1 ABSTRACT
La melatonina (MEL) è una molecola prodotta da diversi organismi, sia animali che vegetali, batteri e protozoi. Negli animali viene sintetizzata attraverso tre principali passaggi enzimatici a partire dall’amminoacido triptofano, che viene idrossilato e decarbossilato per formare la 5-idrossitriptamina (serotonina), successivamente acetilata sul gruppo amminico in posizione 3 per formare l'N-acetil- idrossitriptamina (NAS) ed infine, quest'ultima, subisce una metilazione sull’idrossile indolico in posizione 5 per formare la melatonina. La MEL nei vertebrati è un neurormone, prodotto dalla ghiandola pineale o epifisi, che controlla il ritmo riproduttivo negli ungulati (ovini, caprini) e nei roditori (topi, ratti), dove media l’effetto delle variazioni della durata della fase di luce secondo un ritmo circannuale o stagionale. Un’altra funzione nella quale è implicata è il controllo del ritmo circadiano del sonno e della veglia. Inoltre, alterazioni genetiche della produzione di MEL, sono state associate ad un aumento dell’incidenza di patologie psichiatriche, indicando la possibilità che questa molecola abbia un ruolo nella predisposizione all’insorgenza di tali patologie. La produzione di MEL da parte della ghiandola pineale ne determina i livelli circolanti ma, è anche prodotta da altre strutture periferiche, tra le quali la retina, la cute e le cellule del sistema linfatico ed è probabile che svolga un ruolo tessuto specifico. In tutti i tessuti la MEL viene prodotta in maniera ritmica, sia grazie alla regolazione circadiana dell’espressione del gene Aanat (responsabile per la codifica dell’enzima AANAT che catalizza l’acetilazione della serotonina a NAS), sia grazie al controllo della stabilità di AANAT mediante la sua associazione con proteine chaperoniche che ne riducono la degradazione a livello del proteasoma. La MEL possiede recettori specifici accoppiati a proteine G e recentemente è emerso che anche la NAS, è capace di interagire oltre che con alcuni recettori della MEL accoppiati a G-proteine, anche con i recettori tirosin chinasici Trkb del BDNF (Brain derive neurotrophic factor).
Infine, sia la MEL che il suo precursore NAS hanno azioni antiossidante, detossificante, antitumorale e potenziante del sistema immunitario. Sia la MEL che la NAS sono prodotte nella retina, dove sono presenti recettori specifici per queste molecole e dove possono esercitare la loro azione antiossidante, tali molecole infatti sono capaci di proteggere i fotorecettori dallo stress ossidativo innescato dalla luce che viene focalizzata sui segmenti esterni dei fotorecettori ricchi di acidi grassi polinsaturi particolarmente suscettibili alla lipoperossidazione, come l'acido docosaesaenoico.
Considerato che, sia la NAS che la MEL con diversi meccanismi, sembrano implicate nella funzionalità e nella vitalità delle cellule retiniche, abbiamo ritenuto interessante valutare la regolazione della produzione di entrambi a livello retinico, per ottenere utili indicazioni sul ruolo delle azioni mediate da recettori rispetto alle loro azioni antiossidanti. In questo lavoro di tesi ho focalizzato la mia attenzione, sullo stadio finale della conversione della NAS in MEL, sviluppando inizialmente una nuova metodica analitica per la valutazione quali-quantitativa della NAS e della MEL mediante HPLC con rilevatore fluorimetrico per la loro determinazione nel tessuto retinico in varie condizioni fisiologiche.
2 Sviluppo della metodica cromatografica
Per la messa a punto del metodo, inizialmente sono stati applicati due protocolli sperimentali presenti in letteratura, che non hanno fornito risultati soddisfacenti sia per tempi di ritenzione sia per risoluzione dei picchi di NAS e MEL. Successivamente, partendo da tali esperienze sperimentali, sono state studiate diverse procedure analitiche per ottimizzare i vari parametri di validazione attraverso la ricerca delle migliori condizioni cromatografiche quali: miscela eluente, colonna cromatografica e λ di eccitazione ed emissione allo scopo di aumentare la separazione dei picchi e la sensibilità (LOD e LOQ). In particolare sono state valutate differenti fasi mobili: utilizzando come fase acquosa H2O Mq oppure soluzioni tamponate a pH compresi tra 3 e 8 e come fase organica MeOH, ACN e miscele compatibili. Tutti gli studi preliminari, condotti su standard commerciali di NAS e MEL, hanno permesso di identificare due diverse modalità di eluizione (una isocratica e l'altra in gradiente) con alti valori ε0 (λecc.290 nm ; λem. 340 nm)per entrambi gli analiti. Successivamente alla fase di messa a punto delle condizioni cromatografiche è stata ottimizzata la procedura di estrazione di NAS e MEL dalla matrice retinica. A tale scopo, come "bianco di riferimento", sono state utilizzate retine di topi C57BL/6, i quali non producono MEL e NAS a causa di mutazioni spontanee sia su Aanat che su Hiomt.
Mentre per la valutazione della produzione endogena di NAS e MEL sono state utilizzate retine di animali ottenuti incrociando topi del ceppo C57BL/10 (privi di NAS e MEL) con topi del ceppo AJ, che producono sia NAS che MEL. Questo ceppo misto era disponibile in due varianti, con (MUT) e senza (WT) una mutazione del gene Cacna2d4 che codifica per la subunità accessoria dei canali del calcio α2δ-4 e che altera l’omeostasi del Ca2+ nei fotorecettori, cellule che producono NAS e MEL, modificandone la produzione rispetto ai WT. Le retine oggetto di studio, dopo congelamento, sono state omogeneizzate in TFA 0.1 M, centrifugate a 10000xg per 30 min a 4 °C ed il sopranatante alcalinizzato fino a pH=4/5 con KOH. L'isolamento di NAS e di MEL dalla matrice biologica, è stata condotta attraverso una estrazione in fase solida utilizzando "cartucce" SPE con diversi supporti:
Waters Oasis HLB e Waters Sep-pak ODS. Tale fase di studio, è stata condotta confrontando i risultati ottenuti con i due supporti in termini di recupero utilizzando diverse procedure di condizionamento, e/o diversi eluenti (MeOH e CH2Cl2). Gli estratti contenenti gli analiti, stati portati a secco in corrente di N2 e poi ricostituiti con MeOH. Inoltre, per valutate l’efficienza estrattiva, sono stati analizzati campioni con aggiunta di MEL e NAS standard prima e dopo estrazione su colonne e confrontati con soluzioni acquose dei medesimi standard sottoposti alla medesima procedura estrattiva. Al fine di ottimizzare e validare la procedura analitica, è stato valutato l'effetto matrice sulla risoluzione cromatografica attraverso il confronto dei risultati ottenuti analizzando campioni di retine di topi che esprimono (C57BL/AJ) con campioni di retine di topi che non esprimono (C57BL/6) NAS e MEL. In ultimo, sono stati condotti studi preliminari per determinazione dei parametri di validazione quali:
precisione, riproducibilità e accuratezza del metodo. In conclusione con la nuova metodica analitica sviluppata in questo lavoro di tesi, è stato possibile valutare i livelli di MEL e NAS e calcolarne il rapporto a differenti tempi circadiani nei 3 diversi ceppi dimostrando la possibilità di misurare tali analiti in differenti condizioni fisiologiche e permettendone il suo utilizzo per studi futuri volti a chiarire i meccanismi di regolazione del sistema melatoninergico retinico e le sue potenziali applicazioni terapeutiche a questo livello.
