IN I ND DI IC CE E

IN I ND DI IC CE E

R

I

1TUMORI DEL COLON-RETTO

1.1 Caratteristiche anatomo-patologiche e cliniche 1

1.2 Terapia 5

1.2.1 Terapia adiuvante 6

1.2.2 Terapia sistemica del carcinoma non operabile 8 2 FARMACOGENETICA E FARMACOGENOMICA

2.1 Generalità 10

2.2 Determinanti genetici di chemiosensibilità nelle neoplasie 12 2.3 Applicazioni della genomica e dell’epigenomica alla medicina 15

2.3.1 Analisi dell’espressione genica 16

2.3.2 Studio dei polimorfismi del singolo nucleotide (SNPs) 17 3OXALIPLATINO

3.1 Caratteristiche generali 19

3.2 Meccanismo d’azione 19

3.3 Sistema di riparazione delle lesioni al DNA per escissione del nucleotide, Nucleotide Excision Repair (NER)

22 3.3.1 Il ruolo dell’endonucleasi Excisin Repair Cross

Complementig group 1 (ERCC1) 24

3.3.2 Il ruolo dell’endonucleasi Excisin Repair Cross

Complementig group 2 (ERCC2) 26

4PEMETREXED

4.1 Caratteristiche generali 29

4.2 Meccanismo d’azione 30

4.3 Determinanti molecolari dell’azione del pemetrexed 32

4.3.1 Timidilato sintetasi 33

4.3.2 Diidrofolato reduttasi 37

4.3.3 Glicinamide ribonulceotide formiltrasferasi 40 4.3.4 Poliglutammazione ad opera della folilpoliglutammato

sintetasi

42

4.5 Studi in vitro 44

P

S

5MATERIALI E METODI

5.1 Linee cellulari di carcinoma colorettale: HT29, SW620,

WiDr, LS174T 46

5.2 Analisi della citotossicità di oxaliplatino e pemetrexed 47 5.3 Studio dell’interazione farmacologica tra oxaliplatino e

pemetrexed 49

5.4 Studio citofluorimetrico della modulazione del ciclo cellulare

indotta da oxaliplatino e peemtrexed 50

5.5 Analisi dell’apoptosi 52

5.5.1 Analisi immunoenzimatica di Akt 52

5.5.2 Valutazione dell’indice apoptotico con microscopia a

fluorescenza 53

5.6 Analisi dell’espressione genica dei determinanti del meccanismo d’azione di oxaliplatino e pemetrexed

55 5.6.1 Reazione di retrotrascrizione dell’RNA in cDNA 55 5.6.2 Reazione di amplificazione a catena della polimerasi

(PCR)

56 5.6.3 Valutazione quantitativa dell’espressione genica 57 5.7 Analisi dei polimorfismi del singolo nucleotide con sonde TaqMan^®

58 5.8 Determinazione degli addotti oxaliplatino-DNA 61 6RISULTATI

6.1 Citotossicità di oxaliplatino e pemetrexed 63 6.2 Interazione farmacologica tra oxaliplatino e pemetrexed 65 6.3 Modulazione del ciclo cellulare indotta da oxaliplatino e

pemetrexed 66

6.4 Inibizione di Akt determinata da oxaliplatino e pemetrexed 68 6.5 Indice apoptotico di oxaliplatino, pemetrexed e delle loro

combinazioni 69

6.6 Risultati dello studio dell’espressione genica dei determinanti molecolari del pemetrexed

71 6.7 Risultati dello studio dell’espressione genica degli enzimi

appartenenti al sistema NER 73

6.8 Risultati della quantificazione degli addotti oxaliplatino-DNA 75 6.9 Correlazione tra SNPs, chemiosensibilità ed efficienza del

sistema di riparazione

76

C

BIBLIOGRAFIA 85