MATERIALI E METODI

MATERIALI E METODI

Obiettivo della sperimentazione oggetto di questa tesi, condotta su agnelli prematuri con RDS, è stato quello di valutare gli effetti del trattamento con surfactante naturale combinato con SOD e CAT sulla diminuzione dello stress ossidativo a carico polmonare, in confronto al trattamento con il solo surfactante.

1 MODELLO ANIMALE

Sono stati studiati 10 agnelli pretermine (e.g. 125 ± 1.3 giorni), provenienti da pecore di razza massese (con durata gravidanza a termine di 145 giorni), del peso di 2430±320 grammi, suddivisi in un gruppo sperimentale ed uno di controllo.

1.1 Scelta della specie animale

Come riportato in letteratura, l’ovino rappresenta il modello animale più utilizzato per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia perinatale. Come motivi alla base di questa scelta possiamo ricordare:

 facilità nella sincronizzazione degli estri e controllo della gestazione nella pecora;

 sviluppo neurologico inferiore rispetto a specie alternative quali primati non umani;

 le dimensioni e le caratteristiche anatomiche dell’agnello pretermine sono tali da poter utilizzare i dispositivi impiegati in campo umano (impossibile in caso di feti di altre specie, quali ratto o coniglio);

 l’agnello pretermine presenta la capacità di adattarsi anche a situazioni sfavorevoli ed è dotato di una certa resistenza alle procedure sperimentali;  disponibilità di indici emodinamici di riferimento nella letteratura.

Inoltre è stato scelto questo modello sperimentale animale anche per l’esperienza nell’uso della specie da parte del gruppo di ricerca.

2 GRUPPO SPERIMENTALE

Gli animali sono stati suddivisi in un gruppo di controllo (n=3) ed in un gruppo sperimentale (n=7). L’attribuzione degli animali ai due diversi gruppi è stata casuale (distribuzione randomizzata).

- Gruppo di controllo: trattamento intratracheale con 200 mg/kg di surfactante naturale (Curosurf®, Chiesi Spa, Parma, Italia), seguito da 10 ml di aria prima del collegamento

al respiratore meccanico;

- Gruppo sperimentale: trattamento con 200 mg/kg di surfactante naturale (Curosurf®,

Chiesi Spa, Parma, Italia), combinato con 2 mg/ml di SOD (superossido dismutasi, Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA), e 3000 U/ml di CAT (Sigma Chemical Co., St. Luis, MO, USA), seguito da 10 ml di aria prima del collegamento al respiratore meccanico.

In questa sperimentazione è stata sfruttata la ventilazione meccanica convenzionale, usando un ventilatore pressione-limitata, tempo ciclato.

3 INDUZIONE E CONTROLLO DELLA GESTAZIONE

Al fine di poter avere la certezza dell’età gestazionale dei feti, è stata effettuata la sincronizzazione degli estri, attraverso un protocollo terapeutico a base di progestinici, gonadotropine ed un analogo prostaglandinico.

Le pecore sono state sottoposte a trattamento progestinico intravaginale con Cronolone (Cronogest spugne®, 40 mg) per una settimana, seguita dal trattamento

con Cloprostenolo sodico (Estrotek® IM, 1-2 ml/capo, contenente Cloprostenolo ad una

concentrazione di 250 mcg/ml), un analogo sintetico della PGF-2α, per la risoluzione di eventuali corpi lutei persistenti e con gonadotropine sieriche (Cronogest PMSG® 400

l’analogo prostaglandinico e dall’asportazione della spugnetta. Da questo momento le pecore sono state quindi trasferite al montone col quale sono state lasciate per 2 giorni. Dopo 1 mese dal presunto accoppiamento le pecore sono state sottoposte ad esame ecografico per la verifica dello stato gravidico; nel caso di gravidanza positiva, il giorno del trasferimento della pecora al montone è stato considerato come il giorno di inizio della gestazione.

G 0 7 gg G 1 2 gg G 2 30 gg G 3

G 0: impianto spugnette

G 1: rimozione spugnetta, somministrazione Estrotek® e PMSG

G 2: trasferimento al montone e presunto accoppiamento G 3: ecografia per diagnosi di gravidanza

4 INTERVENTO CHIRURGICO E STRUMENTAZIONE

4.1 Pecora

Inizialmente è stato eseguito un esame ecografico per controllare principalmente le condizioni del feto. L’anestesia generale è stata quindi indotta con la somministrazione endovenosa di Propofol e mantenuta, previa intubazione orotracheale e collegamento al respiratore meccanico, tramite una miscela gassosa di ossigeno ed isofluorano (1,5%).

