Scopo della tesi
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SCOPO DELLA TESI
Un’ipotesi accreditata è che meccanismi molecolari comuni regolano il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali e precursori appartenenti a tessuti diversi. Cruciale, in tali meccanismi, è il ruolo svolto dai fattori di trascrizione che agiscono in maniera combinatoria per attivare o reprimere serie specifiche di geni
target in modo da definire il destino differenziativo di una cellula.
In tale ottica nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, è stato dimostrato che l’omeogene Otx1, oltre ad avere un ruolo essenziale durante la neurogenesi, è coinvolto anche nel controllo delle cellule staminali ematopoietiche, in particolare nella filiera eritroide (Levantini et al, 2003). Attualmente,il progetto di ricerca nel quale si è inserito il mio lavoro studio è diretto ad indagare se il gene Otx1 contribuisca anche alla regolazione delle cellule staminali mesenchimali (MSCs) durante la differenziazione osteogenica. Infatti le MSCs, insieme agli osteoblasti maturi costituiscono il microambiente che regola le cellule staminali ematopoietiche e ci sono evidenze sperimentali che suggeriscono l’esistenza di un precursore comune che dà origine sia alle cellule ematopoietiche che agli osteoblasti (Cossu e Bianco,
2003). Le cellule staminali mesenchimali sono di particolare interesse per
applicazioni in campo terapeutico in quanto sono in grado di differenziare in cellule di diversi tessuti di origine mesodermica sia in vivo che in vitro, possiedono un’attività trofica e possono esercitare effetti immunoregolatori. Per queste loro caratteristiche sono ottimi candidati per l’ utilizzo nell’ ingegneria e nella rigenerazione tissutale. Il loro impiego ottimale richiede però un’approfondita conoscenza dei meccanismi, non ancora chiari, che ne regolano l’espansione e la differenziazione.
Risultati precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio hanno evidenziato un’espressione a bassi livelli dell’mRNA di Otx1 in MSCs indifferenziate ed un suo aumento durante la differenziazione osteogenica. Inoltre è stata osservata una stretta correlazione fra i profili di espressione di Otx1 e Runx2, il master gene dell’osteogenensi.
Scopo della tesi
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Poiché gli omeogeni frequentemente subiscono una regolazione post trascrizionale, scopo della mia di tesi è stato quello di studiare l’espressione di Otx1 a livello proteico. Il mio lavoro è stato articolato in due fasi: in una prima fase, il mio obiettivo è stato quello di verificare l’espressione del prodotto proteico di Otx1 nella linea di pre-osteoblasti murini MC3T3-E1, ampiamente utilizzata come modello di studio dell’osteogenesi, e in MSCs primarie di topo sia indifferenziate che indotte verso la differenziazione osteogenica. A tal fine ho effettuato l’analisi sia tramite Western Blot che, successivamente, attraverso immunocitochimica per studiare la distribuzione di Otx1 nell’ambito delle MSCs e la localizzazione intracellulare del fattore di trascrizione. Nell’ultima fase del mio lavoro, al fine di comprendere la funzione di Otx1 nell’osteogenesi, ho studiato gli effetti della sua inattivazione in MSCs di topi knock-out indifferenziate e indotte in senso osteogenico, analizzando tramite immunocitochimica i profili di espressione di un marcatore precoce come Runx2 e di uno tardivo come l’Osteocalcina.
