Metabolismo microbico Batteri metofili/lieviti metilotrofi

Metabolismo microbico

Batteri metofili/lieviti metilotrofi

BATTERI METOFILI

1. ricavano C ed E dal metabolismo dei composti ad 1 atomo di Carbonio (alcuni obbligati)

2. aerobi obbligati (necessità metabolica) 3. Si dividono in: METANOTROFI

METILOTROFI

BATTERI METANOTROFI

- Gram-; mobili, di diverse forme (cocchi e bastoncelli, diverse forme di aggregazione; vibrioni, reniformi)

- aerobi stretti (ma crescono rapidamente quando la pressione parziale di O₂ è ridotta)

- si distinguono in m. di Tipo I (con sottogruppo) o di Tipo II -possono formare cisti e esospore; possono formare PHB (I) - se crescono esclusivamente su CH₄ sviluppano complessi

sistemi di membrane interne

- unici procarioti a presentare grandi quantità di steroli nelle membrane

BATTERI METANOTROFI

in crescita su CH

BATTERI METANOTROFI

formaldeide

BATTERI METANOTROFI Assimilazione C in Tipo I

Tutti C del materiale cellulare derivano dalla formaldeide assimilata;

No richiesta di potere riducente

Più efficace di via della serina perché non richiede potere rid.

 maggiore resa di crescita

BATTERI METANOTROFI Assimilazione C in Tipo II

Coinvolti enzimi del TCA più enzima caratteristico

BATTERI METANOTROFI

Assimilazione C e altre caratteristiche

BATTERI METILOTROFI

CARATTERISTICHE:

- gruppo eterogeneo (Gram- e Gram+) - non sanno utilizzare CH₄

- non formano né cisti né esospore - no sistemi di membrane interne

BATTERI METOFILI – FONTI DI C

LIEVITI METILOTROFI

Porro et al. (2005) “Recombinant protein production in yeasts”

Molecular Biotechnology 31:245

Condividono pathway metabolico che permette loro di utilizzare Met-OH come unica fonte di C

Met-OH  risposta regolata  molti enzimi sintetizz ad alti livelli  i loro promotori sono tra i + forti e strettam regolati  altamente attrattivi per RPP

LIEVITI METILOTROFI

Pathway di utilizzo del metanolo

LIEVITI METILOTROFI: Pichia (Komagatella) pastoris

Sviluppata e studiata principalmente da

Phillips Petroleum (già dagli anni ’70) e da SIBIA, per convertire metanolo in proteine per la nutrizione animale

Tre fenotipi principali:

1) Mut⁺: ceppi che utilizzano metanolo, necessitano di un alto feeding rate del substrato di crescita

2) Mut^s: “slow”, sono aox1- AOX2  utilizzo di metanolo, e di conseguenza crescita, più lenti (utilizzati, ad es, per produzione di antigeni contro epatite B)

3) Mut^-: mutanti aox1,2-, ceppi incapaci di crescere su metanolo. Crescono molto più lentamente

Produzione di proteine: perché?

Ricombinante: perché?

- Le proteine sono tra i principali strumenti effettori attraverso cui le cellule esprimono le loro caratteristiche

- Le loro funzioni si esplicano non solo in relazione alla cellula che le ha prodotte ma spesso in relazione all’ambiente, ad altri organismi e/o ad altre cellule dello stesso organismo

- Sono caratterizzate da una spiccata propensione all’interazione con altre molecole, interazione che può portare alla

formazione di complessi (a diversa vita media), statici o dinamici, o che può determinare la modifica delle molecole coinvolte nell’interazione

 studio delle proteine offre infinite possibilità nel campo della ricerca tanto quanto sul versante delle applicazioni

Produzione di proteine: perché?

Ricombinante: perché?

MA:

- molto spesso le proteine vengono prodotte transientemente e in quantità limitate

- la loro estrazione può non essere semplice, determinando anche la compromissione della molecola stessa

- le cellule o gli organismi che producono la proteina di interesse possono non essere facilmente coltivabili, o anche

pericolosi

 necessità di poter disporre di quantità rilevanti della proteina in esame/di interesse

 tecnologia rDNA può fornire soluzione… e lo ha fatto!

Produzione di proteine Ricombinanti e

Pichia (Komagataella) pastoris

LIEVITI METILOTROFI: Pichia pastoris

Sviluppati vettori soprattutto di integrazione (che avviene principalmente per ricombinazione omologa)

Ottimizzato l’uso di promotori, soprattutto quelli della via di utilizzo del metanolo

Possibilità di utilizzo di marcatori sia metabolici (principalmente HIS4) sia antibiotici (principalmente zeocina)

Sviluppati ceppi deleti in proteasi, in associazione o meno con ottimizzazione di strategie di coltivazione

LIEVITI METILOTROFI: Pichia pastoris

Engineering complex-type N-glycosylation in Pichia pastorisusing GlycoSwitch technology Pieter P Jacobs, Steven Geysens, Wouter Vervecken, Roland Contreras & Nico Callewaert Nature Protocols 4, 58 -70 (2008)