Per monitorare l’animale durante tutto l’intervento chirurgico fino al risveglio è stato analizzato il tracciato elettrocardiografico e quando possibile la pressione arteriosa sistemica.

L’intervento di taglio cesareo è stato eseguito con l’animale in decubito laterale destro, attraverso un’incisione della cute e dei piani muscolari a livello della regione della fossa sottolombare sinistra, così da creare un accesso in addome attraverso il quale poter esteriorizzare il corno uterino contenente l'agnello pretermine, andandone poi a

localizzare la testa. Una volta individuata, si è proceduto ad incidere l’utero proprio in corrispondenza di questa, così da poter esteriorizzare l’agnello fino alle spalle per poter eseguire le procedure chirurgiche a livello del collo, dopo di che l’animale è stato esteriorizzato completamente. Il cordone ombelicale è stato prima clampato e poi tagliato ed il feto è stato trasferito su un altro tavolo operatorio. Il moncone del cordone ombelicale è stato prima legato a tutto spessore con Mersilene 0 ed in seguito le componenti vascolari sono state suturate con Prolene 3-0. Dopo averne verificato la corretta emostasi, il moncone è stato lasciato cadere nella cavità uterina. La parete dell’utero è stata suturata con una sutura introflettente in materiale riassorbibile (Maxon 2-0) e la parete addominale è stata suturata seguendo i viari piani anatomici (peritoneo, piani muscolari, sottocute e cute) con materiale riassorbibile (Dexon 2-0) ad eccezione del peritoneo che è stato suturato con materiale non riassorbibile (Prolene 2-0).

L’anestesia gassosa è stata interrotta alla fine della sutura della cute e la ventilazione meccanica è stata mantenuta fino alla ripresa dell’attività respiratoria spontanea. La pecora è stata quindi trasferita, una volta risvegliatasi completamente, nello stabulario e sottoposta a trattamento analgesico per tre giorni (Finadyne®) ed

antibiotico (Baytril®) per 7 giorni dopo l’intervento.

4.2 Feto

L’agnello pretermine è stato liberato dal sacco amniotico, esteriorizzato parzialmente e posto in decubito dorsale, sull’addome della madre. L’incisione a livello della linea mediana del collo ha permesso l’esposizione ed il successivo isolamento della carotide e della vena giugulare interna e della trachea. L’arteria carotide (destra o sinistra) è stata sottoposta a cannulazione con catetere monolume (3 Fr) per il rilevamento della pressione arteriosa centrale (tramite collegamento ad un apposito trasduttore di pressione) e per il prelievo ematico per il controllo emogasanalitico ed elettrolitico,

mentre la giugulare interna (destra o sinistra) è stata sottoposta a cannulazione con catetere bilume (Certofix® duo, 5 Fr) per la somministrazione dei liquidi e/o farmaci.

La trachea è stata incisa a livello del II° spazio intercartilagineo per l’inserimento di un tubo intratracheale cuffiato (2,5-3 Fr). L’inserimento del tubo è stato tale da non oltrepassare la biforcazione del bronco accessorio, manovra che avrebbe impedito l’ingresso di aria nel bronco stesso, determinando un difetto di ventilazione delle aree polmonari da esso dipendenti.

Attraverso il tubo endotracheale è stato inserito un sondino nasogastrico col quale è stato aspirato il liquido polmonare fetale presente.

Una volta terminata la strumentazione chirurgica gli agnelli sono stati esteriorizzati completamente. Il cordone ombelicale è stato reciso e gli animali sono stati pesati, trasferiti su un lettino riscaldato e collegati al respiratore. Quattro elettrodi a placca posizionati agli arti hanno permesso il monitoraggio elettrocardiografico in continuo, mentre il collegamento del catetere arterioso ad un apposito trasduttore di pressione ha permesso il monitoraggio in continuo della pressione arteriosa sistemica.

Durante tutto il periodo di osservazione ciascun animale è stato sottoposto ad infusione continua di destrosio 10% alla dose di 100 ml/kg.

5 MONITORAGGIO POST-OPERATORIO

Tutti gli animali sono stati ventilati per 6 ore con un ventilatore neonatale pressione-limitato, tempo ciclato (Ventilatore Newport Breeze, Soma Technology Inc., Bloomfield, CT, USA), utilizzando strategie di ventilazione simili sia nei controlli che negli animali trattati.

