Magistro baigiamasis darbas

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

MINDAUGAS GUDAUSKAS

GLIUKOZAMINO TURINČIŲ MAISTO PAPILDŲ KOKYBINIS BEI

KIEKYBINIS TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Rūta Marksienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

GLIUKOZAMINO TURINČIŲ MAISTO PAPILDŲ KOKYBINIS BEI

KIEKYBINIS TYRIMAS CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Rūta Marksienė Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantas Mindaugas Gudauskas Data KAUNAS, 2019

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Gliukozamino charakteristika ... 11

1.2. Gliukozamino šaltiniai ... 11

1.2.1. Gliukozamino hidrochlorido išgavimas iš vėžiagyvių kiautų ... 12

1.2.2. Gliukozamino išgavimas iš ląstelių kultūros ... 12

1.3.Gliukozamino veikimo mechanizmas ... 13

1.3.1. Gliukozamino poveikiui nustatyti atlikti klinikiniai tyrimai: ... 13

1.4. Osteoartritas ... 14

1.5. Gliukozamino sąveika su kitais vaistais ... 15

1.5.1. Gliukozamino sinergistinis veikimas su chondroitinu ... 15

1.6. Galimi gliukozamino šalutiniai poveikiai ir kontraindikacijos ... 16

1.7. Gliukozamino farmakokinetika ir farmakodinamika ... 16

1.7.1. Farmakokinetika ... 16

1.7.2. Farmakodinamika ... 16

1.8. Lietuvoje notifikuoti maisto papildai su gliukozaminu ... 17

1.9. Gliukozaminui tirti naudojami metodai: ... 17

1.9.1.Efektyvioji skysčių chromatografija ... 17

1.9.2. Plonasluoksnė chromatografija ... 18

2. TYRIMO METODIKA ... 19

2.2. Tyrimo objektas ... 19

2.3. Tiriamų maisto papildų sudėtis ... 19

2.4. Tyrime naudotos medžiagos ir įranga ... 22

2.4.1. Tyrime naudotos medžiagos: ... 22

2.4.2. Tyrime naudota įranga ... 22

2.5. Tyrimo metodai ... 23

2.5.1. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ... 23

Kiekybinis nustatymas ... 24

Kalibracinės kreivės paruošimas ... 24

2.5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 25

Kiekybinis nustatymas ... 26

Kalibracinės kreivės taškų paruošimas ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1 Gliukozamino identifikavimas ... 27

3.1.1. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ... 27

3.2.1.Efektyvioji skysčių chromatografija ... 28

3.2. Validacija ... 29

3.2.1. Gliukozamino kiekybinio vertinimo ESC metodu validacija. ... 29

3.2.2. Gliukozamino kiekybinio vertinimo EPC metodu validacija. ... 31

Tiesiškumas ... 32

Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos ... 33

3.3. Gliukozamino kiekybinis nustatymas ... 33

3.3.1. Kiekybės nustatymas efektyviąja skysčių chromatografija ... 33

3.3.2. Kiekybės nustatymas plonasluoksne chromatografija ... 34

3.3.3. Procentinio nuokrypio palyginimas tarp ESC ir EPC ... 35

4. IŠVADOS ... 36

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37

SANTRAUKA

M. Gudausko magistro baigiamasis darbas „Gliukozamino turinčių maisto papildų kokybinis bei kiekybinis tyrimas chromatografiniais metodais“. Mokslinė vadovė doc. dr. Rūta Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos Fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2019.

Tikslas: kokybiškai bei kiekybiškai įvertinti gliukozaminą, Lietuvoje registruotuose maisto

papilduose.

Uždaviniai: parinkti geriausius chromatografijos metodus tyrimui atlikti; validuoti pasirinktą

metodiką gliukozamino ivertinimui; kokybiškai ir kiekybiskai įvertinti gliukozaminą, esantį maisto papilduose; palyginti eksperimentiniais metodais gautus kiekybinius rezultatus su gamintojų ant pakuočių nurodytais kiekiais.

Darbo objektas: Lietuvoje notifikuoti maisto papildai su gliukozaminu.

Tyrimo metodikos: identifikavimui ir kiekybiniaim nustatymui buvo naudota efektyvioji

skysčių chromatografija (ESC) bei efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC).

Rezultatai: visuose penkiuose tirtuose maisto papilduose buvo aptiktas gliukozaminas tiek

EPC, tiek ESC metodu. Gliukozamino kiekis maisto papilduose svyravo nuo 77,0 % iki 94,5 % ant pakuotės gamintojo pateikto kiekio.

Išvados: identifikuojant gliukozaminą tiek ESC, tiek EPC metodu visuose 5 mėginiuose buvo

nustatytas gliukozaminas; kiekybiškai nustatant gliukozaminą buvo nustatyta, kad gliukozamino kiekis maisto papilduose: Nr.1 709mg; Nr.2 798mg; Nr.3 462mg; Nr.4 498mg; Nr.5 426mg; lyginant gautus rezultatus su ant pakuotės gamintojų deklaruojamu kiekiu buvo nustatyta, kad didžiausias procentinis nuokrypis buvo Nr.3- 23 % o mažiausias Nr.1- 5.5 %.

Rekomendacijos: Tolimesniems giukozamino tyrimams rekomenduojame naudoti ESC

SUMMARY

M. Gudauskas Master theses “Analysis of food supplements containing glucosamine using chromatography methods”. Supervisor doc. dr. Rūta Marksienė; Lithuanian university of health sciences, Faculty of Pharmacy, Department of analytical and toxicological chemistry

.

Aim of the research: qualitative and quantitative analysis of glucosamine in food

supplements available in Lithuanian market.

Tasks of research: chose best analysis methods for experiments; validate the methods chosen

for assessment of glucosamine; perform qualitative and quantitative analysis of glucosamine; compere experiment results with declared amounts by manufacturer.

Object of the research: food supplements containing glucosamine available in Lithuanian

market.

Methods: for qualitative and quantitative analysis HPLC and TLC was used.

Results: HPLC and TLC showed that in all food supplements chosen for experiment there

was traces of glucosamine. Glucosamine amount determined in food supplements ranges from 77,0 % to 94.5 % of amount declared by manufacturer.

Conclusions: traces of glucosamine was found in all five food supplements; quantitative

analysis showed that amount of glucosamine in food supplements was: No.1 709mg; No.2 798mg; No.3 462mg; No.4 498mg; No.5 426mg; when comparing experiment results with manufacturers declared amount it was found that largest deviation was in sample No. 3 which was 23 % and the lowest deviation was in sample No. 1 that was 5.5 %.

Recommendation: for the further analysis of food supplements with glucosamine use of

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovei doc. dr. Rūtai Marksienei už konsultacijas ir patarimus. Dėkoju visai analizinės ir toksikologinės chemijos katedrai už suteiktą pagalbą. Dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant ir modeliuojant tyrimus bei doktorantui Ivan Bezruk už patarimus, kaip atlikti efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimus.

SANTRUMPOS

EPC- Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ESC- Efektyvioji skysčių chromatografija PC- Plonasluoksnė chromatografija SSN- Santykinis standartinis nuokrypis

ĮVADAS

Gliukozaminas yra natūraliai organizme esantis amino cukrus. Maisto papildų ir vaistų gamybai jis dažniausiai išgaunamas iš vėžiagyvių ir mikrobinės biomasės [6].

Gliukozaminas pasižymi poveikiu į sąnarių kremzles ir sinovinį skystį, dėl to dažnai yra naudojamas kaip prevencinė priemonė nuo osteoartrito arba kaip priemonė, skirta palengvinti jo sukeliamus simptomus. Osteoartritas - tai dažniausiai pasitaikanti sąnarių liga pasaulyje kuri kamuoja 10 % vyrų 18 % moterų vyresnių nei 60 metų. Gliukozaminas sumažina ligos požymius ir palengvina jos simptomus, tokius kaip [19, 4]:

 Sąnarių nejudrumas;

 Skausmingi sąnariai;

 Sunkumas vaikštant.

Kadangi žmonių populiacija senėja, jos amžiaus vidurkis auga, vis daugiau žmonių peržengia 60 metų ribą, kuri padidiną tikimybę susirgti osteoartritu ar kitomis su sąnariais susijusiomis ligomis.

