di taglio e poliadenilazione specifici (CPSF) e la poli(A) polimerasi (PAP), che allunga la coda di poli A.

Contemporaneamente alla elongazione, Maskin si dissocia dal fattore eIF4E, e delle proteine leganti il poli(A) (PABP) si associano sia alla coda che al fattore eIF4G, causando il ripiegamento della molecola. ORF, open reading frame (modificato da Mendez e Richter, 2001).

Fig. 1.2.9. Blocco della traduzione.