CAPITOLO 5:
DISCUSSIONE
Negli ultimi anni sono stati dedicati molti sforzi allo sviluppo di una strategia vaccinale efficace contro il virus HIV. Recentemente grande interesse hanno suscitato i vaccini a DNA i quali offrono numerosi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali di vaccinazione, tra i quali l’evocazione dell’immunità sia umorale che cellulo-mediata, la presentazione dell’antigene di interesse nella conformazione nativa, la possibilità di veicolare antigeni multipli espressi nello stesso plasmide. Questa strategia però, pur essendosi rivelata efficace nell’indurre un’immunità specifica verso HIV o lentivirus simili, si è dimostrata per ora inadeguata nel conferire una protezione duratura verso ceppi sfidanti patogeni (Barouch e Letvin, 2000). Per potenziare la risposta immune evocata dalla vaccinazione a DNA sono stati svolti numerosi studi dai quali è emerso tra l’altro che il tipo di immunogeno usato nella formulazione dell’antigene rappresenta un fattore determinante per la modulazione della forza ed il profilo della risposta immunitaria generata dal vaccino. Molti gruppi di ricerca hanno dimostrato che è possibile aumentare l’immunogenicità di un vaccino a DNA utilizzando geni che esprimono citochine o molecole co-stimolatorie in combinazione con plasmidi codificanti per antigeni virali (Moore et al. 2002; Barouch et al. 2003; Boyer et al. 1999). Studi effettuati in numerosi sistemi hanno dimostrato il vantaggio di combinare due o più modalità vaccinali, una strategia denominata prime-boost. Questo approccio, che combina un priming a DNA con un boost che utilizza un vettore ricombinante, si è rivelato un potente mezzo per indurre risposte protettive contro ceppi virali sfidanti patogeni, inclusi HIV e SIV (O’Neill et al. 2002; Amara et al. 2001; Takeda et al.2003). Il successo di questa strategia di vaccinazione risiede nell’abilità della componente a DNA di innescare una forte risposta cellulare prevalentemente di tipo Th1, ovvero di indurre un’immunità cellulo-mediata, ritenuta la più adatta nel controllo e nell’eradicazione dell’infezione da HIV (Woodland D., 2004; Doria-Rose and Haigwood, 2003).
In base a queste premesse abbiamo pensato di applicare un simile approccio prime-boost nella vaccinazione contro la proteina Env di FIV. La fase di prime sarà effettuata mediante immunizzazione a DNA, con un plasmide esprimente Env ed il fGM-CSF. Abbiamo scelto una proteina Env clonata direttamente da un isolato primario linfotropico, col fine di evocare una risposta immunitaria diretta verso ceppi FIV circolanti in natura. Inoltre la co-espressione locale di Env e fGM-CSF dovrebbe reclutare le cellule dendritiche (DC, potenti antigen presenting cell) al sito di inoculo, inducendo la loro proliferazione e maturazione e creando un microambiente ideale alla cattura e presentazione dell’antigene alle cellule effettrici della risposta immune (Basak et al. 2002; Barouch et al. 2003).
A questa fase seguirà un boost costituito dai linfociti autologhi degli animali precedentemente immunizzati con Env, purificati e trasdotti in vitro con un vettore FIV-derivato veicolante i geni env ed fIFNγ. I linfociti esprimeranno le glicoproteine dell’envelope sulla superficie cellulare in modo simile a quanto avviene nell’infezione naturale, e indurranno in vivo una risposta secondaria contro Env. L’fIFNγ prodotto contribuirà a potenziare la risposta cellulo-mediata specifica per l’antigene virale (Hosie et al. 1998; Leutenegger et al. 2000; Flynn et al. 2000).
Per effettuare il priming è stato preparato un costrutto codificante il gene env di FIV ed il fGM-CSF. È stato utilizzato env ottenuto da un isolato primario linfotropico e quindi simile a quello dei ceppi circolanti in natura. Per consentire un’adeguata produzione della proteina è stata clonata l’intera sequenza contenente anche il gene rev e l’RRE, essenziali per il corretto processamento ed il trasporto del messaggero dal nucleo al citoplasma. Come immunoadiuvante abbiamo scelto il fGM-CSF, clonato a partire da macrofagi alveolari di un gatto FIV-infetto. Il GM-CSF è una citochina chiave per lo sviluppo e l’attivazione delle cellule dendritiche, ed è utilizzato in molti protocolli di vaccinazione e terapia genica (Barouch et al. 2002; O’Neill et al. 2002; Sun et al. 2001; Kusakabe et al. 2000), impiegato sia come proteina ricombinante sia come sequenza veicolata da un plasmide a DNA.