Lietuvos rinkoje pacientams gliukozaminas lengviausiai prieinamas maisto papildų forma (registruoti 22 maisto papildų preparatai ir 5 vaistiniai preparatai, iš kurių 2 receptiniai) [29, 35]. Kadangi maisto papildų sudėčiai nėra taikomi griežti reikalavimai nėra žinoma koks deklaruojamos medžiagos kiekis yra maisto papilde. Dėl to buvo pasirinkta išanalizuoti maisto papildus, kurių sudėtyje yra gliukozamino, siekiant sužinoti, kurie maisto papildai yra tinkamiausi senstančiai šių dienų populiacijai.

Maisto papilduose gliukozaminas būna gliukozamino sulfato ir giukozamino hidrochlorido pavidalu. Visuose šiam tyrimui pasirinktuose maisto papilduose yra gliukozamino sulfatas. Šio tyrimo

tikslas - kokybiškai bei kiekybiškai įvertinti gliukozaminą, Lietuvoje notifikuotuose maisto

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Kokybiškai bei kiekybiškai įvertinti gliukozaminą, Lietuvoje notifikuotuose maisto papilduose.

Uždaviniai:

1. Parinkti chromatografijos metodus tyrimui atlikti. 2. Validuoti pasirinktą metodiką gliukozamino įvertinimui.

3. Kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti gliukozaminą, esantį maisto papilduose.

4. Palyginti eksperimentiniais metodais gautus kiekybinius rezultatus su gamintojų ant pakuočių nurodytais kiekiais.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gliukozamino charakteristika

Išvaizda: balti arbe beveik balti kristaliniai milteliai. Visiškai tirpūs vandenyje, truputi tirpūs metanolyje, praktiškai netirpūs acetone. Gliukozaminas yra amino monosacharidas, kuris yra sintetinamas is gliukozės ir glutamino[1, 2,3].

Gliukozaminas (C6H13NO5) arba 2-amino-2-deoksi-D-gliukozė (Pav.1). Tai yra amino cukrus

kurio molekulinė masė yra 179,17. Tai natūraliai žmogaus organizme randama medžiaga. Gliukozaminas - tai vienas iš prekursorių GAGs (glikozaminoglikanai) sintezėje. Ši medžiaga yra viena iš kremzlių sudedamųjų dalių. Dėl sunykusio kremzlinio audinio žmonėms gali išsivystyti osteoartritas [1].

Šis junginys dažniausiai randamas kietame įvairių gyvūnų, vabzdžių bei vėžiagyvių šarve. Taip pat gliukozaminas įeina į įvairių polisacharidų, kurie yra gaminami bakterijų kultūrų, sudėtį [4].

Pav. 1. Gliukozamino molekulinė struktūra [5]

1.2. Gliukozamino šaltiniai

Yra du pagrindiniai gliukozamino šaltiniai. Vienas gliukozamino šaltinis yra mikrobinė biomasė. Kitas natūraliai iš vėžiagyvių gautas gliukozaminas. Kiekvienas metodas turi savo privalumų ir trūkumų: iš vėžiagyvių gautas gliukozaminas gali netikti žmonėms, kurie turi alergija vėžiagyviams, antras trūkumas tai, kad laisvėje augę vėžiagyviai turi skirtingą sudėtį. Dėl to gali kisti gliukozamino kokybė bei išeiga. Gliukozaminas, kuris yra išgaunamas iš bakterinės biomasės yra grynesnis, pastovesnės kokybės ir reikalauja mažesnių gamybos sąnaudų. Gaminant gliukozaminą iš bakterinės biomasės mažinama žala gamtai, nes nežvejojami jūros vėžiagyviai iš kurių ir gaminamas natūralus iš vėžiagyvių gaunamas gliukozaminas. [6]

1.2.1. Gliukozamino hidrochlorido išgavimas iš vėžiagyvių kiautų

Vienas iš pagrindinių gliukozamino šaltinių yra vėžiagyvių šarvai. Gliukozaminas iš jų išgaunamas cheminių reakcijų metodu.

Gliukozaminui išgauti naudojamos vėžiagyvių dalys kurios nėra naudojamos maisto produktų gamybai- galvos, kojos, šarvas, uodega [7].

Gliukozamino gamyba vyksta keliomis stadijomis:

1. Chitino išgavimas iš vėžiagyvių. Atvežtos į gamybos vietą vėžiagyvių dalys yra nuplaunamos, tada seka trys pagrindiniai žingsniai norint gauti chitiną iš vėžiagyvių. Pirmiausiai vėžiagyvių dalys paveikiamos 10 % natrio hidroksido tirpalu kuris pašalina baltymų liekanas. Antras žingsnis - veikiant 1,8M vandenilio chlorido rūgštimi vėžiagyvių kiautai yra nuvalomi nuo visų ant jų susikaupusių mineralų. Trečias žingsnis, procese norint gauti chitiną - depigmentacija veikiant 0,38 % NaClO. Tarp visų procesų vėžiagyvių šarvai yra plaunami vandeniu [7]. 2. Chitino virsmas gliukozaminu. Chitinas po pirminio apdorojimo yra išdžiovinamas ir

sumalamas. Chitinas pirmiausiai veikiamas 12M vandenilio chlorido rūgštimi ir vyksta rūgštinė hidrolizė. Nufiltruojamos netirpios liekanos ir gliukozaminas vėl paverčiamas į kristalinę formą veikiant 95 % etanoliu ir atvėsinant tirpalą iki 5OC. Pakartojama filtracija. Nuosėdos

perplaunamos etanoliu ir džiovinamos 50O_{C temperatūroje. Gauti kristalai yra gliukozamino}

hidrochloridas [7].

1.2.2. Gliukozamino išgavimas iš ląstelių kultūros

Gliukozaminas išgaunamas iš E. Coli ląstelių, kurios fermentacijos būdu gamina gliukozaminą [4, 8].

Buvo pasirinktos sąlygos: pH 6,8-7,0 , temperatūra 37°C, Deguonies koncentracija 20 %. Augimo terpės sudėtis: KH2PO4, citrinos rūgštis, kalcio chloridas, magnio sulfatas, putojimą

mažinanti priemonė Mazu DF204, gliukozė. Galutinė augimo terpė buvo papildyta vario sulfatu, geležies sulfatu ir cinko sulfatu. Prieš į terpę patalpinant bakterijas visos terpės dalys ir indai buvo sterilizuoti [4].

Terpės maitinimas: gliukozė buvo leidžiama į bandomąją terpę lėtai kol sausas bakterijų kiekis pasiekė 5g/L. Tada gliukozės kiekis buvo padidintas iki 6,5g/L per valandą ir 5g/L laktozės buvo pridėta i augimo tepę, kad paskatintų gliukozamino gamybą. Fermentacijos procesas truko 72 valandas [4].

Gliukozamino išgavimas:

2. Bakterijos buvo patalpintos į išgrynintą vandenį kur jos homogenizatoriaus pagalba buvo suardytos ir N-acetil-gliukozaminas pateko į vandenį.

3. Bakterijų liekanos buvo atskirtos fokulianto ir centrifūgos pagalba,

4. N-acetil-gliukozaminas buvo paverstas gliukozaminu naudojant jonų mainų kolonėlę kurios temperatūra 100°C.

5. Gliukozaminas iš jonų mainų kolonėles buvo išplautas etanoliu, kuris sukoncentravo gliukozaminą 4°C temperatūroje. Gliukozamino kristalai buvo surinkti filtro pagalba.

Tokiu metodu gaunamas gliukozaminas yra 85 % grynumo [4].

1.3.Gliukozamino veikimo mechanizmas

Tikslus veikimo mechanizmas nėra žinomas, bet manoma, kad gliukozaminas padeda atsistatyti kremzliniam audiniui, lėtina jo degradaciją, skatina sinovinio sysčio išsiskyrimą [9].

1.3.1. Gliukozamino poveikiui nustatyti atlikti klinikiniai tyrimai:

Yra atlikta daug klinikinių tyrimų, kad būtų įrodytas gliukozamino veiksmingumas gydant, mažinant arba užkertant kelią įvairioms ligoms ar sutrikimams. Dažniausiai gliukozaminas yra naudojamas kaip priemonė osteartrito gydyme.

