2-MATERIALI E METODI

2-MATERIALI E METODI

2.1 Animali.

Gli animali utilizzati per gli esperimenti sono topi (Mus musculus) delle linee C57Bl/6 (6-8 mesi, di entrambi i sessi) e C57Bl/ks db/db e wild type (3 mesi, maschi). Gli animali sono stati forniti dalla ditta Harlan (Harlan Sprague Dawley Inc, 298 S Carroll Rd, Indianapolis, IN 46229-3910 U.S.A.). Gli animali vengono cresciuti in singole gabbie, in un ambiente controllato (21°C; umidità 60%), a cicli alternati luce/buio di 12 ore, con cibo ed acqua sempre a disposizione.

2.2 Prelievo dei tessuti.

Gli animali vengono sacrificat,i al termine del periodo notturno, per asfissia in una cameretta satura di bi-ossido di carbonio. Gli esemplari vengono quindi pesati e sottoposti a dissezione al fine di prelevare il deposito adiposo perigonadale e/o perirenale, Per ogni esperimento vengono utilizzati animali dello stesso sesso, della stessa età e approssimativamente dello stesso peso.

2.3 Induzione del differenziamento adipocitario nei fibroblasti 3T3

L1.

La linea cellulare stabile 3T3 L1 di fibroblasti murini, viene cresciuta in DMEM (con siero bovino fetale al 10% e con l’aggiunta di 100 mM di sodio piruvato, 200 U/ml di penicillina (Invitrogen) e 50 μg/ml di streptomicina (Invitrogen) ). Due giorni dopo la confluenza (giorno 0) le cellule sono state stimolate con un cocktail di differenziamento costituito da 0.5 mM IBMX (Isobutylmethylxanthine), 1 μM Dexamethasone, (Sigma) e 167 nM insulina (Sigma). Dopo due giorni, il mezzo viene cambiato con del mezzo fresco contenente insulina alla concentrazione di 167 nM. Dopo 48 ore il mezzo viene

cambiato con DMEM minimo fresco, che viene cambiato regolarmente ogni due giorni, per 10 giorni.

2.4 coltura primaria di adipociti di topo.

2.4.1 Trattamento con collagenasi.

Il tessuto adiposo proveniente da ciascun animale, viene lavato in 10mM PBS (phosphate buffer saline, per un litro si prepara : 0.23 gr NaH2PO4 ; 1.15 gr Na2HPO4 ;

8.75 gr NaCl ; H2O distillata fino a volume; pH= 7.4) e pesato, quindi sminuzzato in

frammenti di 2mm circa e trasferito in tubo Falcon da 50ml contenete KRBH buffer (Krebs-Ringer-bicarbonate-HEPES, per un litro si prepara: 7.12 gr HEPES (acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico; Sigma) ; 7 gr NaCl ; 0.55 gr KH2PO4 ; 0.25 gr

MgSO4 X 7 H2O ; 0.84 gr NaHCO3 ; 0.11 gr CaCl2 ; 10 gr BSA (Bovine Serum

Albumine, Sigma) ; 200 nM adenosina ; H2O a volume ; PH= 7.4).

Viene utilizzato 1ml di KRBH buffer per ogni grammo di tessuto adiposo pesato. Viene aggiunto un volume di 250 μl di soluzione KRBH + Collagenasi (Collagenasi (Sigma) 20mg/ml in KRBH, filtrata attraverso φ = 0.22 mm ) in modo da avere una soluzione contenente 1 mg di collagenasi per ogni grammo di tessuto adiposo ottenuto.

Il campione viene tenuto in bagno termostatato, in blanda agitazione a 37°C per 1 ora.

Viene aggiunto un volume di 10ml di KRBH buffer preriscaldato a 37°C, quindi il campione viene trasferito, attraverso un filtro di φ=250 μm, in un nuovo tubo. Al volume recuperato si aggiungono 30 ml di KRBH buffer e si centrifuga a 1100x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Seguono due lavaggi con 40 ml di KRBH buffer e due lavaggi con D-MEM (Dulbecco modified Eagle’s medium: 25 mM Glucosio ;25 mM HEPES ; 2mM Glutammina ; 200nM PIA ( (-)-N6-R-fenil-isopropil-adenosina ) ; 100 μgr/ml Gentamicina (invitrogen); pH = 7.4). Alla fine di questa procedura, gli adipociti si presentano come un surnatante di aspetto cremoso (fat cake).

