2 MATERIALI E METODI
2.1 Trasformazione di cellule di E. coli ed amplificazione del
DNA plasmidic
o
2.1.1 Trasformazione
I costrutti plasmidici sono stati ottenuti nel nostro laboratorio attraverso processi di clonazione che prevedono il legame di un gene o di una sua porzione ad un DNA plasmidico. E' necessario, perciò, amplificare il plasmide d’interesse per averne una quantità sufficiente, e ciò è possibile tramite la trasformazione di cellule batteriche competenti all'acquisizione del plasmide.
Le cellule di E. coli, ceppo DH5α, sono state rese chimicamente competenti o elettrocompetenti. Nel primo caso, si prende una colonia di DH5α e si fa crescere in 1 ml di LB in agitazione a 37°C o/n. La crescita viene poi inoculata in 100 ml di LB e messa ad agitare a 37°C fino a che la densità cellulare sia 4-7x107 cells/ml, ossia una OD550:
0.45-0.55. A questo punto la coltura viene messa in tubi di polypropylene da 50 ml, posti in ghiaccio per 10-15 min e centrifugati a 750-1’000g per 12-15 min a 4°C. Il precipitato (“pellet”) di cellule viene asciugato invertendo i tubi su una pila di carta e, se necessario, rimuovendo il liquido rimasto con una micropipetta. Il “pellet” viene poi risospeso in un volume della soluzione RF1 pari a 1/3 del volume iniziale; la sospensione cellulare viene incubata in ghiaccio per 15 min e centrifugata di nuovo come sopra. Il “pellet” ottenuto e asciugato si risospende in un volume di RF2 pari a 1/12.5 di quello originale. Le cellule vengono messe in ghiaccio per 15 min, aliquotate in tubi da 1.5 ml ghiacciati e conservate a -70°C fino al momento dell’uso.
Per trasformare le cellule batteriche con DNA plasmidico è sufficiente aggiungere, ad un’aliquota di 200 μl di cellule competenti, 10 ng di plasmide superavvolto e incubare in ghiaccio per 30 min. Segue un “heat-shock” a 42°C, per 45 sec, ed un’incubazione in ghiaccio per 5 min. Si aggiungono, successivamente, 800 μl di LB, si incuba nell’agitatore a 37°C per 60 min ed infine si piastrano le cellule su terreno solido selettivo (LB con agar e antibiotico appropriato). Dopo incubazione a 37°C per tutta la notte, sulla piastra Petri
compaiono le colonie: l’antibiotico fa sì che crescano solo le cellule che hanno assunto il plasmide poichè esso contiene il gene che conferisce resistenza a quell'antibiotico.
Ogni volta che si effettua una trasformazione, bisogna aver cura di controllare l’efficacia dell'antibiotico piastrando, in parallelo, 200 μl di cellule batteriche in assenza di DNA plasmidico.
L’altro tipo di cellule competenti utilizzate nel nostro laboratorio sono quelle elettrocompetenti. Queste ultime hanno un’efficienza di trasformazione più alta rispetto alle cellule chimicamente competenti, dell’ordine di 109-1010 colonie trasformate/μg di DNA, e per questo motivo vengono preferite nei clonaggi. Per la preparazione delle cellule elettrocompetenti si inocula 500 ml di brodo LB con 1/100 di volume di una coltura o/n fresca di DH5α. Le cellule vengono fatte crescere a 37°C in agitazione fino a che OD600=
0.4-0.5. A questo punto la beuta con 500 ml di crescita viene messa in ghiaccio per 30 min e poi viene raccolta in tubi per essere centrifugata in un rotore ghiacciato a 4’000g per 15 min. Si rimuove il più possibile il sopranatante tenendo presente che è meglio sacrificare qualche cellula rimasta in sospensione nel brodo che lasciare del sopranatante nel tubo. Il “pellet” di cellule viene risospeso in un volume di H2O ghiacciata pari a quello iniziale,
facendo attenzione a non lisare le cellule, e poi centrifugato di nuovo come prima. Nel passaggio successivo le cellule sono risospese in H2O ghiacciata in metà del volume di
partenza e nuovamente centrifugate. La risospensione viene fatta in 10% glicerolo (agente crioprotettivo) in 1/50 del volume iniziale, alla quale segue l'ultima centrifugata e la risospensione in un volume finale pari a 1/500 del volume di partenza. La concentrazione delle cellule dovrebbe essere di 1-3 x 1010 cells/ml. La sospensione cellulare viene aliquotata in 40 μl e conservata a -70°C.
Per la trasformazione delle cellule elettrocompetenti, si prende un’aliquota da -70°C e si mette immediatamente in ghiaccio. Precedentemente una cuvetta di 0.2 cm è stata preincubata in ghiaccio. La cuvetta ha la particolarità di avere su due dei suoi lati due elettrodi necessari per la conduzione del “pulse” alle cellule poste al suo interno. Una volta che si sono scongelate le cellule, aggiungiamo nel tubo 1-2 μl di DNA. Il DNA deve essere in una soluzione a bassa stringenza ionica come H2O o TE. A questo punto il
contenuto del tubo viene messo nella cuvetta ed elettroporato con questi parametri: 2’500 V, 25 μF, 200 Ω per una cuvetta di 0.2 cm (distanza tra gli elettrodi). Tale impostazione è molto importante, in quanto la sopravvivenza e la trasformazione delle cellule sono correlate all’intensità del campo (voltaggio/distanza tra gli elettrodi) e alla lunghezza del “pulse” (nel nostro caso è una funzione a tempo costante). Le cellule, una volta
elettroporate, vengono recuperate dalla cuvetta e fatte precrescere in 1 ml di LB a 37°C in agitazione per un’ora; infine si piastra la precrescita su terreno solido selettivo.