Poveikis sanariams

Dalis tyrimų su gliukozaminu atlikta dėl jo poveikio mažinant kelio osteoartrito progresavimą, požymius ir gerinant žmonių savijautą. Ne visi tyrimai turi vienodą rezultatą, kai kurie neigia gliukozamino poveikį mažinant kelio osteoartrito požymius kiti teigia kad poveikis yra. Bet dauguma sutinka kad gliukozaminas yra gera prevencinė priemonė norint išvengti osteoartrito [10,11].

Poveikis chroniniam apatinės nugaros dalies skausmui

Šiais tyrimai stengiasi atskleisti kitas gliukozamino poveikio vietas kaip chroninio apatinės nugaros dalies skausmą ir degeneratyvinį stuburo osteoartritą. Tačiau šie tyrimai parodė, kad nebuvo žymaus pokyčio tarp placebą ir gliukozaminą vartojusių pacientų [12].

Gliukozamino poveikis nuo uždegimo

Gliukozamino efektyvumas buvo išbandytas ir palygintas su nesteroidiniais vaistai prieš uždegimą kai pacientas sportuoja. Šiame tyrime buvo išsiaiškinta, kad Gliukozaminas nepadeda augti raumens masei tačiau padeda didinti jo maksimalią jėgą [13].

1.4. Osteoartritas

Osteoartritas (Pav.2) - tai dažniausiai pasitaikanti sąnarių liga pasaulyje. Ja serga 10 % vyrų 18 % moterų vyresnių nei 60 metų. Osteoartritas dažniausiai pasireiškia sumažėjusiu sąnarių judrumu bei sakusmingais sąnariais.

Osteartritas tai liga kurios metu sumažėja ar visai išnyksta kremzlinis sąnario audinys. Kitos pasekmės gali būti: kaulo išaugos į sąnario ertmę, sausgyslių atsipalaidavimas, raumenų susilpnėjimas aplink pažeistą sąnarį ir sinovinio skysčio sumažėjimas ar uždegimas [14].

Osteoartrito gydymo metodas visada buvo skausmą mažinimas arba chirurginės intervencijos, sąnario keitimas [15].

Gliukozamino nauda osteoartrito prevencijoje ir gydyme. Klinikiniai tyrimai parodė, kad gliukozaminas gali padėti sumažinti osteoartrito simptomus. Gliukozaminas pagal veikimo mechanizmą gali sumažinti sąnario skausmą, nes gliukozaminas padeda atsistatyti ir sulėtina sąnario kremzlinio junginio nykimą. Tai pat yra įrodyta, kad gliukozaminas padeda sinovinio skysčio išsiskyrimui bei mažina sąnario uždegimą [15, 16, 9, 17].

Pav. 2. Sveikas (A) ir osteoartrito pažeistas (B) sąnarys [18]

Sinovinis skystis

Sinovinis skystis tai sąnario ertmėje esantis skystis, kurio sudėtyje randama hialurono rūgšties bei gliukozaminoglikano. Šis skystis padeda laisvai judėti sąnariui, veikdamas kaip tepalas, kuris palengvina slydimą. Tai yra viena iš pirmų sąnario dalių, kurias paveikia osteoartritas. Jos gydymui yra pasitelkiamos hialurono injekcijos, kurios padeda padidinti sinovinio skysčio kiekį sąnaryje taip palengvindamos sąnario judėjimą ir sumažiną sąnario skausmą. [19,4]

1.5. Gliukozamino sąveika su kitais vaistais

Glukozaminas neturi daug sąveikų su kitais vaistais, bet keletas atvejų yra aprašyta. 1. Gliukozaminas, vartojamas kartu su varfarinu, padidina varfarino antikoguliacinį poveikį.

Veikimo mechanizmas nėra tiksliai žinomas. Dėl šios priežasties patariama nevartoti gliukozamino kartu su netiesioginio veikimo antikoguliantais.

2. Nėra įrašu apie gliukozamino sąveiką su naujos kartos antikoaguliantais, bet reikėtų pasisaugoti ir jei įmanoma nevartoti gliukozamino preparatų kartu su naujos kartos antikoguliantais.

3. Yra nustatyta teorinė sąveikos rizika tarp gliukozamino ir doksorubicino bei etopozido todėl yra nerekomenduojama vartoti šiuos preparatus kartu.

4. Nors nėra įrodymu, kad gliukozaminas didina gliukozės koncentraciją žmogaus organizme, pacientai sergantys diabetu turėtų stebėti gliukozės koncentraciją kraujo plazmoje kai pradeda vartoti gliukozaminą, pakeičia jo dozę ar preparatą kuris yra vartojamas [20, 21, 22].

1.5.1. Gliukozamino sinergistinis veikimas su chondroitinu

Dauguma maisto papildų savo sudėtyje be gliukozamino turi ir chondroitino (Pav.3). Yra įrodyta, gliukozaminas su chondoitinu derinyje veikia stipriau nei atskirai. Tyrimai parodė, kad lyginant kontrolinę grupę su kitomis grupėmis kurios vartojo tik gliukozaminą ar tik chondroitiną pacientams pagerėjo 32 % o grupėje kurioje buvo vartojamas gliukozaminas su kondroitinu kartu rezultatai pagerėjo 96,6 %. Tai įrodo kad gliukozaminas vartojamas kartu su chondoitinu turi stipresnį veikimą, nei vartojant atskirai [23, 24, 25].

1.6. Galimi gliukozamino šalutiniai poveikiai ir kontraindikacijos

Šalutiniai poveikiai

Gliukozaminas beveik neturi šalutinių efektų. Tik vartojant jį labai didelėmis dozėmis ilga laikotarpį ir keliomis vartojimo formomis galima sukelti lengvus šalutinius efektus, tokius kaip: pykinimas, refliuksas, viduriavimas, vidurių užkietėjimas. Labai retai gali pasireikšti tokie šalutiniai poveikiai kaip apsvaigimas, galvos skausmas ir bėrimas [27,28].

Kontraindikacijos

Gliukozaminas nėra rekomenduojamas žmonėms, kurie turi padidėjusį jautrumą gliukozaminui. Žmonės, turintys alergiją vėžiagyviams, turėtų prieš vartodami gliukozaminą išsiaiškinti, koks gliukozamino šaltinis buvo naudojamas gaminant maisto papildą ar vaistą [29].

1.7. Gliukozamino farmakokinetika ir farmakodinamika

1.7.1. Farmakokinetika

Gliukozamino farmakokinetiniai tyrimai su žmonėmis turi daug trūkumų - greita gliukozamino biotransformacija organizme, nejautrūs detekcijos metodai ir, norint nustatyti gliukozamino judėjimą ir kitimą organizme, reikia naudoti [14_{C] radioaktyvų atomą.}

Gliukozaminas turi 26 % bioprieinamumą, kai vartojamas enteraliniu būdu, ir 96 % bioprieinamumą, kai vartojamas parenteraliai į raumenį [30, 31].

Gliukozaminas koncentracijos maksimumą pasiekia per 8-10 valandų. Gliukozamino pusperiodis T1/2- 57 valandos. Pagrindiniai gliukozamino skilimo produktų šalinimo keliai yra

šlapimas ir išmatos [32, 33, 34].

1.7.2. Farmakodinamika

Gliukozaminas yra reikalingas glikozaminogliukanų, proteglikanų ir hialuroninės rūgšties sinrezėje. Šios medžiagos yra sinovinio skysčio ir kremzlių sudėtinės dalys.

Gliukozamino priešuždegiminis poveikis yra įrodytas, bet nėra tiksliai žinoma koks jo veikimo mechanizmas.

Gliukozamino priešuždegiminis veikimas greičiausiai nėra susijęs su ciklooksigenaze. Gliukozaminas neturi inhibitorių kurie veiktų į prostaglandinų sintezę [NN].

1.8. Lietuvoje notifikuoti maisto papildai su gliukozaminu

Lietuvoje šuo metu yra notifikuoti 22 maisto papildai, kurių sudėtyje yra gliukozamino [35]. Taip pat yra registruoti 5 vaistiniai preparatai [29]. Lietuvoje notifikuotų maisto papildų farmacinės formos (Pav.4.):

 Tabletės yra notifikuotos 13 skirtingų sudėčių;

 Skysčiai yra notifikuoti 4 sudėčių;

 Kapsulės yra notifikuotos 3 sudėčių;

 Milteliai yra notifikuoti 2 sudėčių.