Viene accuratamente raccolto il fat cake e in base al volume ottenuto, si aggiungono 1-2 ml di DMEM. Viene stimato il numero totale di adipociti ottenuti, tramite conteggio in emocitometro (camera di Burker) in base al quale si effettua adeguata diluizione del

campione con DMEM affinché ogni ml di sospensione contenga approssimativamente 2x106 cellule.

In base al numero totale di cellule ottenuto, si suddivide la sospensione nelle classi sperimentali in modo che ogni replica contenga almeno 1x106 cellule.

2.4.2 Protocollo di induzione.

Si suddividono i pozzetti contenenti gli adipociti, secondo i gruppi sperimentali: A)controllo , B)trattamento con insulina , C) trattamento con dexametasone e si lasciano riequilibrare le cellule per circa 1 H , 30’ a 37°C in atmosfera al 5% di CO2 .

Le colture sottoposte a trattamento (B e C), ricevono rispettivamente 1ml di soluzione contenente insulina (Sigma) 200 nM o 1 ml di soluzione contenente dexametasone (Sigma) 150 nM. i pozzetti destinati a controllo ricevono 1 ml di DMEM-B (7% BSA (Bovine Serum Albumine, Sigma) in DMEM).

L’incubazione viene protratta per altre 6-7 ore, durante le quali viene ripetuto un conteggio delle cellule in ogni replica, tramite emocitometro e viene valutata, morfologicamente, l’integrità cellulare.

Da ciascun pozzetto si preleva una aliquota del mezzo di coltura per il test E.L.I.S.A. (vedi punto 2.5), mente gli adipociti vengono raccolti accuratamente e sottoposti a centrifugazione a 2500 rpm per 4 minuti a 4°C.

Il surnatante contenente gli adipociti, viene raccolto e processato per l’estrazione dell’RNA totale (vedi punto 2.10).

2.5 TEST E.L.I.S.A.

il mezzo di coltura degli adipociti raccolto, viene sottoposto a test E.L.I.S.A. (enzime linked immuno-sorbent assay) nel quale la quantità di leptina secreta, nelle diverse condizioni di coltura, viene valutata tramite Quantikine mouse leptin immunoassay kit (Research & Diagnostics).

L’intensità del colore del substrato cromogeno, proporzionale alla quantità di leptina in ogni pozzetto, viene letta da un colorimetro (Molecular Device). La concentrazione

della leptina nei campioni viene dedotta per estrapolazione da una curva di taratura ottenuta tramite test E.L.I.S.A. su quantità scalari e note di leptina ricombinante, fornita anch’essa con il Quantikine mouse leptin immunoassay kit. I dati ottenuti con test E.L.I.S.A. vengono normalizzati per il numero di adipociti presenti in ciascun pozzetto.

2.6 Condizioni RNase-Free (RF).

Nelle procedure che hanno come oggetto la manipolazione dell’RNA, si utilizza H2O trattata con dietilpirocarbonato (DEPC) 1/1000 per alcune ore quindi autoclavata;

la vetreria viene trattata in stufa a 180°C per 4-5 ore, puntali Gilson e tubi Eppendorf, vengono autoclavati.

2.7 Elettroforesi.

Nell’elettroforesi di RNA viene impiegato gel denaturante all’1% , per ottenere 40ml di gel, si prepara: 30ml H2O DEPC ; 4ml 10X MOPS ; 0,4 gr Agarosio in polvere

(Sigma) ; 6ml Formaldeide (Sigma).

Per ottenere un volume di 250 ml di 10X MOPS si preparano: 20,93gr MOPS (3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid, Sigma) ; 2,05gr sodio-acetato ; 1,86gr EDTA (acido etilenediamminetetracetico, Sigma) ; H20 fino a volume ; pH = 7

La soluzione viene filtrata attraverso pori di diametro φ =0,45 μm.

I campioni sono diluiti in 3X loading buffer (per 750 μl di 3X Loading Buffer per RNA si prepara: 500μl Formammide, Sigma ; 150μl Formaldeide, Sigma ; 100μl MOPS 10X ; 0,7μl Bromuro di etidio), denaturati per 5-10 minuti in bagno termostatato a 65°C, messi in ghiaccio per 2-3 minuti e sottoposti a corsa elettroforetica in MOPS 1X.