Allo scopo di allestire un saggio per testare l’attività biologica della citochina è stato effettuato un allineamento tra la sequenza aminoacidica ottenuta dai macrofagi alveolari e le sequenze presenti in banca dati del GM-CSF umano e murino. Da questo confronto è emerso che la sequenza felina presenta un’omologia genetica dell’82% con la sequenza umana e di circa il 70% con quella murina; questo risultato ci
ha permesso di utilizzare la linea cellulare eritroblastoide umana TF-1, strettamente dipendente dal hGM-CSF. È stato saggiato sia il costrutto contenente il solo fGM-CSF che l’effettivo costrutto di priming (pVIVO/fGM-fGM-CSF/Env-rev) che verrà utilizzato nella fase in vivo per vaccinare gli animali. Entrambi i plasmidi sono stati prodotti sulla linea di fibroblasti felini CrFk ed è stata valutata l’attività biologica mediante un test di proliferazione con H3-timidina, con il quale è stata dimostrata la
proliferazione specifica della linea TF-1 in presenza della citochina felina, con entrambi i tipi di costrutti.
Per la produzione del vettore FIV-derivato da utilizzare nella fase di boost, è stata utilizzata inizialmente una strategia a due plasmidi: un packaging che fornisce le proteine strutturali Gag ed enzimatiche per l’assemblaggio della particella virale ed un vettore che viene incorporato nella particella progenie e contiene i geni da trasdurre env ed fIFN-γ.
Il costrutto di packaging utilizzato negli esperimenti è stato prodotto a partire dal p34TF10, un clone molecolare FIV replicazione competente adattato in vitro a crescere sulle CrFk a cui sono state apportate le opportune modifiche.
In particolare, al fine di ridurre al minimo le omologie con i costrutti vettore ed eliminare tutte le sequenze funzionanti in cis, sono state rimosse le due LTR al 5’ e 3’, e sono state sostituite rispettivamente con un promotore, espresso costitutivamente, ed un segnale di poliadenilazione eterologhi. Per evitare l’incorporazione del trascritto di packaging all’interno della particella virale è stato inoltre deletato il sito di incapsidamento (Ψ), e, ad ulteriore garanzia della difettività di replicazione, sono state eliminate 2 Kb dalla regione codificante env. Degli altri tre costrutti di packaging prodotti contestualmente, uno (p∆env1) conteneva, a differenza di quello utilizzato negli esperimenti, una delezione in env meno estesa (1 Kb), mentre gli altri due mancavano delle regioni codificanti a valle del gene pol (pgag-pol + RRE e pgag-pol + CTE). L’analisi della produzione della proteina capsidica, p25, a tempi diversi dalla trasfezione ha dimostrato la piena funzionalità dei due costrutti p∆env1 e p∆env2, probabilmente a causa di un assetto genetico meno alterato rispetto agli altri due costrutti. È stato comunque scelto il costrutto p∆env2 in quanto presenta una più estesa delezione in env e quindi un minor rischio di ricombinazione col vettore. Dai risultati di questo saggio si nota che i valori di p25 rilevati per i costrutti di packaging sono inferiori a quelli del controllo positivo e
seguono un andamento completamente diverso da quest’ultimo, come logico attendersi dal fatto che, a differenza del virus wild-type in grado di replicare su CrFk, questi costrutti sono difettivi nella replicazione e danno luogo solo ad una produzione transiente della proteina virale.