Pav. 4. Lietuvoje notifikuotų maisto papildų su gliukozaminu farmacinės formos [35].

Lietuvos rinkoje, gliukozamino papildai, yra įvežti iš Didžiosios Britanijos, JAV, Rumunijos, Kanados, Prancuzijos, Baltarusijos, Čekijos, Belgijos, Vengrijos, Latvijos, Olandijos. Tik vienas notifikuotas produktas su gliukozaminu yra gaminamas Lietuvoje [35].

Didžiąją dalį maisto papildų su gliukozaminu rinkos Lietuvoje sudaro sudėtiniai produktai. Dažniausiai gliukozamino papilduose randama chondroitino, net 12 iš 22 Lietuvoje notifikuotų maisto papildų. Devynios maisto papildų kompozicijos buvo užregistruotos savo sudėtyje, kaip pagrindinę veikliają medžiaga, turinčios gliukozaminą [35].

1.9. Gliukozaminui tirti naudojami metodai:

1.9.1.Efektyvioji skysčių chromatografija

Efektyvioji skysčiu chromatografija kitaip ESC, tai vienas populiariausių analizės metodų naudojamų įvairiose srityse [36]. Šis metodas susideda iš pagrindinių 2 dalių: mobiliosios fazės ir stacionarios fazės. Šio metodo pagrindas - skirtingas įvairių medžiagų reagavimas su stacionaria faze.

13 4

3 2

Lietuvoje notifikuotų maisto papildų su gliukozaminu

farmacinės formos

Metodas išskirsto tirpalą į jo sudedamąsias dalis ir taip leidžia detektoriui jas aptikti po vieną. Yra didelis pasirinkimas detektorių, kurie gali būti pritaikyti kartu su kolonėle bei mobiliąja faze aptikti įvairias medžiagas [36].

Šio metodo stiprybės:

 Greitas;

 Didelis fazių ir detektorių pasirinkimas;

 Aukštas jautrumas;

 Puikus medžiagų atskyrimas, net esant mažoms koncentracijoms [36].

1.9.2. Plonasluoksnė chromatografija

Tai vienas paprasčiausių chromatografijos metodų, kurio metu inertinės plokštelės, kuri yra padengta sorbentu, paviršiumi keliauja judanti fazė ir su savimi nešasi mėginius. Metodas vykstas dėl skirtingo tiriamosios medžiagos ir mobilios fazės reagavimo su sorbentu [37].

Metodo eiga: ant plokštelės užnešamas mėginys ir plokštelė patalpinamą į chromatografijos kamerą, kuri yra užpildyta mobiliaja faze. Mobilioji fazė - tai dažniausiai lakus skystis, kuris palengva kildamas plokštele, kartu nusineša ir bandinį. Po plokštelės kildinimo ji džiovinama ir ryškinama. Taip pamatomos dėmes, kurios reprezentuoja medžiagas [37].

Metodo privalumai:

 Pigus - nereikalinga brangi įranga;

 Didelis mobilios fazės variacijų galimybės;

 Galima aptikti medžiagas kai po chromatografijos jas dar reikia apdoroti papildomais regentais [37].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo planavimas

Prieš pradedant tyrimą buvo sudarytas planas, kurio laikantis buvo atliekami tyrimai:

1. Pasirinkti 5 skirtingų gamintojų maisto papildus kurių sudėtyje yra gliukozamino. 2. Pritaikyti tinkamiausius analizės metodus.

3. Atlikti skirtingų gliukozamino turinčių mėginių kiekybinę ir kokybinę analizę 4. Metodikos validacija.

5. Rezultatų analizė.

Tyrimas buvo atliekamas plonasluoksnės chromatografijos bei efektyviosios skysčių chromatografijos metodais. Abiem šias būdais buvo tikrinama kokybinė ir kiekybinė gliukozamino koncentracija maisto papilduose.

2.2. Tyrimo objektas

Lietuvoje notifikuoti maisto papildai, sudėtyje turintys gliukozamino.

2.3. Tiriamų maisto papildų sudėtis

Buvo pasirinkti 5 gamintojų gliukozamino maisto papildai: keturių iš jų farmacinė forma buvo tabletės, vieno - šnypščiosios tabletės, tirpios vandenyje.

Maisto papildo Nr. 1 sudėtis:

Veikliosios medžiagos: Kiekis (mg) Gliukozamino sulfatas 750,00 Chondroitino sulfatas 50,00 Pluoštinės bosvelijos (Boswellia

serrata) ekstraktas

75,00 Juodasis pipiras (Piper nigrum) 7,50 II tipo kalogenas 10,00µg Vitaminas C 6,00 Baltojo gluosnio (Salix alba) ekstraktas 80,00 Kurkuminas (Curcuma longa) 50,00

Manganas 0,30 Pagalbinės medžiagos:

 Lipnumą reguliuojančios medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, kalcio karbonatas, talkas.

 Stabilizatoriai: hidroksipropilmetilceliuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos.

 Dažikliai: titano dioksidas, geležies oksidas.

 Drėgmę išlaikanti medžiaga: glicerolis.

Maisto papildo Nr. 2 sudėtis:

Veikliosios medžiagos: Kiekis (mg) Gliukozamino sulfatas 1000,00 Chondroitino sulfatas 200,00 MSM (Metilsilfonilmetanas) 278,00 Kalogenas 200,00 Imbieras (Zingiber officinale) 200,00 Citrusinių bioflavanoidų kompleksas 200,00 Pagalbinės medžiagos:

 Užpildas mikrokristalinė celiuliozė.

 Lipnumą reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas.

 Glajinė medžiaga hidroksipropilmetilceliuliozė.

 Lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių magnio druskos.

 Glajinė medžiaga karnaubo vaškas.

Maisto papildo Nr. 3 sudėtis:

Veikliosios medžiagos: Kiekis (mg) Gliukozamino sulfatas 600,00 Chondroitino sulfatas 200,00 Vitaminas C 120,00 MSM (Metilsilfonilmetanas) 100,00 Pagalbinės medžiagos:

 Užpildas mikrokristalinė celiuliozė.

 Lipnumą reguliuojanti medžiaga dikalcio fosfatas.

 Stabilizatoriai skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė ir hidroksipropilceliuliozė, magnio stearatas.

 Lipnumą reguliuojančios medžiagos riebalų rūgščių magnio druskos ir silicio dioksidas.

 Užpildas stearino rūgštis.

Maisto papildo Nr. 4 sudėtis:

Veikliosios medžiagos: Kiekis (mg) Gliukozamino sulfatas 600,00 Chondroitino sulfatas 100,00 Vitaminas C 40,00 Pagalbinės medžiagos:

 Užpildas mikrokristalinė celiuliozė.

 Glajinė medžiaga hidroksipropilmetilceliuliozė.

 Dažiklis titano dioksidas.

 Emulsiklis polietilenglikolis.

 Užpildas celiuliozė.

 Lipnumą reguliuojanti medžiaga talkas.

 Emulsiklis polioksietileno sorbitano monooleatas (polisorbatas 80).

 Užpildas skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė.

 Lipnumą reguliuojanti medžiaga riebalų rūgščių magnio druskos.

Maisto papildo Nr. 5 sudėtis:

Veikliosios medžiagos: Kiekis (mg) Gliukozamino sulfatas 500,00 Chondroitino sulfatas 500,00 Pagalbinės medžiagos:

Lipnumą reguliuojančios medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, kalcio karbonatas, talkas;

Stabilizatoriai: hidroksipropilmetilceliuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos;

Dažikliai: titano dioksidas, geležies oksidas; Drėgmę išlaikanti medžiaga: glicerolis,

Didžiausias deklaruojamas gliukozamino kiekis yra maisto papilde Nr.2, o mažiausias - maisto papilde Nr.5 (Pav. 5).