Per la corsa elettroforetica del prodotto del test di poliadenilazione (vedi punti 2.15 e 2.16) e dei prodotti di RT-PCR (vedi punto 2.12) si è usato un gel di agarosio al 2%, per

ottenere 80 ml di gel si prepara: 80ml 1X TAE ; 1,6 gr Agarosio in polvere (Sigma) ; 8μl Bromuro di etidio.

Per preparare 1X TAE (tris-acetato-EDTA), occorrono: 40mM 1XTris (tris(hydroxymethyl) aminometano (Sigma); 20mM Acido acetico; 1mM EDTA ( acido etilenediamminetetracetico (Sigma) ; pH= 7.6).

I campioni sono caricati utilizzando Loading dye buffer 6X (30%Glicerolo ; 0.3%Blu di bromofenolo (Sigma) ; 0.3% Xilene cianolo (Sigma) ) e fatti correre in 1X TAE.

Per purificare il DNA stampo da utilizzare per produrre la sonda marcata con α(32_{P)dCTP, (vedi punto 2.18), viene utilizzato un gel a basso punto di fusione.}

Per 20ml di 1% Low melting temperature gel si prepara: 20ml 1X TAE ; 0.2gr Low melting temperature gel powder (Sigma) ; 2μl Bromuro di etidio.

I campioni vengono caricati con il medesimo buffer e fatti correre in 1X TAE.

2.8 Condizioni generali di PCR.

Ci siamo serviti della seguente mix di amplificazione in condizioni e coppie di primers (Primer F , Primer R) variabili, indicate, di seguito, nei casi specifici: 4μl 10X Buffer PCR (National Diagnostic-Polymed) ; 1.5μl MgCl2 50 mM (National

Diagnostic-Polymed) ; 2μl dNTPs 2.5 mM (Boehringer Mannheim) ; 0.6μl Primer F 20 μM ; 0.6μl Primer R 20 μM ; 0.35 μl Taq polimerasi (5 U/μl National Diagnostic-Polymed) ; 18 μl H2O (sterile ultrapura).

2.9 Primers utilizzati.

I primers sono stati sintetizzati dalla ditta MWG-BIOTECH Inc.

a) Oligo-d(T Anchor)12 : 5’-CGCGGCCGCGTTTTTTTTTTTTTT-3’

b) Leptin # 1: 5’-CCTTGCACTATGGCTTGTTCCCA-3’ c) Leptin F 3’ UTR: 5’-GTGGTGCTAAGAGAGGAGTTGG-3’ d) CPEB F: 5’-AAGTTCCCAGCACCCTCAGTTAG-3’

e) CPEB R: 5’-GCTTGTTCTTGGTCCATTCGG-3’ f) AP2 F: 5’-CCTTGCACTATGGCTTGTTCCCA-3’

g) Leptin 3’ Probe F: 5’-GAAACTTCCCATATGCAAAA-3’

h) Leptin 3’ Probe R : 5’-GGAGGCATCATTAATTTATTTGAATT-3’ i) Oligo d(T)12 : 5’-TTTTTTTTTTTT-3’

j) Oligo d(T)18 : 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

2.10 Estrazione di RNA totale.

Per l’estrazione di RNA totale, viene impiegato Tri-Pure isolation reagent (Boerhinger-Mannheim). La tecnica utilizzata è una variante del metodo Chomczynski-Sacchi (Chomczynski e Chomczynski-Sacchi, 1987), che impiega guanidina-tiocianato e fenolo/cloroformio. I campioni vengono omogeneizzati in un tubo di polipropilene, a temperatura ambiente, per 5 minuti utilizzando 1 ml di Tri-Pure isolation reagent per ogni 50-100 mg di tessuto prelevato o per 5-10x106 cellule (si usano 0.8ml di tripure isolation reagent, per quantità inferiori di cellule). Per incrementare la resa nella fase di precipitazione dell’RNA, si aggiunge 1μl di glicogeno (10μg/ml) a ciascun campione. Il campione viene quindi centrifugato per 10 minuti a 10000x g a 4 °C, per eliminare sia le membrane che altri detriti cellulari che si accumulano sul fondo della provetta, mentre i lipidi formano invece un anello oleoso sovrastante il campione. Viene raccolta l’interfase di color rosa e trasferita in una nuova provetta, vengono aggiunti 0.2ml di cloroformio per ogni ml di tripure isolation reagent utilizzato; la soluzione viene uniformata utilizzando un vortex e lasciata a temperatura ambiente per 10 minuti; si ottiene quindi una separazione in 3 fasi del campione per centrifugazione a 10000x g per 15 minuti a 4 °C. Viene recuperato il surnatante incolore, contenente l’RNA, al quale si aggiunge un volume di 0.5 ml di isopropanolo RF per ogni millilitro di Tri-pure utilizzato. La soluzione viene lasciata in ghiaccio per 30 minuti e quindi centrifugata a