Soluzioni: Luria-Bertani Broth (LB) NaCl 1% Bacto-tryptone 1% Bacto-yeast extract 0,5% RF1 RbCl 100mM MnCl2 4H2O 50mM Acetato di potassio 30mM CaCl2·2H2O 10mM Glicerolo 15% (pH finale 5.80)
Aggiustare il pH a 5.8 con 0.2M acido acetico. Sterilizzare mediante filtrazione. RF2
MOPS 10mM
RbCl 10mM
CaCl2·2H2O 75mM
Glicerolo 15%
Aggiustare il pH a 6.8 con NaOH e sterilizzare per filtrazione.
TE
Tris-HCl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM
2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi
alcalina e cromatografia a scambio ionico
Questa metodica prevede l’uso di colonnine cromatografiche a scambio ionico commercialmente disponibili insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego. Con questa tecnica è possibile estrarre fino a 40 μg di DNA altamente purificato. Da una piastra di cellule di E. coli, recanti il plasmide di interesse, o da uno stock di batteri in glicerolo, viene effettuato in maniera sterile un inoculo di un clone che viene posto in un tubo FALCON da 50 ml contenente 10 ml di brodo di coltura LB con antibiotico specifico. Il tubo è incubato per 12-16 ore a 37°C in agitazione, affinchè la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene quindi centrifugata a 11’000g per 30 sec allo scopo di ottenere un pellet di cellule batteriche, che viene risospeso in 300 μl di “soluzione 1”. Alla suddetta sospensione si aggiungono 300 μl di “soluzione 2” e la miscela viene delicatamente mescolata per inversione. La reazione di lisi alcalina non deve procedere per una durata superiore a 5 min, trascorsi i quali si aggiungono 360 μl di “soluzione 3”, necessaria a far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA genomico e all’RNA ad alto peso molecolare, che ad esse sono associati. Inoltre genera le condizioni appropriate per legare il DNA plasmidico alla membrana della colonnina cromatografica. Dopo una centrifugazione di 10 min a 11’000g viene recuperato il sopranatante, contenente il DNA plasmidico, l’RNA a basso peso molecolare, le proteine batteriche. Il sopranatante viene caricato nella colonnina, posta all’interno di un tubo, e viene centrifugata per 1 min a 11’000g. Il DNA plasmidico così si ritrova legato alla membrana mentre le restanti molecole la attraversano e si ritrovano nel tubo. La soluzione nel tubo viene buttata e si aggiunge nella colonnina 600 μl di “soluzione 4” che rimuove sali, metaboliti, e macromolecole solubili. Si centrifuga per 1 min a 11’000g e si scarta il contenuto del tubo formato dai componenti sopra descritti. Tale centrifuga viene ripetuta per altri 2 min per eliminare residui di etanolo presenti nella “soluzione 4”. La colonnina, a questo punto, viene posta in un tubo da 1.5 ml e si aggiunge 50 μl di soluzione “AE” per eluire il DNA plasmidico. Si lascia incubare per 1 min a temperatura ambiente e poi si centrifuga per 1 min a 11’000g. Si ottiene così DNA plasmidico purificato nel tubo. La concentrazione di DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di Etidio (EtBr), insieme ad aliquote di preparazioni a concentrazione nota utilizzate come standard.
Soluzione 1 Tris-HCl 25 mM pH 8 EDTA 10 mM RNasi A 100 μg/ml Soluzione 2 NaOH 200 mM SDS 1% Soluzione 3 KAc 2.8 M pH 5.1 Soluzione 4 Tris 50 mM Etanolo 15% KCl 1.15 M Aggiustare a pH 6.3 con H3PO4 Soluzione AE Tris-HCl 5 mM pH 8.5
2.1.3 Estrazione di DNA plasmidico su scala media mediante lisi
alcalina e cromatografia a scambio ionico
La metodica è simile alla precedente ma in questo caso è possibile estrarre fino a 100 μg di DNA. Partendo da una coltura batterica di 100 ml, ottenuta dopo incubazione a 37°C in agitazione o/n, se il brodo di crescita è torbido si procede alla centrifugazione della stessa a 4’000 rpm per 10 min. Il “pellet” così ottenuto viene risospeso in 4 ml di soluzione S1; quindi si aggiungono 4 ml di S2, si capovolge delicatamente e si lascia a temperatura ambiente per 5 min. Dopo aver aggiunto 4 ml di soluzione S3 ed aver capovolto delicatamente per diverse volte si centrifuga a 4°C per 30 min a 30’000g. Si equilibra una colonna cromatografica, caricandola con 4 ml di soluzione N2 permettendone lo svuotamento per gravità e si carica quindi la colonna equilibrata con il lisato, per immobilizzare il DNA da parte della resina. Si libera il DNA dai sali e dall'RNA residuo mediante due lavaggi di 10 ml ciascuno con la soluzione N3. Si procede infine con
l'eluizione del DNA dalla colonna con 5 ml di soluzione N5. L'eluato viene precipitato, dopo aggiunta di 0.7V di isopropanolo, mediante centrifugazione a 4°C per 30 min a 15’000g. Il “pellet” viene lavato con EtOH al 70% e risospeso in 100 μl di H2O mQ o TE
pH 8.
Per stimare la quantità di DNA estratto, è possibile sottoporre un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio oppure, se si desidera ottenere una misura più precisa, si può ricorre a tecniche spettrofotometriche che prevedono la lettura dell’assorbanza alla lunghezza d’onda (λ) di 260 nm di campioni diluiti della preparazione di DNA in esame.