Pav. 5. Deklaruojamas gliukozamino kiekis tiriamuose maisto papilduose

2.4. Tyrime naudotos medžiagos ir įranga

2.4.1. Tyrime naudotos medžiagos:

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodams:

1. Išgrynintas vanduo (Ph. Eur.01/2008:0008, LSMU laboratorija); 2. 99,9 % Metanolis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija) 3. 99,9 % Dichlormetanas (Carl Roth GmbH+Co, Vokietija) 4. 99,0 % 1-butanolis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija) 5. 99,7 % Acto rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija) 6. Gliukozamino sulfatas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodams:

1. 99,8 % Acetonitrilas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija) 2. Išgrynintas vanduo (Ph. Eur.01/2008:0008, LSMU laboratorija) 3. Gliukozamino sulfatas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)

2.4.2. Tyrime naudota įranga

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodams:

1. Svarstyklės Shimadzu UniBloc AUW220D (Shimadzu corp., Japonija);

2. Chromatografinės aliuminio plokštelės HPTLC Silica Gel 60 F254 10x10 cm (Merck

KGaA, Vokietija);

3. Mėginių užnešiklis CAMAG Linomat 5 įranga (Camag, Šveicarija); 4. Stiklo kameros su šlifuoto stiklo dangčiais CAMAG (Camag, Šveicarija);

0 200 400 600 800 1000 1200 Nr. 5 Nr. 4 Nr. 3 Nr. 2 Nr. 1

Deklaruojamas gliukozamino kiekis tiriamuose maisto

papilduose

5. Šildytuvas CAMAG TLC Plate Heater (Camag, Šveicarija);

6. Vaizdo gavimo ir dokumentavimo sistema CAMAG TLC visualizer (Camag, Šveicarija).

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodams:

1. Svarstyklės Shimadzu UniBloc AUW220D (Shimadzu corp., Japonija); 2. Chromatografas Waters e2695 (Waters®,Jungtinės Amerikos Valstijos);

3. Detektorius Waters 2998 PDA, 190 – 500 nm bangų ilgio diapozonas (Waters®, Jungtinės Amerikos Valstijos);

4. Detektorius Waters 2424 (Waters®,Jungtinės Amerikos valstijos)

5. Kolonėlė ACE 5 C18 250 x 4,6 mm id (Advanced chromatography technologies Ltd., Škotija)

6. Kolonėlė BGB Li Chrospher 100 Diol 5µm 250x4mm (BGB Analytic, Voketija); 7. Programinė įranga Empower 3 (Jungtinės Amerikos Valstijos).

2.5. Tyrimo metodai

2.5.1. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodika paremta Sullivan C et al. (2005) atliktu tyrimu [36].

Mėginių paruošimas

Mėginai buvo ruošiami pirmiausiai tabletes susmulkinant grūstuvėje, tada grūstuvės turinys buvo perkeltas į 100 ml matavimo kolba ir užpilant 70 ml išgryninto vandens. Maišoma magnetine maišykle 90 minučių. Po maišymo tirpalas buvo praskiestas išgrynintu vandeniu iki ribos ir vėl paliekamas maišyti magnetine maišykle 30 minučių. Po maišymo tirpalas buvo filtruojamas per popieriaus filtrą. Pavyzdžiai plonasluoksnės chromatografijos metodui buvo paruošiami naudojant 100µL gliukozamino tirpalo ir 650µL tirpalo kurį sudare metanolis ir išgrynintas vanduo santykiu 85:15. Kiekių matavimui buvo naudojamos automatinės pipetės.

Standarto paruošimas

Standartas buvo paruoštas gliukozamino miltelius tirpinant vandenyje. Buvo pagamintas 5mg/ ml tirpalas. Tada jis buvo skiedžiamas taip pat kaip ir kiti mėginiai: 100µL tirpalo praskiesta 650µL tirpalo kurį sudarė metanolis ir išgrynintas vanduo santykiu 85-15.

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos kamerų paruošimas

Norint atlikti bandinių analizę buvo naudojamos dvi kameros:

Pirma kamera buvo užpildyta dichlormetanu ir metanoliu santykiu 1:1.

Antra kamera buvo užpildyta 1-butanoliu, ledine acto rūgštimi ir išgrynintu vandeniu santykiu 3:1:1.

Ryškinamojo regento paruošimas

Plokštelei ryškinti buvo naudojamas ninhidrino regentas kuris buvo paruoštas 0,03g ninhidrino tirpinant 10ml 1-butanolio sumaišyto su 0,3ml ledinės acto rūgšties.

Bandymo eiga

Bandymas buvo atliekamas traukos spintoje dėl bandymui naudotų lakiujų medžiagų. Buvo pasirinkta 10x10cm dydžio silikagelio plokštelė. Pirmiausia buvo naudojama pirma kamera, užpildyta dichlormetanu ir metanoliu santykiu 1:1, kurioje plokštelė buvo valoma nuo galimo užteršimo judančiąją fazę užkildinant iki pat viršaus. Tada plokštelė buvo džiovinama traukos spintoje, kol visiškai išdžiuvo. Ant plokštelės buvo užnešti mėginiai, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją. Mėginiai buvo užnešti 5mm ilgio juostelėmis po 2 µL. Tarp mėginių buvo palikti 5mm tarpai, taip pat 1,0cm tarpai nuo plokštelės kraštų ir 1,5cm tarpas nuo plokštelės apačios.

Po užnešimo plokštelė buvo patalpinta į antrają kamerą, užpildytą 1-butanoliu, ledine acto rūgštimi ir išgrynintu vandeniu santykiu 3:1:1, kur buvo kildinama 10 cm. Po kildinimo pabaigos plokštelė buvo išimama iš kameros ir džiovinama traukos spintoje 10 min. Po to ji buvo apipurkšta ryškinamuoju reagentu (ninhidrino tirpalu) ir kaitinama ant kaitlentės 115o

Ctemperatūroje 10 min arba kol pilnai išryškėjo raudonos dėmės. Rezultatai buvo stebimi naudojant vaizdo gavimo ir dokumentavimo sistemą CAMAG TLC visualizer (Šveicarija).

Kiekybinis nustatymas

Kiekybinis nustatymas buvo atliekamas pagal identifikavimo metodiką. Kiekiai buvo vertinami pagal sudarytą kalibracinę kreivę.

Kalibracinės kreivės paruošimas

Kalibracinė kreivei buvo brėžiama naudojant penkis skirtingos koncentracijos taškus. Pirminis tirpalas buvo paruošiamas 5mg/ml koncentracijos. 300µL šio tirpalo praskiesta su 1950µL tirpalo, kurį sudare metanolis ir išgrynintas vanduo santykiu 85:15. Buvo naudojama automatinė pipetė.

Po pirmojo praskiedimo iš pirmojo tirpalo buvo paimtas 1ml ir praskiesta su 1 ml 85:15 metanolio:vandens tirpalo. Iš šio tirpalo vėl paimtas 1ml ir skiesta taip pat. Tai buvo pakartota penkis kartus kol buvo gauti visi norimi taškai kalibracinei kreivei sudaryti (Lentelė 1).

1 lentelė. Gliukozamino tirpalų koncentracijos kalibracinei EPC kreivei sudaryti

Kalibracinės kreivės taškas Koncentracija mg/ml

Taškas Nr1 3,75 Taškas Nr2 1,875 Taškas Nr3 0,9375 Taškas Nr4 0,4687 Taškas Nr5 0,2344

2.5.2. Efektyvioji skysčių chromatografija Metodika Nr.1

Mėginių paruošimas

Tabletės buvo sutrinamos grūstuvėje ir suberiamos į 100 ml matavimo kolba. Į kolba buvo įpilama 20 ml išgryninto vandens ir maišoma magnetine maišykle 60 minučių. Po tirpinimo matavimo kolbos buvo pripilamos iki 100ml ribos ir vėl maišomos 20 minučių. Kadangi tabletėse yra medžiagų, kurios nėra tirpios vandenyje, po tirpinimo tirpalai buvo filtruojami per filtravimo popierių [37, 36].

Standarto paruošimas

Standartas buvo paruošiamas atsveriant 1g gliukozamino standarto miltelių ir ištirpinant 10ml išgryninto vandens [37, 36].

Bandymo eiga

Analizė buvo atliekama chromatografu Waters e2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 2998PDA. Naudota kolonėlė BGA Li Chrospher 100 Diol. Jos ilgis 250mm, skersmuo 4mm, Sorbento dalelių dydis 5µm. Termostate palaikyta 75ºC temperatūra. Bandymas truko 15min. Naudota eliuentų sistema vanduo + acetonitrilas (2 lentelė).