Come per il packaging sono state prodotte diverse versioni di costrutti vettore, tutte a partire da un clone molecolare che contiene env ottenuto da un ceppo di FIV propagato in vivo e con spiccato tropismo per i linfociti T CD4+, cellule target dell’infezione in vivo (Elder et al. 1998). La prima versione del vettore, vCMV-GFP, precedentemente prodotta, mantiene entrambe le LTR con le sequenze regolatorie in cis ed il gene env, che nel caso del costrutto vettore ha la duplice funzione di produrre le glicoproteine di superficie per il completamento della particella virale e di esprimere, nelle cellule trasdotte, l’immunogeno contro cui intendiamo immunizzare gli animali. Oltre ad env, questo costrutto contiene tutti i geni accessori (vif, ORF-A, rev) e le sequenze di splicing. Il virus quindi, oltre a produrre Env, dà luogo all’espressione di proteine ausiliarie implicate nella regolazione dell’espressione genica. In questo e negli altri costrutti vettore prodotti, è stata inoltre effettuata un’estesa delezione in gag-pol ed inserita una cassetta di espressione dell’fIFN-γ con promotore proprio. La delezione in gag-pol è stata fatta in modo da mantenere intatto il segnale di incapsidamento (Ψ) che si trova nella regione compresa tra l’U5 dell’LTR al 5’ ed i primi 320 nucleotidi di gag (Poeschla et al. 1998; Johnston et al. 1999), ed il central polypurine tract (cppt) identificato all’interno di pol. Come nel caso di HIV-1, anche per FIV questa sequenza contiene elementi strutturali associati con la progressione della retrotrascrizione e sembra rivestire un ruolo molto importante per il trasporto al nucleo del pre-integration complex, quindi secondo molti autori potrebbe essere indispensabile per incrementare l’efficienza di trasduzione, incrementando appunto la traslocazione verso il nucleo del genoma lentivirale (Zennou et al. 2000; Withwam et al. 2001; VandenDriessche et al. 2002). Per effettuare gli esperimenti preliminari e valutare facilmente l’efficienza di trasduzione di questo e degli altri costrutti vettore prodotti, al posto di fIFN-γ è stata inserita la sequenza della green fluorescent protein (GFP), come gene reporter utilizzato per valutare l’espressione del transgene nelle cellule trasdotte in funzione della fluorescenza relativa misurata al FACS.
Il vettore vCMV-GFP, prodotto sulla linea di fibroblasti renali felini CrFk, è stato testato per efficienza di trasduzione sulla linea linfoblastoide felina MBM, che si comporta in maniera molto simile ai linfociti primari (Matteucci et al. 1995). L’analisi al FACS effettuata a vari tempi dopo la trasduzione non ha evidenziato risultati soddisfacenti, infatti, nonostante sia osservabile un aumento progressivo della fluorescenza fino al settimo giorno, la percentuale di cellule GFP positive si è attestata su valori inferiori al 10%. Queste e tutte la altre colture di cellule trasdotte sono state inoltre propagate a lungo per escludere la presenza di particelle virali infettanti nel surnatante: la costante negatività del saggio p25 dimostra l’assenza di infettività residua del vettore che sarebbe potuta originare da qualche evento di ricombinazione con il costrutto di packaging.
In base a questi risultati ed al fine di ottimizzare il sistema di trasduzione del vettore, abbiamo deciso di utilizzare le CrFk per questi saggi, una linea cellulare stabile propagabile più facilmente ed a minor costo delle MBM. Inoltre siamo passati ad un sistema di produzione del vettore a tre plasmidi in cui insieme al costrutto di packaging ed al vettore, viene fornito in trans un plasmide codificante per le glicoproteine dell’envelope. In un caso abbiamo utilizzato un Env omologo, veicolato dal plasmide pcDNA3-L Env-CTE. Questo costrutto esprime Env del p34TF10, il clone
molecolare adattato alla crescita sulle CrFk, e contiene un elemento di trasporto citoplasmatico costitutivo (CTE) derivante dal retrovirus delle scimmie Mazon-Pfizer che rende l’espressione di Env indipendente dal sistema Rev-RRE (Curran et al. 2000). Nell’altro caso è stata effettuata una pseudotipizzazione con un Env eterologa, impiegando un plasmide esprimente le glicoproteine di superficie del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), che permette di espandere il tropismo cellulare del virus in quanto interagisce con recettori di membrana ubiquitari come la fosfatidilserina. Questo tipo di pseudotipizzazione si è ampiamente dimostrato efficace nell’incrementare l’efficienza di trasduzione sia di vettori FIV-derivati (Poeschla et al. 1998; Kirkanides et al. 2003; Song et al. 2003) che derivati da altri lentivirus (Lu et al. 2004; Perletti et al. 2004; Friedmann and Yee, 1995). L’uso di queste due combinazioni per trasdurre le CrFk ha effettivamente incrementato il numero di cellule GFP positive, in particolar modo nel caso della pseudotipizzazione con il VSV-G. Questo risultato suggerisce quindi che un’adeguata espressione di Env è indispensabile per ottenere soddisfacenti livelli di trasduzione.