Soluzioni: S1 Tris-HCl 50 mM pH 8.0 EDTA 10 mM RNasi A 100 μg/ml S2 NaOH 200 mM SDS 1% S3 KOAc 2.8M pH 5.1 N2 Tris 100 mM Etanolo 15% KCl 900 mM Triton®X-100 0.15% Aggiustare a pH 6.3 con H3PO4 N3 Tris 100 mM Etanolo 15% KCl 1.15 M Aggiustare a pH 6.3 con H3PO4
N5
Tris 100 mM
Etanolo 15%
KCl 1 M
Aggiustare a pH 8.5 con H3PO4
2.1.4 Estrazione di DNA plasmidico con il metodo “ONE STEP”
“miniprep
Per l’analisi di un gran numero di campioni, i metodi di estrazione di DNA appena descritti risultano dispendiosi in termini economici e temporali. La “ONE STEP”, invece, è una procedura veloce e semplice, con l’inconveniente di ottenere un DNA meno purificato.
La coltura batterica è direttamente trattata con fenolo-cloroformio-alcool isoamilico, soluzione 25:24:1 a pH 8 e il DNA liberato viene precipitato con isopropanolo. Questa tecnica si basa sul fatto che le proteine sono più solubili in fase organica che in fase acquosa: fenolo e cloroformio denaturano le proteine, il cloroformio facilita la separazione delle fasi, mentre l’alcool isoamilico riduce la formazione di schiuma durante l'estrazione.
Si prende 0.5 ml di crescita batterica o/n, si aggiunge un ugual volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico e si agita con il “vortex” per 5 sec. Segue una centrifuga a 12’000g per 5 min al termine della quale si ha la separazione delle due fasi: una organica, contenente le proteine ed una acquosa, contenente il DNA. Si prende il sopranatante acquoso, si mette in una provetta pulita e si aggiunge 0.7V di isopropanolo. Si agita bene e si centrifuga immediatamente a 12’000g per 5 min, per precipitare il DNA. Si butta via il sopranatante e si lava il “pellet” di DNA con 0.5 ml di 70% etanolo. Il “pellet” viene lasciato asciugare e poi risospeso in 30 μl di TER (10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 20 μg/ml RNasi).
2.1.5 Estrazione di DNA da cloni BAC metodo “miniprep”
E’ un metodo veloce per l’estrazione di BAC basato sulla lisi alcalina. E’ una modificazione di protocolli standard che prevedono l’uso di colonnine e funziona molto bene per fare analisi con enzimi di restrizione su cloni BAC.
Da una crescita di cellule o/n si prendono 10 ml e si mettono in un tubo poliallomero per essere centrifugati a 2’000g per 10 min, in modo da raccogliere le cellule sul fondo. Si butta il sopranatante e si risospende il “pellet” in 1.8 ml di soluzione P1. Si aggiungono, poi, 1.8 ml di soluzione P2 e si agita delicatamente per miscelare i componenti. Si lascia il tubo a RT per 5 min, dopodichè si aggiungono 1.8 ml di soluzione P3 e si incuba in ghiaccio per altri 5 min. A questo punto si centrifuga a 16’000g per 10 min a 4°C e subito dopo si mette il tubo in ghiaccio. Usando una pipetta da 1 ml si preleva il sopranatante, facendo attenzione a non prendere il precipitato, e si trasferisce in un tubo poliallomero pulito, contenente 4.8 ml di isopropanolo ghiacciato. Si inverte il tubo qualche volta e si mette in ghiaccio per 5 min. Poi si centrifuga a 16’000g per 15 min a 4°C, si rimuove il sopranatante e si aggiungono 3 ml di 70% etanolo. Si inverte di nuovo il tubo per più volte per lavare il “pellet” di DNA. Si centrifuga a 16’000g per 5 min a 4°C e si rimuove il più possibile il sopranatante utilizzando una pompa a vuoto. Si lascia asciugare il “pellet” a 37°C e si risospende il DNA in 40 µl di TE. Per favorire la risospensione si incuba il tubo a 55°C per una mezz’ora. A questo punto è possibile visualizzare su gel la quantità di BAC estratto per poi successivamente fare analisi di digestioni enzimatiche.
Soluzioni: P1
Tris 15mM, pH 8
EDTA 10 mM
RNasi A 100 µg/ml
La soluzione viene sterilizzata per filtrazione e conservata a 4°C. P2
NaOH 0.2 N
SDS 1%
La soluzione viene sterilizzata per filtrazione e conservata a RT. P3
KOAc 3 M, pH 5.5
2.1.6 Estrazione di DNA BAC su scala media mediante lisi alcalina e
cromatografia a scambio ionico
Il QIAGEN Large-Construct Kit è progettato per la purificazione di grandi costrutti come BACs, PACs, P1s e cosmidi, fino a 250 kb di lunghezza, che nelle cellule si ritrovano generalmente a basso numero di copie.
Il protocollo inizia con la lisi alcalina e la digestione catalizzata dall’ Esonucleasi ATP-Dipendente. Questo passaggio permette la rimozione selettiva di DNA genomico contaminante e di DNA BAC danneggiato. Successivamente, il DNA BAC viene caricato sulla colonnina cromatografica e si lega alla resina sotto appropriate condizioni di bassa salinità e pH. RNA, proteine e molecole a basso peso molecolare vengono rimosse dal lavaggio con una soluzione di media concentrazione salina. Il BAC viene eluito in una soluzione ad alta concentrazione salina e poi precipitato con isopropanolo.
Questo protocollo è adatto a molteplici applicazioni, inclusi gli esperimenti di subclonaggio, di trasfezione e quelli che richiedono un’alta purezza del DNA. E’ possibile ottenere DNA puro a partire da 50 µg fino a 200 µg in relazione al costrutto e al ceppo ospite utilizzato.