Metodika Nr.2

Mėginių ir standarto paruošimas

Mėginiai ir standartas buvo paruošti tokiu pačiu būdu kaip ir pirmajame ESC analizės metode.

Bandymo eiga

Bandymas buvo atliktas naudojantis Waters e2695 chromatografu su detektoriumi Waters 2424. Naudota kolonėlė BGA Li Chrospher 100 Diol. Jos ilgis 250mm, skersmuo 4mm, Sorbento dalelių dydis 5µm. Termostate palaikyta 75ºC temperatūra. Bandymas truko 15min. Injekcijos tūris - 10 µm. Naudota eliuentų Sistema vanduo + acetonitrilas, kurie buvo leidžiami per kolonėlę santykiu, parodytu lentelėje (2 lentelė).

2 lentelė. Eliuentų gradiento kitimas

Laikas (min) Acetonitrilas (%) Išgrynintas vanduo (%)

1-6 90 10 7 90 10 8-9 50 50 10 50 50 11-14 90 10 15 90 10 Kiekybinis nustatymas

Kiekybinis nustatymas buvo atliekamas pagal identifikavimo metodiką, tik buvo vertinama pagal sudarytą kalibracinę kreivę.

Kalibracinės kreivės taškų paruošimas

Kalibracinei kreivei sudaryti buvo naudoti penki skirtingų koncentracijų taškai. Pradinis standarto tirpalas buvo paruoštas 5mg/ml ir tada skiedžiama: 1ml tirpalo sumaišoma su 1ml išgryninto vandens. Iš šio praskiesto tirpalo paimamas 1ml ir praskiedžiama su 1 ml išgryninto vandens. Tai pakartojama penkis kartus kol paruošiami penki skirtingų koncentracijų tirpalai (3 lentelė).

3 lentelė. Gliukozamino tirpalų koncentracijos kalibracinei ESC kreivei sudaryti Kalibracinės kreivės taškas Koncentracija

Nr 1 2,30

Nr 2 1,15

Nr 3 0,79

Nr 4 0,50

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Gliukozamino identifikavimas

3.1.1. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija

Pritaikiu efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą buvo nustatyta, kad visuose penkiuose mėginuose yra gliukozamino. Ninhidrinu išryskinus chromatografijos plokštelę (Pav. 6) išryškėjo gliukozaminui būdingos raudonos dėmės, atitinkančios standartą.

Pav.6. Gliukozamino tapatybės nustatymas maisto papilduose. EPC plokštelės vaizdas. Atliekant bandymą žymės išryškėja ties ~4cm riba. Apskaičiavus standarto ir tiriamų mėginių Rf, buvo nustatyta, kad didžiausias Rf skirtumas buvo mėginių Nr.3 ir Nr.5 (atitinkamai -0,5 % ir +0,5 %), tačiau tai labai mažas skirtumas, todėl gliukozamino tapatybė visuose mėginiuose buvo patvirtinta (4 lentelė).

4 lentelė. Apskaičiuotos gliukozamino standarto ir mėginių Rf reikšmės

Tiriamasis mėginys Rf reikšmė

Gliukozamino standartas 0,397 Nr.1 0,398 Nr.2 0,396 Nr.3 0,395 Nr.4 0,397 Nr.5 0,399

Norint įsitikinti, kad gauti rezultatai yra tikslūs, o metodika patikima ir atkartojama, bandymai tomis pačiomis sąlygomis buvo atliekami 3 kartus. Pakartotinių tyrimų rezultatai: Rf aritmetiniai vidurkiai su standartiniu nuokrypiu ir paklaida, pateikiami lentelėje (5 lentelė).

5 lentelė. Gliukozamino identifikavimo naudojant EPC rezultatai Tiriamasis meginys Rf vidurkis Standartinis nuokrypis Paklaida Pasikliautinis intervalas Nr. 1 0,392 0,032 0,0036(0,91 %) 0.360 - 0.424 Nr. 2 0,390 0,037 0.0041(1.05 %) 0.353 – 0.427 Nr. 3 0,389 0,042 0.0047(1.19 %) 0.347 – 0.431 Nr. 4 0,395 0,048 0.0053(1.35 %) 0.347 – 0.443 Nr. 5 0,397 0,023 0.0026(0.64 %) 0.374 – 0.420

3.2.1.Efektyvioji skysčių chromatografija

Gliukozamino identifikavimas iš pradžių buvo atliktas pagal metodiką Nr. 1 (su Waters 2998

PDA,detektoriumi), tačiau nepavyko gauti tikslių rezultatų, dėl to šį detektorių buvo nuspręsta pakeisti

į Waters 2424 detektorių (metodika Nr.2).

Šiuo metodu atliekant gliukozamino identifikavimą buvo nustatyta, kad standarto sulaikymo laikas yra 11,093 min (Pav.7).

Pav.7. Gliukozamino standarto chromatograma

Ištyrus paruoštus tiriamų maisto papildų mėginius (tirpalus) buvo nustatyta, kad šis laikas sutampa su gliukozamino standartu. Gliukozamino standarto ir tiriamų mėginių sulaikymo laikai pateikti lentelėje (6 lentelė.)

6 lentelė. ESC gliukozamino standarto ir tiriamų mėginių sulaikymo laikai

Mėginio numeris Tiriamasis mėginys Sulaikymo laikas

1 Gliukozamino standartas 11,093 2 Nr.1 11,097 3 Nr.2 11,101 4 Nr.3 11,104 5 Nr.4 11,091 6 Nr. 5 11,092

3.2. Validacija

Validacija yra naudojama norint apibrėžti tam tikrus reikalavimus ir patvirtinti, kad naudojamas metodas yra tinkamas atlikti analizei. Validacija turi būti atliekama visiems analizės metodams, norint įrodyti jų tinkamumą kiekybiniam vienos ar kitos medžiagos nustatymui mėginiuose.

Pagrindiniai validacijos parametrai:

1. Specifiškumas - gebėjimas išskirti reikiamą medžiagą iš bandinio.

2. Preciziškumas - rezultatų kitimas tiriant mėginius pagal nustatytas sąlygas.

3. Tiesiškumas - tai metodikos gebėjimas aptikti tikslią koncentraciją mėginyje, kurio koncentracija yra išlanksto žinoma.

4. Aptikimo ribos - tai yra mažiausia koncentracija mėginio kuris yra vis dar aptinkamas naudojant aprašytą metodiką.

5. Kiekybinio nustatymo ribos - tai mažiausia koncentracija medžiagos bandinyje, kurią galime aptikti ir įvertinti kiekybiškai.

3.2.1. Gliukozamino kiekybinio vertinimo ESC metodu validacija. Specifiškumas

Specifiškumas buvo vertinamas pagal bandymu metu gautų analičių absorbcijos spektrus ir sulaikymo laikus.

7 lentelė. Gliukozamino standarto ir tiriamųjų mėginių ESC sulaikymo laikai

Tiriamasis mėginys Sulaikymo laikas

Gliukozamino standartas 11,093 Nr.1 11,097 Nr.2 11,101 Nr.3 11,104 Nr.4 11,091 Nr. 5 11,092

Pagal lentelėje užfiksuotus rezultatus galima teigti jog metodika yra specifiįka gliukozaminui, nes mėginių sulaikymo laikas atitinka standarto sulaikymo laikui (7 lentelė).

Tiesiškumas

Norint nustatyti tiesiškumą, reikia sudaryti gradavimo grafiką. Siekiant sudaryti gradavimo grafiką, bandyme buvo naudoti 5 skirtingų koncentracijų standarto tirpalai. Šių tirpalų koncentracijos svyravo nuo 0,19mg/ml iki 2,30mg/ml.

Gliukozamino sulfato kalibracinės kreivės (Pav. 8.) koreliacijos koeficientas artimas 1 (0,999). Dėl šios priežasties galima teigti, kad yra tiesinė priklausomybė.

Pav. 8. Gliukozamino sulfato ESC kalibracinė kreivė

Glaudumas

Norint įvertinti metodo glaudumą, reikia įvertinti jo pakartojamumą ir atkartojamumą.

Pakartojamumas buvo tiriamas tiriant gliukozamino mėginį ta pačią dieną, tokiomis pačiomis sąlygomis.