Le impostazioni iniziali del ventilatore prevedevano una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) di 4 cm H2O e una pressione inspiratoria di picco (PIP) sufficiente

ad ottenere un volume corrente o tidalico (VT) di circa 10 ml/kg. La frazione di ossigeno inspirato è stata adeguata al fine di mantenere una pO2 di almeno 100-150

mmHg. Per escludere la possibilità che i cambiamenti nell’impostazione del ventilatore potessero influenzare i risultati dello studio, i ricercatori responsabili della regolazione del macchinario non erano a conoscenza di quali animali facevano parte del gruppo dei trattati.

Terminata la preparazione dell’animale ed eseguiti i prelievi ematici ed il broncolavaggio per i rilievi basali (T0), a ciascun animale è stato somministrato, per via

endotracheale, il surfactante esogeno, addizionato con SOD e CAT negli animali del gruppo sperimentale.

Durante le 6 ore di osservazione sono stati registrati su apposita tabella i parametri del setting ventilatorio, quelli emodinamici e quelli emogasanalitici ed elettrolitici con tempi ben definiti come riportato nella Tabella 1.

I parametri emogasanalitici , acido base ed elettrolitici, quali il pH sanguigno, la pCO2 e

la pO2, nonché l'eccesso di basi (BE), sono stati analizzati oltre che ogni 30 minuti

anche ogni qual volta lo stato ventilatorio si modificava con evidenti cambiamenti dei movimenti del torace e del volume corrente o quando i parametri impostati venivano cambiati a seconda delle esigenze.

I parametri ventilatori come la pressione media delle vie aeree (MAP), il volume corrente (TV), la compliance dinamica (Cdyn) e la resistenza delle vie aeree (Raw), sono stati monitorati tramite un monitor respiratorio neonatale (Florian Neonatale Respirazione Monitor™, Acutronic, Hirzel, Svizzera) ed i loro valori sono stati registrati ogni 30 minuti.

Durante l'intero esperimento, per mantenere una pressione arteriosa sistemica media superiore a 30 mmHg, sono stati somministrati, secondo la necessità, il plasma expander a base di poligelina (Emagel®) e/o dopamina, alla dose di 10-20

corretta con l’infusione di bicarbonato di sodio o trometamolo (THAM), in caso di ipercapnia con PaCO2> 45 mmHg.

In caso di necessità gli animali sono stati sottoposti ad anestesia generale con Zoletil (10 mg/Kg).

Durante la sperimentazione, alla fine di ogni ora, è stato cambiato il lato del decubito laterale per permettere un’eguale espansione di entrambi i polmoni.

I prelievi ematici venosi ed il broncolavaggio sono stati eseguiti, oltre che prima della somministrazione del surfactante, a 1, 2, 4 e 6 ore dalla somministrazione dello stesso. L’aspirato bronchiale per la misurazione della concentrazione degli idroperossidi totali (TH), dei prodotti proteici di ossidazione avanzata (AOPPs), e del ferro libero, non legato alle proteine (NPBI) è stato eseguito con la seguente tecnica: sono stati instillati 2 mL/kg di soluzione salina sterile allo 0,9% utilizzando una siringa da 10 ml attraverso un catetere da alimentazione collocato nel tubo endotracheale, in modo che la punta fuoriuscisse per 1 cm oltre l’estremità distale del tubo. La soluzione salina è stata instillata e subito riaspirata nella siringa. Il volume medio di soluzione salina riaspirata è stato di 6 ± 0,2 ml/kg.

PARAMETRI

PERIODO di

VALUTAZIONE

ventilatore

FiO

_{MAP, TV, Cdyn, Raw}

2

, FR, PIP, PEEP,

ogni 30'

emodinamica

FC, PAS/PAD, PAM

ogni 30'

emogasanalisi

pH, pCO

2

, pO

2

, BE

ogni 30' e secondo

necessità

aspirato bronchiale

TH, AOPP, NPBI

T

0

, T

1

, T

2

, T

4

, T

6

Tabella 1. FiO2= frazione di ossigeno inspirata; FR= frequenza respiratoria; PIP= pressione inspiratoria di picco;

PEEP= pressione positiva di fine espirazione; MAP= pressione media delle vie aeree; TV= volume corrente; Cdyn=

compliance dinamica; Raw= resistenza delle vie aeree; FC= frequenza cardiaca; PAS= pressione arteriosa sistolica;

PAD= pressione arteriosa diastolica; PAM= pressione arteriosa media. pCO2= pressione parziale anidride carbonica; pO2= pressione parziale ossigeno; BE= eccesso di basi. TH= idroperossidi totali; AOPP= prodotti proteici di ossidazione avanzata; NPBI= ferro libero, non legato alle proteine.