Si prende una colonia di cellule da una piastra fresca con terreno selettivo e si inocula in 5 ml di brodo LB contenente l’/gli antibiotico/i appropriato/i. Si incuba per 8 ore a 37°C in continua agitazione. Successivamente, si diluisce 1 ml della precrescita in 500 ml di LB selettivo e si incuba a 37°C o/n. Il giorno seguente si mette la crescita in ghiaccio per 30 min e poi si comincia con l’estrazione del BAC. Si raccolgono le cellule batteriche mediante una centrifugazione a 6’000g per 15 min a 4°C, si butta il sopranatante e si risospende il “pellet” in 20 ml di soluzione P1. Per una lisi efficiente, è importante utilizzare un recipiente largo abbastanza per permettere una completa miscelazione delle soluzioni di lisi. I batteri possono essere risospesi completamente utilizzando il “vortex”, affinché si dissolva il “pellet”. Si aggiungono, poi, 20 ml di soluzione P2, si mescola delicatamente, invertendo il tubo 4-6 volte e si incuba a RT per 5 min. Le cellule batteriche vengono lisate in NaOH-SDS (P2) in presenza di RNasi A. L’SDS rende solubili i fosfolipidi e le proteine della membrana cellulare, inducendo la lisi e il rilascio del contenuto della cellula. L’NaOH denatura i DNAs cromosomico e di BAC e le proteine. Il tempo di lisi ottimale permette il massimo rilascio del BAC dalla cellula senza il rilascio
del DNA genomico, mentre minimizza l’esposizione del BAC alle condizioni di denaturazione. Una lunga esposizione alle condizioni alcaline può causare una denaturazione irreversibile del costrutto.
Dopo la soluzione di lisi vengono aggiunti 20 ml di soluzione P3 ghiacciata, si inverte il tubo delicatamente 4-6 volte e si incuba in ghiaccio 10 min. Il lisato viene neutralizzato dall’aggiunta di potassio acetato (P3). L’alta concentrazione salina causa la precipitazione del potassio dodecil solfato (KDS), e le proteine denaturate, il DNA genomico e i detriti cellulari vengono intrappolati nei complessi sale-detergente, formando un materiale bianco e soffice, mentre il lisato appare meno viscoso. Se l’SDS rimane nel lisato, andrà ad inibire il legame del DNA alla colonnina, per cui la soluzione deve essere mescolata delicatamente per garantire una completa precipitazione del detergente.
Successivamente si centrifuga a 20’000g per 30 min a 4°C e si rimuove prontamente il sopranatante contenente il BAC. Il lisato viene filtrato per mezzo di un filtro umidificato con H2O distillata per impedire la precipitazione dei detriti cellulari che renderebbe più
difficile una completa digestione esonucleasica. Per precipitare il DNA si aggiunge al lisato filtrato 0.6V di isopropanolo a RT. Si mescola, si centrifuga immediatamente a 15’000g per 30 min a 4°C e con attenzione si butta il sopranatante.
L’isopropanolo deve essere a RT per minimizzare la precipitazione del sale. La centrifugazione, invece, deve avvenire a 4°C per prevenire un surriscaldamento del campione. Oltre al BAC, il “pellet” contiene anche proteine, DNA genomico. Segue il lavaggio del “pellet” con 5 ml di 70% etanolo a RT, e si centrifuga a 15’000g per 15 min. Con attenzione, si butta il sopranatante senza turbare il “pellet”. Il 70% etanolo rimuove il sale precipitato e si sostituisce all’isopropanolo ed, essendo più volatile, permette al DNA di dissolversi più facilmente.
Si lascia asciugare il “pellet” di DNA aiutandosi con una pompa a vuoto ed attentamente si risospende il DNA in 9.5 ml di soluzione EX, evitando di spipettare per non causare un “nick” al BAC. Si aggiungono, poi 200 µl di Esonucleasi ATP-Dipendente e 300 µl di soluzione di ATP al DNA risospeso, si mescola delicatamente e si incuba in un bagnetto a 37°C per 60 min.
La separazione del BAC dal DNA genomico è basata sulla digestione esonucleasica del DNA che presenta dei “nick”. Il DNA cromosomico subisce dei “nick” durante il processo di lisi e viene successivamente digerito, mentre il BAC in soluzione rimane intatto. Dal momento che i frammenti di genoma hanno una densità di carica negativa simile al DNA di BAC, le due specie non verrebbero separate sulla resina a scambio anionico e sarebbero
eluite sotto le stesse concentrazioni saline se il DNA genomico non fosse rimosso dalla digestione esonucleasica.
Si equilibra la colonnina cromatografica caricando in essa 10 ml di soluzione QBT e lasciando che si svuoti per gravità. Al campione di DNA, invece, si aggiungono 10 ml di soluzione QS prima di essere caricato sulla colonnina equilibrata. Le condizioni saline e di pH della soluzione digerita e la superiore selettività della resina assicurano che solo il DNA si leghi, mentre l’RNA degradato, le proteine cellulari e i metabolici non vengono trattenuti.
La colonnina viene poi lavata due volte con 30 ml di soluzione QC, che rimuove ogni contaminante rimasto, come tracce di RNA e proteine (per es., RNasi A), senza influire sul legame del DNA BAC. Inoltre la soluzione QC rompe le interazioni aspecifiche e rimuove le proteine che legano gli acidi nucleici senza l’uso del fenolo. La bassa concentrazione di alcool nella soluzione elimina i legami idrofobici aspecifici, oltre ad aumentare la purezza del DNA legato.
Successivamente il DNA BAC viene eluito con 15 ml di soluzione QF, preriscaldata a 65°C. Tale soluzione contiene un’alta concentrazione salina e la temperatura alta permette una più efficiente eluizione di grandi molecole di DNA.