Atkartojamumas buvo tiriamas identiškomis sąlygomis, tačiau po ilgesnio laiko tarpo - po 2 ir po 4 dienų.

Mėginiai buvo injekuojami po 5 kartus per dieną. Abu rodikliai buvo vertinami pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN). SSN turi būti ne daugiau nei 5 proc.

Vykdant bandymus gauta 0,6 % pakartojamumo (Pav. 9) SSN ir 1,3 % SSN atkartojamumas. Abu rodikliai yra žemesni nei 5 % todėl galima teigti, jog metodo pakartojamumas ir atkartojamumas yra tinkami.

Pav.9. ESC metodikos pakartojamumas

Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos

Aprikimo riba - tai mažiausia koncentracija, kuriai esant tirpale įmanoma nustatyti ieškomos medžiagos buvimą. Šio tyrimo aptikimo riba - 0,097µg/ml.

Kiekybinio nustatymo riba - tai mažiausias kiekis medžiagos analizuojamame mėginyje kuris gali būti kiekybiškai nustatytas. Kiekybinio nustatymo riba šiame tyrime - 0,183µg/ml.

3.2.2. Gliukozamino kiekybinio vertinimo EPC metodu validacija. Specifiškumas

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos specifiškumas buvo vertinamas pagal Rf, lyginant tiriamuosius mėginius su etaloniniu tirpalu (8 lentelė).

8 lentelė. Gliukozamino standarto ir tiriamųjų mėginių Rf reikšmės Tiriamasis mėginys Rf reikšmė

Gliukozamino standartas 0,397 Nr.1 0,398 Nr.2 0,396 Nr.3 0,395 Nr.4 0,397 Nr.5 0,399

Pagal tyrimu nustatytus duomenis galima teigti jog efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodo specifiškumas yra aukštas. Tai parodo nedidelis tiriamų mėginių Rf nuokrypis nuo standarto Rf.

Tiesiškumas

Kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas artimas 1 (0,999), todėl galima teigti, jog yra tiesinė priklausomybė. Gradavimo grafikui sudaryti buvo pasirinkta pagaminti 5 skirtingų koncentracijų gliukozamino sulfato tirpalus. Kalibracinės kreivės tyrimui naudota silikagelio plokštelė pavaizduota Pav.10, o kalibracinė kreivė pavaizduota Pav.11.

Pav.10. Gliukozamino standartinių tirrpalų chromatograma kalibracinei kreivei sudaryti

Glaudumas

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodui taip pat buvo vertinamas pakartojamumas ir atkartojmamumas. Šie kriterijai:

 Pakartojamumo SSN - 1,0 %.

 Atkartojamumo SSN - 1,6 %.

Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos

Aptikimo riba - 0,197µg/ml

Kiekybinio nustatymo riba - 0,375 µg/ml

3.3. Gliukozamino kiekybinis nustatymas

Gliukozaminas mėginuose buvo nustatinėjamas ESC ir EPC metodais.

3.3.1. Kiekybės nustatymas efektyviąja skysčių chromatografija

Rezultatai buvo apskaičiuoti pagal sudarytą matematinę formulę. Kalibracinė kreivė buvo sudaryta iš 5 žinomos koncentracijos mėginių. Apskaičiavus rezultatus jie buvo surašyti į lentelę (9 lentelė). Joje rezultatai pateikti su nuokrypiu, išreikštu procentais (lyginant su ant pakuotės pateikta informacija). Visi gauti rezultatai buvo atitinkamai paversti į kiekį, kuris buvo vienoje tabletėje.

9 lentelė. Gliukozamino ESC kiekybinės analizės rezultatai

Iš gautų rezultatų galima teigti, jog nei viename iš ištirtų maisto papildų nebuvo aptiktas visas deklaruojamas gliukozamino kiekis. Kadangi deklaruojamas kiekis įvairiuose maisto papilduose skiriasi, maisto papildai tarpusavyje lyginami procentiniu nuokrypiu (Pav. 12). Didžiausias nuokrypis buvo rastas mėginyje Nr. 3 – 21.70 % mažiausias nuokrypis rastas mėginyje Nr. 1 – 4,03 %.

Mėginio numeris Deklaruojamas kiekis Rastas kiekis Procentinis nuokrypis Nr.1 750mg 720,02mg 4,03 %

Nr.2 1000mg 785,68mg 21.50 % Nr.3 600mg 470,42mg 21.70 % Nr.4 600mg 511,37mg 14.83 % Nr.5 500mg 410,12mg 18.00 %

Pav.12. Gliukozamino ESC rezultatų palyginimas su ant pakuotės pateikta informacija

3.3.2. Kiekybės nustatymas plonasluoksne chromatografija

Kiekybinis nustatymas buvo atliktas pagal ankstesniame skyrelyje aprašytą plonasluoksnės chromatografijos tyrimo metodiką.

Rezultatai buvo apskaičiuoti išvedus kalibracinės kreivės formulę. Kalibracinė keivė buvo sudaryta iš penkių taškų kurių rezultatai buvo gauti atliekant analizę su penkiais žinomos skirtingos koncentracijos standarto tirpalais. Apskaičuoti rezultatai buvo perskaičuoti į gliukozamino kiekį vienoje tabletėje. Gauti rezultatai surašyti lentelėje (10 lentelė).

10 lentelė. Gliukozamino EPC kiekybinės analizės rezultatai

Kaip ir vertinant ESC rezultatus, iš gautų EPC rezultatų galima teigti, jog nei vienas mėginys savo sudėtyje neturėjo ant pakuotės deklaruojamo gliukozamino sulfato kiekio. Mažiausias nuokrypis buvo gautas maisto papilde Nr. 1 - 5.50 %, o didžiausias nuokrypis pastebėtas mėginyje Nr. 3 - 23,0 %. Nustatyto kiekio ir deklaruoto kiekio skirtumai pateikti diagramoje (Pav.13).

0 200 400 600 800 1000 1200 Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Deklaruotas kiekis (mg) Nustatytas kiekis (mg)

Mėginio numeris Deklaruojamas kiekis Rastas kiekis Procentinis nuokrypis Nr.1 750mg 709.25mg 5,50 %

Nr.2 1000mg 798.15mg 20.10 % Nr.3 600mg 462.52mg 23.00 % Nr.4 600mg 498.65mg 17.00 % Nr.5 500mg 426.32mg 14.80 %

Pav.13. Gliukozamino EPC rezultatų palyginimas su ant pakuotės pateikta informacija

3.3.3. Procentinio nuokrypio palyginimas tarp ESC ir EPC

Nors buvo nustatyta, kad EPC ir ESC metodai turi gerą atkartojamumą ir pakartojamumą, tačiau jais gauti tų pačių maisto papildų gliukozamino sulfato kiekiai, o tuo pačiu ir nuokrypiai nuo deklaruojamo kiekio skiriasi (Pav.14). Mėginiuose Nr.1, Nr.3 ir Nr.4 didesnis gliukozamino kiekis nustatytas efektyviąja plonasluoksne chromatografija, o mėginiuose Nr. 2 ir Nr.5 – ESC metodu. Šių nuokrypių skirtumai svyruoja nuo 1,3 % iki 3,2 %.

Pav. 14. Gliukozamino ESC ir EPC procentinio nuokrypio palyginimas

0 200 400 600 800 1000 1200 Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Deklaruotas kiekis (mg) Gautas kiekis (mg) 0 5 10 15 20 25 Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 Nr.5 PC rezultatų procentinis nuokrypis

ESC rezultatų procentinis nuokrypis

4. IŠVADOS

1. Remiantis moksline literatūra buvo parinkti ir pritaikyti ESC bei EPC metodai. ESC metodui buvo nuspręsta naudoti Waters 2424 ELS detektorių, nes juo buvo gauti tikslesni ir geriau atkartojami rezultatai.

2. Kadangi tiek ESC, tiek EPC metodu buvo vykdomi kiekybiniai tyrimai, validacija buvo atlikta abiems metodams. Nustatyta, kad abu metodai yra pakankamai tikslūs kiekybiniam gliukozamino nustatymui maisto papilduose.