Al termine delle 6 ore di monitoraggio post-operatorio, il soggetto è stato soppresso con un’iniezione endovenosa di KCl (10 mL/soggetto) e sottoposto ad esame necroscopico, con prelievo degli organi (cuore, polmoni, fegato, milza e reni) per le indagini istologiche.

In particolare il torace è stato accuratamente aperto per verificare eventuali segni di pneumotorace o di raccolte intracavitarie e sono stati quindi prelevati gli organi. Il complesso polmoni, cuore e grossi vasi è stato prelevato in toto e successivamente i polmoni sono stati isolati dal cuore e sottoposti a prova docimasica prima e dopo la separazione tra polmone destro e polmone sinistro.

Tutti gli organi prelevati sono stati quindi fissati in formalina tamponata al 10%.

Sono stati prelevati da ogni polmone, sia destro che sinistro, due campioni: uno dal lobo apicale (A) e uno dal lobo principale (B). I campioni così ottenuti sono stati identificati nel modo seguente: As, Ad, Bs, Bd.

I campioni sono stati quindi inclusi in paraffina e da questi si sono ottenute, utilizzando il microtomo, delle sezioni di 4-5 µm di spessore, che sono state colorate con Ematossilina-Eosina (EE) e con il metodo Pearls.

Per la valutazione sono stati presi in considerazione diversi parametri, quali distensione alveolare, presenza di aree atelettasiche, edema interstiziale e/o alveolare, infiltrato infiammatorio/essudato intrabronchiolare ed aree emorragiche interstiziali e/o intralveolari.

La valutazione delle lesioni, allo scopo di assegnare uno score indicante il grado di aerazione raggiunta, è stata eseguita considerando un numero di campi microscopici pari a 10 a 125x per ciascuna sezione.

Per quanto riguarda la distensione alveolare sono stati evidenziati 4 diversi pattern: - A = dilatazione alveolare omogenea con distensione ottimale;

- D = dilatazione multifocale con aree restanti atelettasiche.

Al fine di facilitare l’analisi statistica di questi dati è stato poi attribuito un valore numerico ai diversi gradi di distensione delle vie aeree terminali: è stato attribuito 0 quando la dilatazione era simile a quella dei polmoni di controllo, 1 quando era circa 1-1,5 volte rispetto al calibro delle vie aeree del controllo, 2 quando la dilatazione risultava essere 1,5-2 volte, e 3 quando gli alveoli si presentavano molto dilatati (più di 2 volte rispetto al calibro delle vie aeree di controllo).

Per tutti gli altri parametri (presenza di aree atelettasiche, edema interstiziale e/o alveolare, infiltrato infiammatorio/essudato intrabronchiolare ed aree emorragiche interstiziali e/o intralveolari) è stato attribuito inizialmente uno score da negativo a grave, dove negativo = 0, lieve = 1, moderato = 2, grave = 3. Per l’analisi statistica si è poi preferito valutare ogni aspetto patologico in base alla sua presenza/assenza. Si è attribuito quindi il valore 0 quando assente, 1 quando presente.

I campioni prelevati da cuore, fegato, milza e reni sono stati anch’essi fissati in formalina tamponata al 10%, inclusi in paraffina ed infine tagliati con il microtomo così da ottenere delle sezioni di 4-5 µm di spessore, che sono state colorate con ematossilina-eosina (EE), tricromica di Goldner e Van Gieson. Sono stati quindi esaminati al microscopio ottico per evidenziare eventuali lesioni presenti.

6 TIPOLOGIE DI CAMPIONI

I campioni raccolti durante il periodo di studio sono stati i seguenti:

 sangue arterioso: prelevato dall’arteria carotide per il monitoraggio emogasanalitico, idroelettrolitico ed acido-basico ed eseguito al T0 e

successivamente ogni 30’ fino allo scadere della sesta ora. I parametri valutati sono stati registrati.

 sangue venoso: prelevato dalla vena giugulare esterna ed eseguito al T0 e

successivamente alla 1a, 2a, 4a e 6a ora. Il sangue è stato posto in provette

prive di anticoagulante e conservato in fresco fino alla formazione del siero. Successivamente è stato centrifugato a 3000 g per 30’ a 4° C. Dopo ciò il siero è stato suddiviso in aliquote di quantità non superiore ai 500 μL ciascuna ed è stato poi congelato a – 80° C fino all’analisi.