L’LTR al 5’, mantenuta in questa prima versione di vettore, guida l’espressione sia del trascritto full length che del gene env, ma possiede un’ attività trascrizionale subottimale, che rende l’espressione di entrambi limitante. In base ai dati ottenuti nei precedenti esperimenti dove, fornendo Env in trans, si è assistito ad un miglioramento dell’efficienza di trasduzione, abbiamo pensato di cercare di aumentare i livelli del trascritto vettore incorporati nelle particelle virali e di migliorare l’espressione di Env, evidentemente necessaria anche per una buona efficienza di trasduzione, attraverso la produzione di un vettore con LTR al 5’ ibrida. Basandoci su studi presenti in letteratura abbiamo sostituito la regione U3 dell’LTR con un promotore forte, pCMV (Poeschla et al. 1998), ottenendo il costrutto denominato vhLTR/CMV-GFP che è stato testato per efficienza di trasduzione su CrFk ed MBM.
Per testare questo vettore abbiamo utilizzato su entrambe le linee cellulari la combinazione con il VSV-G fornito in trans, mentre sulle sole MBM è stato inoculato il surnatante contenente il vettore prodotto in combinazione con il costrutto pVIVO/env-rev, che esprime l’Env del clone linfotropico. In tutti i casi analizzati si è assistito ad un incremento di cellule GFP positive, sia per quanto riguarda le CrFk che le MBM nelle quali la fluorescenza relativa è maggiore quando utilizzato il vettore pseudotipizzato con l’Env linfotropico. Questo costrutto però, pur dimostrando una buona efficienza di trasduzione ottenuta con l’inserimento dell’LTR ibrida, non ha permesso di evidenziare un’adeguata produzione di Env che, oltre ad essere necessaria per ottenere un’efficiente produzione del vettore, è oltremodo importante in quanto rappresenta l’immunogeno con il quale devono essere vaccinati gli animali. Evidentemente il pCMV inserito a monte del sito di inizio della trascrizione migliora la produzione del trascritto full length, ma probabilmente non è abbastanza efficace nell’aumentare la produzione di Env.
Per questo motivo abbiamo deciso di produrre un’ulteriore versione del vettore (vhLTR/PGK) contenente un promotore interno a monte di env per incrementare la produzione della proteina. È stata effettuata la delezione dei geni accessori vif ed ORF-A sulla base di recenti lavori in merito a vettori HIV e FIV-derivati che illustrano la capacità di trasduzione dei vettori mancanti di queste proteine accessorie (Curran et al. 2000; Chinnasamy et al. 2000; Lin et al. 2004). A
monte di env è stato inserito il promotore della PGK, caratterizzato da livelli di espressione costitutiva simili a quelli del pCMV.
Questo vettore è stato prodotto sulla linea di fibroblasti embrionali renali umani 293T, la linea cellulare maggiormente utilizzata per la produzione dei vettori lentivirali in generale in quanto permette la generazione di titoli virali estremamente alti. Il passaggio di produzione dalla linea felina a quella umana è stato possibile grazie alla presenza dell’LTR ibrida che, contrariamente all’LTR del virus wild-type, che possiede una bassissima attività trascrizionale nelle cellule umane, permette una efficiente produzione del vettore su queste ultime (Poeschla et al. 1998; Johnston et al. 1999; Curran et al. 2000). In questo caso l’analisi della produzione di Env, effettuata mediante Western Blot su cellule trasfettate, ha permesso di evidenziare la produzione adeguata della proteina da parte del costrutto vhLTR/PGK, sia quando pseudotipizzato con VSV-G che, in maniera più marcata ovviamente, in presenza del costrutto pVIVO/env-rev.
Per ottenere un’efficienza di trasduzione maggiore abbiamo inoltre testato due protocolli di concentrazione delle particelle virali prodotte dalle cellule trasfettate. Inizialmente la concentrazione è stata effettuata avvalendosi dell’uso della poli-L-lisina, un polimero ricco di cariche positive che si complessa facilmente con le particelle lentivirali, specialmente nel caso di una pseudotipizzazione con VSV-G, e permette la precipitazione di queste ultime mediante una centrifugazione a bassa velocità. Con questo protocollo abbiamo ottenuto circa il doppio di cellule GFP positive, rispetto a quelle inoculate con il surnatante non concentrato. Questo ci suggerisce che per ottenere un’adeguata espressione del transgene nelle cellule target è necessario un gran numero di particelle virali infettanti.