3. Identifikuojant gliukozaminą tiek ESC, tiek EPC metodu visuose 5 mėginiuose buvo nustatytas gliukozaminas.

4. Kiekybiškai nustatant gliukozaminą buvo nustatyta, kad gliukozamino kiekis maisto papilduose: Nr.1 709mg; Nr.2 798mg; Nr.3 462mg; Nr.4 498mg; Nr.5 426mg;

5. Lyginant gautus rezultatus su ant pakuotės gamintojų deklaruojamu kiekiu buvo nustatyta, kad didžiausias procentinis nuokrypis buvo Nr.3- 23 % o mažiausias Nr.1- 5.5 %.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Norint tiksliai ir efektyviai nustatyti gliukozaminą, tyrimams rekomenduojame naudoti ESC metodą laikantis šių salygų: Waters 2424 ELS detektorius ir BGA Li Chrospher 100 Diol kolonėlė.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1 European Pharmacopoeia Online 9.8th-ed. Council of Europe. Strasbourg; 2018. Prieiga per internetą : http://online6.edqm.eu/ep808/

2. Foot M, Mulholland M. Classification of chondroitin sulfate A, chondroitin sulfate C, glucosamine hydrochloride and glucosamine 6 sulfate using chemometric techniques. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2005;38(3):397-407.

3. KWON H, AHN B, CHOI Y, JIN S, CHEONG K, LEE J et al. Combination of glucosamine improved therapeutic effect of low-dose cyclosporin A in patients with atopic dermatitis: A pilot study. The Journal of Dermatology. 2013;40(3):207-210.

4. ARDEN N, NEVITT M. Osteoarthritis: Epidemiology. Best Practice & Research Clinical Rheumatology. 2006;20(1):3-25.

5. Glucosamine 6-sulfate [Internet]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2019. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/72361

6. Fosdick L, Bohlmann J, Trinkle J, Ray B. US7816514B2 - Glucosamine and method of making glucosamine from microbial biomass - Google Patents [Internet]. Patents.google.com. 2011. Available from: https://patents.google.com/patent/US7816514B2/en

7. Benavente M, Arias S, Moreno L, Martínez J. Production of Glucosamine Hydrochloride from Crustacean Shell. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2015;3(1).

8. Chmielowski R, Wu H, Wang S. Scale-up of upstream and downstream operations for the production of glucosamine using microbial fermentation. Biotechnology Journal. 2007;2(8):996-1006. https://www.sps.nhs.uk/articles/about-ukmi-medicines-qas/ Date prepared: June 2017

9. Kucharz E, Kovalenko V, Szántó S, Bruyère O, Cooper C, Reginster J. A review of glucosamine for knee osteoarthritis: why patented crystalline glucosamine sulfate should be differentiated from other glucosamines to maximize clinical outcomes. Current Medical Research and Opinion. 2016;32(6):997-1004.

10. Rindone J. Randomized, controlled trial of glucosamine for treating osteoarthritis of the knee. Western Journal of Medicine. 2000;172(2):91-94.

11. Fransen M, Agaliotis M, Nairn L, Votrubec M, Bridgett L, Su S et al. Glucosamine and chondroitin for knee osteoarthritis: a double blind randomised controlled clinical trial evaluating single and combination regimens. Osteoarthritis and Cartilage. 2014;22:S457.

. 12. Wilkens P, Scheel I, Grundnes O, Hellum C, Storheim K. Effect of Glucosamine on Pain-Related Disability in Patients With Chronic Low Back Pain and Degenerative Lumbar Osteoarthritis. JAMA. 2010;304(1):45.

13. Petersen S, Beyer N, Hansen M, Holm L, Aagaard P, Mackey A et al. Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drug or Glucosamine Reduced Pain and Improved Muscle Strength With Resistance Training in a Randomized Controlled Trial of Knee Osteoarthritis Patients. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 2011;92(8):1185-1193.

14. Sherman A, Ojeda-Correal G, Mena J. Use of Glucosamine and Chondroitin in Persons With Osteoarthritis. PM&R. 2012;4:S110-S116.

15. Miller K, Clegg D. Glucosamine and Chondroitin Sulfate. Rheumatic Disease Clinics of North America. 2011;37(1):103-118.

16. Kirkham S, Samarasinghe R. Review Article: Glucosamine. Journal of Orthopaedic Surgery. 2009;17(1):72-76.

17. Miller K, Clegg D. Glucosamine and Chondroitin Sulfate. Rheumatic Disease Clinics of North America. 2011;37(1):103-118.

18. Knee Osteoarthritis Diagnosis [Internet]. Practical Pain Management. 2019. Available from:

https://www.practicalpainmanagement.com/patient/conditions/osteoarthritis/knee-osteoarthritis/knee-osteoarthritis-diagnosis

19. Glyn-Jones S, Palmer A, Agricola R, Price A, Vincent T, Weinans H et al. Osteoarthritis. The Lancet. 2015;386(9991):376-387.

20. [Internet]. Sps.nhs.uk. 2019. Available from: https://www.sps.nhs.uk/wp-content/uploads/2017/08/UKMI_QA_Glucosamine_interactions_update_Jun-17.pdf

21. ORTH M, PETERS T, HAWKINS J. Inhibition of articular cartilage degradation by glucosamine-HCl and chondroitin sulphate. Equine Veterinary Journal. 2010;34(S34):224-229.

22. Qinna N, Shubbar M, Matalka K, Al-Jbour N, Ghattas M, Badwan A. Glucosamine Enhances Paracetamol Bioavailability by Reducing Its Metabolism. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2015;104(1):257-265.

23. Lippiello L, Woodward J, Karpman R, Hammad T. In Vivo Chondroprotection and Metabolic Synergy of Glucosamine and Chondroitin Sulfate. Clinical Orthopaedics and Related Research. 2000;381:229-240.

24. Calamia V, Mateos J, Fernández-Puente P, Lourido L, Rocha B, Fernández-Costa C et al. A pharmacoproteomic study confirms the synergistic effect of chondroitin sulfate and glucosamine. Scientific Reports. 2014;4(1).

25. Vasiliadis H, Tsikopoulos K. Glucosamine and chondroitin for the treatment of osteoarthritis. World Journal of Orthopedics. 2017;8(1):1.

26. Chondroitin sulfate [Internet]. Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. 2019. Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/24766

27. Loudon J, Seifert T, Shipman V. Sports Medicine and Concussion Management. Orthopaedic Physical Therapy Secrets. 2017;:172-182.

28. de Boer A, van Hunsel F, Bast A. Adverse food–drug interactions. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2015;73(3):859-865.

29. VVKT - Vaistai [Internet]. Vapris.vvkt.lt. 2019. Available from: https://bit.ly/2MbvV1W 30. Persiani S, Roda E, Rovati L, Locatelli M, Giacovelli G, Roda A. Glucosamine oral bioavailability and plasma pharmacokinetics after increasing doses of crystalline glucosamine sulfate in man. Osteoarthritis and Cartilage. 2005;13(12):1041-1049.

31. Qian S, Zhang Q, Wang Y, Lee B, Betageri G, Chow M et al. Bioavailability enhancement of glucosamine hydrochloride by chitosan. International Journal of Pharmaceutics. 2013;455(1-2):365-373.

32. Matheson A, Perry C. Glucosamine. Drugs & Aging. 2003;20(14):1041-1060.

33. Wu H, Liu M, Wang S, Zhao H, Yao W, Feng W et al. Comparative Fasting Bioavailability and Pharmacokinetic Properties of 2 Formulations of Glucosamine Hydrochloride in Healthy Chinese Adult Male Volunteers. Arzneimittelforschung. 2012;62(08):367-371.

34. Du J, White N, Eddington N. The bioavailability and pharmacokinetics of glucosamine hydrochloride and chondroitin sulfate after oral and intravenous single dose administration in the horse. Biopharmaceutics & Drug Disposition. 2004;25(3):109-116.

35. Notifikuoti maisto papildai Lietuvoje [Internet]. Vet.lt. 2019. Available from: http://www.vet.lt/maisto-papildai/

36,Sullivan C, Sherma J. Development and validation of an HPTLC-densitometry method for assay of glucosamine of different forms in dietary supplement tablets and capsules. 2005.

37. Zhou J, Waszkuc T, Mohammed F. Determination of glucosamine in raw materials and dietary supplements containing glucosamine sulfate and/or glucosamine hydrochloride by high-performance liquid chromatography with FMOC-Su derivatization: collaborative study. Journal AOAC International. 2005;88(4):1048-1058.