 Lavaggio broncoalveolare (BAL): è stato eseguito a T0 e successivamente

alla 1a, 2a, 4a e 6a ora. Il broncolavaggio è stato eseguito utilizzando la

seguente tecnica: è stato instillato 2 ml/kg di soluzione salina sterile allo 0,9% utilizzando una siringa da 10 ml attraverso un catetere da alimentazione collocato nel tubo endotracheale, in modo che la punta fuoriuscisse per 1 cm oltre l’estremità distale del tubo. La soluzione è stata instillata ed immediatamente riaspirata. L’aspirato è stato raccolto, mescolato e separato in tre aliquote una delle quali addizionata con una soluzione di antiproteasi (100 μL/mL). Le provette sono state conservate in un contenitore con ghiaccio fino alla centrifugazione effettuata entro 30’ dalla raccolta a 1000-1500 rpm a 4° C. Successivamente è stato separato il supernatante dalle cellule, così da ottenere, in totale, tre aliquote di cellule e sei di supernatante. Le provette sono state poste in azoto liquido dopo di che sono state conservate in un congelatore a - 80° C sino alla loro analisi. Sul BAL sono stati dosati gli idroperossidi totali (TH), i prodotti dell’ossidazione avanzata delle proteine (AOPP) ed il ferro libero non legato alle proteine (NPBI), tutti indici dello stress ossidativo polmonare.

 Encefalo: l’encefalo è stato prelevato tramite asportazione dalla teca cranica. Il tessuto è stato lavato con PBS sterile e successivamente diviso

nei due emisferi. In ciascun emisfero è stato evidenziato il nucleo striato e separato dalla corteccia. Queste due partizioni di ciascun emisfero sono poi state suddivise ciascuna in due aliquote, posizionate in apposite provette su cui era stato riportato il peso a vuoto e nuovamente pesate. I campioni sono stati quindi congelati in azoto liquido e conservati a - 80°C sino alla loro analisi.

I campioni di sangue arterioso sono stati analizzati in loco, mentre i campioni di broncolavaggio, siero ed encefalo sono stati analizzati nel laboratori del Dipartimento di Pediatria, Ostetricia e Medicina della Riproduzione, Sezione di Neonatologia Policlinico S. Maria alle Scotte, Siena.

7 ANALISI STATISTICA

L'evoluzione nel tempo dei parametri emogasanalitici, della meccanica polmonare e degli indici di stress ossidativo nei due diversi gruppi (controllo e sperimentale), è stata confrontata utilizzando il test ANOVA per misure ripetute, seguito dal test per confronti multipli di Bonferroni.

Il confronto tra i dati ricavati dai due gruppi di trattamento, sia per quanto riguarda i parametri sopra citati che la distensione alveolare, è stato eseguito tramite il test t-Student per dati appaiati, in quanto i dati erano distribuiti normalmente. Il valore di p<0.05 è stato considerato significativo.

Il

confronto tra i due gruppi di trattamento riguardo gli altri parametri (aree di atelettasia, cellule epiteliali desquamate, edema interstiziale/alveolare, emorragie interstiziali ed emosiderina) è stato effettuato tramite un test esatto per il confronto delle due frequenze, trattandosi di variabili bernoulliane. Il valore di p<0.05 è stato considerato significativo.

8 CASISTICA

Sono stati effettuati 10 studi su agnelli pretermine, derivanti da madri a vari stadi di gestazione (Tabella 2).

Nella Tabella 3 sono riportate, in ordine cronologico, le caratteristiche di ogni agnello pretermine (sesso, peso, età gestazionale, tipo di gravidanza) oggetto di sperimentazione.

E.G.

Tot 124 gg = 4

Tot 125 gg = 2

Tot 126 gg = 1

Tot 127 gg = 3

Tabella 2: Età gestazionale pecore fattrici.

CASO

GRUPPO

SESSO PESO (Kg) E. G. (gg)

GRAVIDANZA

#1

GRUPPO C

M

2,200

126

Gemellare

#2

GRUPPO C

F

2,390

127

Gemellare

#3

GRUPPO C

F

2,735

127

Singola

#4

GRUPPO S

F

1,950

124

Gemellare

#5

GRUPPO S

M

2,380

124

Singola

#6

GRUPPO S

F

2,460

125

Singola

#7

GRUPPO S

M

2,500

124

Singola

#8

GRUPPO S

F

3,020

127

Singola

#9

GRUPPO S

M

2,570

125

Gemellare

#10

GRUPPO S

M

2,100

124

Singola

Tabella 3.: Caratteristiche degli agnelli pretermine oggetto di sperimentazione.