Il DNA viene desalinizzato e concentrato mediante una precipitazione con 0.7V di isopropanolo. Si mescola, si centrifuga immediatamente a 15’000g per 30 min a 4°C e si butta il sopranatante. Il “pellet” di DNA viene, a questo punto, lavato con 5 ml di 70% etanolo a RT e centrifugato a 15’000g per 15 min. Si butta il sopranatante e si lascia asciugare il “pellet”. Si risospende il DNA in 100 µl di TE, pH 8, tenendolo a 55°C per 1-2 ore agitandolo delicatamente. Non è possibile utilizzare la pipetta per la risospensione, in quanto il DNA BAC può facilmente subire dei “nick”. A questo punto il BAC è pronto per essere utilizzato in molteplici esperimenti.
Soluzioni: P1 Tris-HCl 50 mM, pH 8 EDTA 10 mM RNasi A 100 µg/ml P2 NaOH 200 mM
SDS 1% P3 KOAc 3 M, pH 5.5 QBT NaCl 750 mM MOPS 50 mM, pH 7 Isopropanolo 15% Triton®, X-100 0.15% QC NaCl 1 M MOPS 50 mM, pH 7 Isopropanolo 15% QF NaCl 1.25 M Tris-HCl 50 mM, pH 8.5 Isopropanolo 15% Solvente dell’Esonucleasi KCl 20 mM KPO4 20 mM, pH 7.5 Le soluzioni P1 e P3 si conservano a 4°C. Le altre soluzioni si conservano a RT.
2.2 Elettroforesi su gel di agarosio
Al fine di verificare la purezza del DNA estratto, il grado di completezza raggiunto dalla digestione del DNA, nonchè di stimare la concentrazione del DNA nelle preparazioni e la lunghezza in paia basi del DNA, si prepara un gel di agarosio allo 0.8-1.5% (peso/volume).
I gels sono preparati scogliendo l’agarosio in TBE, portato alla temperatura di ebollizione. Prima che il gel polimerizzi si aggiunge bromuro di etidio (EtBr) 1:20’000. Il
gel, lasciato un poco a raffreddare viene colato in un lettino da elettroforesi di un apparato orizzontale. Una volta polimerizzato, il gel è posto nell’apparato ed immerso in un tampone di corsa, TBE a pH 8.
Frattanto si preparano i campioni che vengono diluiti in H2O e “loading buffer”. La
funzione del “loading buffer” è di appesantire il campione, facendolo andare sul fondo del pozzetto, e consentire al contempo di seguire la corsa elettroforetica.
Si caricano i campioni su gel e si applica una differenza di potenziale di 50/120 V per un tempo variabile a seconda delle dimensioni del DNA e della concentrazione del gel. Si visualizzano infine le bande del DNA ponendo il gel sotto raggi UV; il bromuro di etidio che si è intercalato alle basi appare in queste condizioni luminescente. Le dimensioni dei frammenti sono stimate in presenza di marcatori con peso molecolare noto.
Soluzioni: TBE pH 8.0 Tris base 0.089 M Acido borico 0.089 M EDTA 0.002 M Loading buffer 6X Glicerolo 5% Blu di bromofenolo 0.05% Xilene cianolo 0.05% Gel di agarosio Agarosio 0.8-1.5% (w/v) Bromuro di etidio 1: 20'000 (v/v) TBE 1X
2.3 Clonaggio in vettori plasmidici
2.3.1 Clonaggio in un vettore plasmidico mediante l’uso di enzimi di
restrizione
Il clonaggio in vettori plasmidici è molto preciso. Il DNA plasmidico circolare viene aperto con uno o più enzimi di restrizione e “ligato” in vitro a cDNA portante estremità compatibili. Tale cDNA è stato ottenuto per PCR utilizzando oligo specifici per la sequenza da clonare. Inoltre l’oligo senso al 5’ e l’antisenso al 3’ contengono il sito di restrizione necessario al clonaggio nel plasmide.
Prima di procedere con le digestioni enzimatiche, il cDNA viene fatto correre su gel d’agarosio e la banda corrispondente viene purificata mediante un kit disponibile commercialmente.
Le digestioni del plasmide e del cDNA vengono effettuate in un volume che varia dai 60 ai 150 μl totali a 37°C in un tempo variabile da 3 ore a un o/n. Dopodichè si caricano 3-4 μl delle digestioni su gel d’agarosio per verificare le dimensioni attese delle bande e se il risultato è positivo si passa all’estrazione fenolica dei DNA digeriti. La concentrazione di DNA estratto viene stabilita mediante elettroforesi su gel. Per la reazione di “ligation” viene preparata tale miscela:
10X “ligation buffer” 1 μl
T4 DNA ligasi 1 unità (1 μl)
DNA plasmidico 50 ng
cDNA x ng*
H2O fino a 10 μl
*La reazione di “ligation” può contenere un rapporto molare cDNA :DNA plasmidico variabile.
La miscela viene incubata a 14°C o/n.
Il prodotto della reazione di “ligation” è poi usato per trasformare il ceppo DH5α di E.
coli. Le risultanti colonie trasformate vengono analizzate mediante ibridazione, PCR, o
digestioni con enzimi di restrizione che identificano ciò che porta la sequenza di DNA desiderata.
Soluzioni:
1X ligation buffer
Tris-HCl 50 mM pH 7.8
DTT 10 mM
ATP 1 mM
BSA 25 μg/ml
2.3.2 Clonaggio di prodotti di PCR in T-vettori
L'aggiunta di residui di adenosina al 3’ da parte della Taq DNA polimerasi (“tailing”) è un efficiente metodo per clonare prodotti di PCR in un vettore ( T-vettore) contenente residui timidilici a singolo filamento al 3’ complementari. I T-vettori possono essere acquistati commercialmente come componenti di kit di clonaggio; il nostro laboratorio utilizza il pGEM-T della Promega.