Le cellule trasdotte sono state utilizzate per effettuare un ulteriore Western Blot per valutare la produzione di Env ed anche in questo caso abbiamo potuto attestare che la produzione della proteina da parte di questo costrutto vettore è efficiente e, a riconferma dei risultati ottenuti al FACS, la produzione è maggiore nelle cellule trattate con il surnatante concentrato. Quindi si può confermare ragionevolmente l’ipotesi iniziale, secondo la quale per ottenere un’adeguata efficienza di trasduzione del costrutto vettore era necessaria una buona espressione di Env, fondamentale anche ai fini della vaccinazione.
Per massimizzare la capacità trasducente, abbiamo deciso di testare anche un altro protocollo di concentrazione di particelle virali che prevede l’ ultracentrifugazione del surnatante delle cellule trasfettate. E’ stato possibile utilizzare questo protocollo per la capacità del VSV-G, a differenza di altri tipi envelope, di tollerare velocità di centrifugazione molto elevate. In questi ultimi esperimenti sono stati ottenuti risultati leggermente inferiori a quelli precedenti, anche se l’andamento generale è stato riconfermato in quanto le cellule inoculate col surnatante concentrato (sia con poli-L-lisina che utilizzando l’ultracentrifuga) mostrano valori di fluorescenza relativa più elevati rispetto a quelle incubate col surnatante non concentrato. Comunque queste ultime prove ci sono servite per dimostrare la stabile espressione del gene reporter nelle CrFk trasdotte ed escludere quindi una pseudotrasduzione. È possibile infatti che l’analisi al FACS effettuata pochi giorni dopo la somministrazione del vettore alle cellule evidenzi una falsa positività per la GFP. Questo fenomeno può essere provocato da almeno due meccanismi. Il primo è la pseudotrasduzione, o diretto trasferimento della proteina reporter (GFP) sulle cellule da trasdurre, dovuto o alla sua presenza nel surnatante, o alla sua accidentale incorporazione nelle particelle del vettore (Liu et al. 1996). Il secondo meccanismo coinvolge l’espressione transiente del gene reporter nella cellula target prima dell’integrazione del vettore nel genoma cellulare (Haas et al. 2000). La positività alla GFP che osserviamo può essere quindi il contributo di questi due fenomeni e ciò suggerisce la necessità di ulteriori prove per affermare con certezza l’avvenuto trasferimento del transgene. Uno dei metodi per escludere questo fenomeno è propagare le cellule trasdotte per un periodo prolungato, monitorando periodicamente al FACS la percentuale di fluorescenza relativa. Nel nostro caso le cellule trasdotte monitorate per circa un mese hanno mostrato livelli di fluorescenza (espressione di GFP) costanti per tutta la durata dell’osservazione, suggerendo che il vettore si sia integrato nel genoma cellulare in maniera stabile, fatto che permette l’espressione a lungo termine del transgene.
Nel loro insieme questi risultati indicano quindi che gli obiettivi perseguiti da questo lavoro di tesi sono stati raggiunti. Il costrutto plasmidico per la fase di priming veicolante il fGM-CSF ed Env ha dimostrato di esprimere sia la citochina biologicamente attiva che Env rilevabile per Western Blot effettuato sulle cellule trasfettate. Questo costrutto è quindi pronto per l’inoculo in vivo.
Analogamente il costrutto vettore, che nella sua versione definitiva veicolerà fIFN-γ ed Env e verrà utilizzato nella fase di boost, ha dimostrato la capacità di trasdurre ad alta efficienza fibroblasti in coltura, esibendo alti e duraturi livelli di espressione di GFP (gene reporter al posto di fIFN-γ) ed Env nelle cellule trasdotte. Nella prosecuzione di questo studio, gli obiettivi immediati prevedono quindi l’ottimizzazione del sistema di trasduzione su linee linfoblastiche e linfociti primari e la sostituzione di GFP con fIFN-γ. Il costrutto vettore nella sua versione definitiva verrà poi valutato per livello di espressione di Env ed fIFN-γ nelle cellule trasdotte. Per quest’ultimo punto sarà utilizzato un saggio ELISPOT allestito recentemente nei nostri laboratori (Flynn et al. Submitted).
Al termine di questa fase verrà iniziato il protocollo di vaccinazione che, come descritto in precedenza, si avvarrà di una preimmunizzazione con il plasmide codificante per Env e fGM-CSF. A questa seguiranno uno o più richiami con linfociti trasdotti in vitro con il vettore FIV che esprime Env e fIFN-γ. Verrà analizzata la risposta immunitaria anticorpale e cellulo-mediata negli animali vaccinati e, infine, sarà effettuata una sfida con un isolato primario virulento al fine di valutare il livello di protezione conferito.
