Materiali e Metodi
2.3.b Precipitazione alcolica
Il DNA viene precipitato aggiungendo al prodotto sopranatante 2V di EtOH assoluto e 0,1 V di CH3COONa 3 M, pH 5.2. Dopo aver agitato la soluzione, si mette la miscela a precipitare 60 minuti a -80°C, oppure o/n a -20°C. Quindi si centrifuga per 20 minuti a 12000 RPM e si lava il pellet dai sali con EtOH 70% freddo. Una volta che il pellet è asciugato, all’aria o con l’ausilio di una pompa a vuoto, si risospende il DNA in acqua sterile o in TE pH 8 e si conserva a -20°C.
La concentrazione di linearizzato viene stimata su gel, dal confronto con preparazioni di DNA a concentrazione nota.
2.3.c Elettroforesi su gel di agarosio
L’elettroforesi su gel di agarosio viene comunemente utilizzata per vari scopi: ad esempio, per verificare il grado di completezza raggiunto dalla digestione del DNA e per stimare, inoltre, la concentrazione dei plasmidi estratti e/o linearizzati, la lunghezza in paia di basi dei frammenti amplificati per PCR o per verificare, dopo digestione con enzimi di restrizione, l'identità dei plasmidi estratti.
I gel vengono preparati sciogliendo l’agarosio (0,8-1,5% peso/volume) in TBE e portando ad ebollizione. La soluzione viene lasciata raffreddare e, prima che polimerizzi, si aggiunge EtBr ad una concentrazione finale di 10 µg/ml. A questo punto viene fatta polimerizzare in un'apposita vaschetta in 57
Materiali e Metodi
presenza di un pettine, che permette la formazione dei pozzetti. Una volta polimerizzato, il gel viene collocato nell’apparato da elettroforesi ed immerso nel tampone di corsa TBE a pH 8.
I campioni devono essere diluiti in TE e loading buffer, la cui funzione è di appesantire il campione, grazie alla presenza di glicerolo, facendolo andare sul fondo del pozzetto, e consentire, allo stesso tempo, di seguire la corsa elettroforetica grazie alla presenza di due coloranti (blu di bromofenolo e xilene cianolo) a diverso peso molecolare, che corrono a velocità diverse.
Dopo aver caricato i campioni sul gel, si applica una differenza di potenziale di 50-120 V per un tempo variabile dai 5 ai 60 minuti. Al termine della corsa, il gel viene posto sotto raggi UV per visualizzare le bande; il bromuro di etidio che si è intercalato fra le basi del DNA appare, infatti, fluorescente. Le dimensioni dei frammenti sono stimate in presenza di marcatori con peso molecolare noto.
Soluzioni:
TBE pH 8.0
Tris base 0,09 M
Acido borico 0,09 M
EDTA 2 mM
Loading buffer 6x tipo III
Glicerolo 30%
Blu di bromofenolo 0,25% Xilene cianolo 0,25%
Materiali e Metodi
Gel di agarosio
Agarosio 0,8-1,5% (peso/volume)
Bromuro di etidio 10 µg/ml finale
TBE 1X
2.3.d Estrazione di DNA da gel di agarosio
Con tale procedura è possibile estrarre singoli frammenti di DNA da gel, dopo averli separati mediante una corsa elettroforetica. Questo metodo permette di separare i frammenti ottenuti dalla digestione di un vettore con endonucleasi di restrizione, come, ad esempio, l'inserto ed il vettore in cui era inserito. Analogamente, è possibile eluire frammenti di DNA da gel, ottenuti mediante amplificazione per PCR. Dopo aver effettuato la corsa elettroforetica, per un tempo sufficiente a garantire una buona separazione dei frammenti, si procede all'escissione della banda, visibile al transilluminatore UV, ritagliandola con una lama. Per il protocollo di estrazione abbiamo utilizzato il kit di estrazione "NucleoSpin Extract", fornito dalla ditta Macherey-Nagel. Dopo aver pesato la banda, ritagliata dal gel, con una bilancia di precisione, si aggiunge la soluzione NT1, che contiene sali caotropici e sostanze per disciogliere l'agarosio, in rapporto 300 µl di soluzione : 100 mg di agarosio. Si lascia incubare la miscela a 50°C per 10 minuti, agitando ogni 2-3 minuti. Il campione viene poi caricato in colonnine "NucleoSpin Extract", da cui si effettua l'eluizione centrifugando per 1 minuto a 11.000 RPM. La soluzione NT1 facilita, infatti, il legame del DNA al supporto di silice della colonnina. Dopo aver eliminato l'eluato, si aggiungono 600 µl di soluzione NT3,