Il “tailing” del frammento di PCR purificato, generato da una DNA polimerasi con attività 3’-5’ esonucleasica, viene effettuato mettendo in vitro i seguenti reagenti:
frammento di PCR 1-7 μl
10X Reaction Buffer 1 μl
dATP a concentrazione finale di 0.2 mM
Taq DNA Polimerasi 5 unità
H2O a volume finale di 10 μl
La miscela viene incubata a 70°C per 30 min. A questo punto è possibile utilizzare il prodotto di PCR “tarlato” nella “ligation” con il pGEM-T:
2X Rapid Ligation Buffer 5 μl
pGEM-T (50 ng) 1 μl
prodotto di PCR x ng*
T4 DNA ligasi 1 μl
H2O a volume finale di 10 μl
*La reazione di “ligation” deve contenere un rapporto molare PCR :DNA plasmidico di 1:1
La miscela viene incubata a 14°C o/n.
Il prodotto della reazione di “ligation” è poi usato per trasformare il ceppo DH5α di E.
coli. La selezione dei trasformanti viene fatta utilizzando piastre con
con l'inserto risultano bianche in quanto incapaci di utilizzare X-Gal, mentre quelle col plasmide vuoto diventano blu poichè viene mantenuta la cornice di lettura del gene β-gal.
Soluzioni:
2X Rapid Ligation Buffer
Tris-HCl 60 mM pH 7.8
MgCl2 20 mM
DTT 20 mM
ATP 2 mM
Polietilen glicol 10%
2.4 Purificazione del DNA
2.4.1 Estrazione fenolica
Per purificare il DNA dalle proteine, si porta la miscela di digestione ad un volume di 150 μl con TE e si aggiunge un ugual volume di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico, soluzione 25:24:1 a pH 8. Dopo aver mescolato energicamente, si centrifuga per 2 min a 13’000 rpm. Si recupera la fase acquosa contenente il DNA e si mette in una provetta pulita. Il DNA viene precipitato, aggiungendo al prodotto dell’estrazione fenolica 2.5V di EtOH assoluto e 15 μl di sodio acetato 3 M. Dopo aver agitato col vortex si mette il tutto a precipitare 30 min a -70°C. Quindi si centrifuga per 15 min alla massima velocità e si lava il “pellet” dai sali con 50 μl di EtOH al 70%. Una volta che il “pellet” è asciugato, all’aria o con l’ausilio di una pompa a vuoto, si sospende il DNA in H2O sterile.
Per stimare la concentrazione di linearizzato, si prende un volume di DNA che presumiamo corrispondere a circa 200/300 ng di DNA, supposto un recupero medio dell’80% dall'estrazione fenolica, e lo si carica su gel di agarosio per verificarne la quantità reale.
2.4.2 Estrazione di DNA da gel di agarosio mediante MINELUTE GEL
EXTRACTION KIT QIAGEN
Questo protocollo riguarda l’estrazione e la purificazione di DNA, con dimensioni che variano dalle 70 bp alle 4 kb, da gels di agarosio in tampone TAE o TBE.
Viene, per prima cosa, tagliato il frammento di DNA dal gel con un trincetto pulito e pesato in un tubo “eppendorf” da 1.5-2 ml. Si aggiungono 3V di soluzione QG a 1V di gel, tenendo presente che a 100 mg corrispondono 100 μl, e il tutto viene incubato a 50°C per il tempo sufficiente a sciogliere il gel. Il colore della soluzione, giallo, indica un pH≤7.5, ideale per l’assorbimento del DNA alla membrana della colonnina. Se il colore vira verso il violetto significa che il pH è aumentato e, per riportarlo a valori più bassi, devono essere aggiunti 10 μl di sodio acetato 3 M. Successivamente viene aggiunto 1V di isopropanolo al campione e poi caricato sulla colonnina, posta all’interno di un tubo, e viene centrifugata per 1 min a 13’000 rpm. Il DNA si ritrova, così, legato alla membrana mentre il resto attraversa la membrana e si ritrovano nel tubo. La soluzione nel tubo viene buttata, si aggiunge nella colonna 500 μl di soluzione QG e si centrifuga di nuovo. Segue un lavaggio con 750 μl di soluzione PE e poi l’eluizione del DNA caricando attentamente al centro della colonnina 10 μl di soluzione EB ( 10 mM Tris-HCl pH 8.5). Si centrifuga recuperando l’eluato in un tubo da 1.5 ml.
2.5 “Annealing” di due oligo complementari
E’ una tecnica che permette di generare un frammento di DNA a doppio filamento di poche decine di paia basi.
Si sintetizzano due oligo complementari, con la sequenza nucleotidica voluta, in modo che possano appaiarsi (“annealing”). Tali oligo sono risospesi in TE ad una concentrazione di 1 μg/μl di cui vengono utilizzati 3 μl ciascuno nella reazione di “annealing”: gli oligo vengono messi in un tubo contente una soluzione di NaCl 5M e TE in un volume finale di 60 μl, il quale viene incubato in 3/4 lt di H2O in ebollizione. A questo punto si aspetta che
l’H2O torni a temperatura ambiente, in modo da permettere l’appaiamento dei due oligo ed
ottenere, così, il frammento di DNA a doppio filamento, che può essere utilizzato successivamente per il clonaggio in un vettore plasmidico.
2.6 “Overlapping PCR”
Si amplificano per PCR i due geni, o meglio i frammenti dei due geni che interessano, utilizzando oligo specifici, che possiedono la stessa Tm. Per il primo gene, “A”, l'oligo
senso è specifico per la propria sequenza a monte del primo codone, mentre l'antisenso possiede al 5’ una breve sequenza complementare a quella presente sempre all’estremità 5’ del secondo gene, “B”.
L’oligo antisenso del gene “B” è specifico per la propria sequenza all’estremità 3’, mentre l’oligo senso è interamente complementare all’oligo antisenso di “A”.
Una volta avvenute le due amplificazioni separatamente, i due prodotti di PCR vengono utilizzati entrambi come stampi per un’ulteriore amplificazione utilizzando gli oligo esterni dei due geni, il senso di “A” con l'antisenso di “B”. Poichè i due amplificati possiedono una breve sequenza complementare, possono appaiarsi e il frammento risultante dall'ultima PCR sarà un gene chimerico che porta le due sequenze originarie amplificate “in frame”, in cui il primo codone del gene “A” coincide con quello di “B”.
2.7 Analisi mediante ibridazione con sonda radioattiva
2.7.1 “Southern blot”
Tale tecnica viene utilizzata per analizzare prodotti di PCR e digestioni enzimatiche di DNA genomico, di plasmidi e di BACs.
Il DNA viene prima digerito con uno o più enzimi di restrizione, e i risultanti frammenti sono separati secondo la loro taglia per elettroforesi su gel d’agarosio. Dopodichè viene fatta una foto al gel, posizionando un righello fluorescente agli UV con lo “zero” in corrispondenza dei pozzetti. Ciò permette di confrontare e, quindi, determinare la banda, ottenuta con il “Southern”, a quale frammento della digestione corrisponda.
Il DNA viene poi depurinato in una vaschetta contenente 0.25 M HCl posta in agitazione per 20 min. Con i successivi due passaggi in 0.5 M NaOH il DNA viene denaturato e subisce dei “nick”. A questo punto il DNA viene trasferito su un supporto solido, ovvero su membrana o filtro di nylon o nitrocellulosa. Le membrane di nylon sono più durature e hanno una capacità di legame al DNA maggiore della nitrocellulosa. In aggiunta, il DNA è fissato covalentemente alla membrana, eliminando problemi causati da un eventuale passaggio in soluzione degli acidi nucleici dalle membrane di nitrocellulosa durante l’incubazione ad elevate temperature. Vi sono due tipi di membrane di nylon, disponibili commercialmente: quelle neutrali e quelle cariche che possiedono un gruppo amminico.
Queste ultime hanno un’alta capacità di legare gli acidi nucleici ma ha la tendenza a incrementare i livelli di fondo che risultano, almeno in parte, da legami aspecifici di gruppi fosfato negativi del DNA con quelli positivi della superficie del polimero. Comunque questo problema può essere controllato aumentando le quantità di agenti bloccanti nei passaggi di preibridazione e di ibridazione.
Il “blot” è composto da una pila di fogli di carta assorbente sulla quale viene posto il filtro, preparato della stessa grandezza del gel e, per convenzione, tagliato in alto a destra. Sul filtro viene posto il gel d’agarosio e avvolgo il tutto con della pellicola trasparente per evitare l’evaporazione. Sopra il gel viene poi messo un peso e si lascia trasferire il DNA sulla membrana tutta la notte. I frammenti di DNA sono trasportati dal gel verso l’alto per capillarità e depositati sulla superficie del filtro. Il tempo per il trasferimento del DNA dipende dalla taglia dei frammenti di DNA e dalla concentrazione di agarosio nel gel. Piccoli frammenti di DNA (<1 kb) sono trasferiti da un gel 0.7% d’agarosio entro un’ora; frammenti più grandi sono trasferiti più lentamente e meno efficientemente. Per esempio, il trasferimento di DNAs >15 kb in lunghezza richiede almeno 18 ore.
L’efficienza di trasferimento di frammenti di DNA grandi è determinata dalla frazione di molecole che escono dal gel prima di disidratarsi.
Il flusso di liquido riduce il gel a una sostanza gommosa attraverso la quale le molecole di DNA non possono passare facilmente.
Il “blot”, poi, viene smontato e, prima di buttare il gel, si segnano con la “bic” nera i pozzetti sul filtro, il quale viene successivamente posto per 2 min in 2X SSC per lavarlo da residui di NaOH e di gel. A questo punto il filtro viene posto nella soluzione di preibridazione per 2 ore a 65°C (il tempo dipende dalla complessità del DNA e la temperatura dal livello di omologia con la sonda) all’interno di un sacchetto.
Soluzione di preibridazione:
SSC 5X
Denhardt's 5X
SDS 0.1%
ssDNA 0.1 mg/ml finale (denaturato)
5X Denhardt’s e 5X SSC determinano la stringenza ionica e l’ssDNA serve ad evitare il fondo dato dalla sonda che può andare ad ibridare aspecificamente.
Nel frattempo viene preparata la sonda usando il Kit Megaprime DNA Labelling System Amersham Biosciences. Si mettono in un tubo 25 ng in 5 λ di DNA, denaturato
precedentemente a 100°C per 5 min, si aggiungono 5 λ di primers esameri con sequenza random e si incuba a 100°C per 5 min. Si centrifuga e si lascia a RT per qualche minuto per permettere ai primers di ibridarsi al DNA. Si aggiungono poi 12 λ di nucleotidi (tranne dCTP) non marcati, 5 λ di buffer, 16 λ di H2O e 2 λ di enzima Klenow (non ha attività
3’-5’ esonucleasica). Alla fine aggiungo 5 λ di 32PαdCTP in un volume finale di 50 λ e lascio
il tubo a 37°C per 20 min in un contenitore piombato.
In quest’arco di tempo vengono preparate le colonnine cromatografiche ad esclusione molecolare Sephadex G-50. Si utilizza una siringa da 1 ml da cui è stato tolto l’ago e si carica con la soluzione di Sephadex. Si aspetta che la colonnina smetta di sgocciolare, dopodichè viene centrifugata per 5 min a 5’000 rpm nella centrifuga “swing-out” per un miglior impacchettamento della matrice di Sephadex. Una volta preparata la colonnina, la carichiamo con la soluzione radioattiva e centrifughiamo: il 32PαdCTP non incorporato al DNA viene trattenuto dalla colonnina, mentre la sonda radioattiva passa attraverso la matrice e si ritrova in un tubo da 1.5 ml posto alla base della colonnina. E’ possibile valutare al contatore Geiger la qualità della sonda preparata. Tale sonda viene denaturata a 100°C per 5 min e poi aggiunta alla miscela di ibridazione. Terminata l’incubazione in preibridazione il sacchetto contenente il filtro viene aperto per togliere la soluzione e sostituirla con la miscela di ibridazione. Il sacchetto viene richiuso e viene lasciato a 65°C o/n.
Il giorno seguente il filtro viene lavato più volte a diverse concentrazioni di SSC per eliminare la sonda non ibridata. Vi sono due lavaggi in 2X SSC 0.1% SDS, uno a RT e l'altro a 65°C di 20 min ciascuno, mentre i successivi, all’1X SSC, 0.5X SSC e 0.1X SSC, vengono effettuati in base al segnale ottenuto sul filtro e misurato al contatore Geiger. Se il segnale è basso, i lavaggi che danno stringenza, ossia gli ultimi a concentrazioni di SSC basse, non vengono svolti, in quanto non necessari. Successivamente si procede con l’esposizione del filtro su lastra per un tempo che varia a seconda sel segnale. In genere vengono effettuate diverse esposizioni per tempi diversi. Le lastre vengono poi sviluppate e, dove è avvenuta ibridazione della sonda, si troverà la banda di taglia corrispondente al frammento ibridato.
La forza del segnale di ibridazione dipende da numerosi fattori, incluse la proporzione di DNA che è complementare alla sonda, la taglia della sonda e la sua specificità e la quantità di DNA trasferito sulla membrana. In condizioni ottimali, il “Southern blot” è sufficientemente sensibile a rivelare <0.1 pg di DNA complementare alla sonda radioattiva.
Soluzioni: 100X Denhardt’s BSA 2% w/v FicollTM 2% w/v PVP 2% w/v
2.7.2 “Colony lifting”
La tecnica si svolge similmente alla precedente ma con la differenza che in questo caso vengono analizzati i DNAs di colonie batteriche direttamente su piastra con LB/agar/antibiotico.
La piastra di colonie batteriche viene tenuta a 4°C per un tempo sufficiente ad umidificarle. Dopo si prende il filtro di nylon e si lascia aderire sulla piastra (“lifting”); con un ago si fanno dei buchi sul filtro in maniera asimmetrica trapassando nella piastra allo scopo di orientare il filtro. Si aspetta che la membrana si sia bagnata dopodichè il filtro viene messo in una bacinella contenente la soluzione denaturante (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl) per 5 min, che serve a rompere le cellule e liberare il DNA. Successivamente, si passa il filtro nella soluzione neutralizzante (0.5 M Tris pH 7.5, 1.5 M NaCl) e poi in 2X SSC. Si mette poi il filtro ad asciugare e si espone ai raggi UV per 3 min; ciò permette il fissaggio covalente del DNA alla membrana. A questo punto è possibile mettere su la preibridazione e poi l’ibridazione come descritte nel protocollo del “Southern blot”.
2.8 Modificazione di un BAC per ricombinazione omologa nel
ceppo DY380 di E. coli
Il giorno prima dell’esperimento viene preparato un inoculo in 3 ml di brodo LB/cloramfenicolo (12.5 µg/ml) da una colonia di DY380 contenenti il BAC e fatto crescere a 32°C o/n. Si preparano, inoltre, piastre di LB agar/cloramfenicolo (12.5 µg/ml)/kanamicina (15 µg/ml).
Con l’ausilio di uno spettrofotometro, in una beuta si semina 50 ml di LB/cloramfenicolo (15 µg/ml) con 8·108 batteri, presi dalla coltura o/n, e si incuba a 32°C fino a che A600=0.5.
l’espressione delle ricombinasi. Immediatamente dopo si mette a raffreddare in ghiaccio per 5 min e si distribuisce la coltura in due tubi da centrifuga di 35 ml ciascuno, preventivamente ghiacciati. Si centrifuga per 8 min a 4’000g a 4°C, si butta il sopranatante e si risospende il “pellet” di cellule in 25 ml di H2O ghiacciata, utilizzando pipette da 13
ml. Ciò lo si effettua per due volte ed alla terza centrifuga si mettono ad asciugare i tubi su carta, facendo attenzione a non perdere il “pellet”. L’ultima risospensione delle cellule viene fatta, delicatamente, in 100 µl di H2O ghiacciata, usando una pipetta da 1 ml.
A questo punto si procede immediatamente con l’elettroporazione delle cellule appena rese competenti. Si aliquotano in 40 µl ed un’aliquota viene utilizzata nella trasformazione, aggiungendo ad essa 200-300 ng (1-4 µl) del frammento di DNA, oggetto della ricombinazione omologa. Le cellule con il DNA vengono poi messe in una cuvetta da 2 mm ed elettroporate con questi parametri: 2.5 kV; 200 Ω; 25 µF, con tempo costante intorno ai 4.8-4.9 ms. Si aggiunge immediatamente 800 µl di SOB, trasferendo il tutto in tubi da 14 ml e si incuba a 32°C per un’ora. Dopodichè si piastra la precrescita in LB/agar/cloramfenicolo (12.5 µg/ml)/kanamicina (15 µg/ml). Il giorno dopo è possibile verificare la presenza di colonie di cellule ricombinanti; le cellule che non hanno subito ricombinazione non cresceranno in quanto non resistenti alla kanamicina.
Soluzioni:
SOB
Bacto-tryptone 2%
Bacto-yeast extract 0.5%