10000x g per 10 minuti a 4 °C. Il pellet che si forma sul fondo della provetta viene lavato con 1 ml di etanolo RF al 75% per ogni millilitro di Tri-pure usato, tramite centrifugazione a 7500x g per 5 minuti a 4 °C. Il pellet di RNA così ottenuto viene essiccato e risospeso con un adeguato volume (10-50) μl di acqua DEPC (RNasi-Free). I campioni vengono conservati a -80°C.

2.10.1 Determinazione della concentrazione e purezza dell’RNA estratto.

La concentrazione dell’RNA ottenuto da ciascun campione, viene determinata mediante esame spettrofotometrico di una aliquota della sospensione diluita in H2O.

Tenendo conto della diluizione, si considera che ogni unità di densità ottica (OD) letta dallo spettrofotometro (Biorad), ad una lunghezza d’onda di λ=260nm, corrisponde a 40ng di RNA. Viene valutato anche il rapporto tra valori di assorbanza A260/A280 che è

indice del grado di purezza dell’RNA. L’integrità e l’eventuale contaminazione con DNA genomico dell’RNA estratto, viene valutata anche attraverso esame del profilo elettroforetico di una aliquota della sospensione utilizzando gel denaturante all’ 1% (vedi punto 2.7).

2.11 Trattamento con DNasi I.

Il procedimento di estrazione dell’RNA con TRI-Pure, produce un campione sufficientemente puro di RNA (coefficiente A260/A280 ~2), tuttavia prima di passare alla

retrotrascrizione in cDNA è opportuno procedere con un trattamento di digestione del DNA genomico che, seppur presente in tracce, potrebbe inficiare il risultato del successivo saggio di poliadenilazione.

Da ogni campione si aliquota un volume contenente 3 μg di RNA, al quale si aggiunge la seguente mix : 9.1 μl Perkin Elmer Buffer 10X ; 1μl Inibitore delle ribonucleasi (RNase-inhibitor 40U/μl; (Boehringer Mannheim) ; 2 μl Deossiribonucleasi-I (DNaseI RNase-free, 10U/ml; Boehringer Mannheim) ; H2O

DEPC fino ad un volume di 57 μl.

La soluzione viene incubata a 37°C per 30 minuti in un bagno termostatato. Si estrae l’RNA aggiungendo 30 μl di fenolo acido + 30 μl di cloroformio-alcool isoammilico 49:1 pH=8 e centrifugando a 13000x g per 5 minuti a 4°C. Si conserva la fase acquosa (surnatante, circa 60 μl), dalla quale si precipita l’RNA aggiungendo un volume

approssimativamente 2.5 X (circa150 μl) di etanolo assoluto RF freddo. In queste condizioni l’RNA può essere mantenuto a -20 °C per un utilizzo a breve termine o conservato a -80°C per periodi più lunghi.

2.12 3’RACE (rapid amplification of cDNA ends) dell’ mRNA della

Leptina.

Questa tecnica consente di ottenere un ds-cDNA, corrispondente alla regione 3’UTR completa di uno specifico mRNA, di sequenza nota solo in parte al 3’UTR.

Si fa uso di un primer cosiddetto “ancorato”, costituito da un oligomero di Timidina a cui è aggiunta una coda di sequenza arbitraria nota: Oligo-d(T Anchor)12, (vedi

paragrafo 2.9 a) ) che, appaiandosi alle code di poliadenilazione degli mRNA, funge da innesco per la retrotrascrizione e contemporanemente fornisce un substrato specifico per la seguente amplificazione.

2.12.1 Fase di retrotrascrizione.

Un volume della sospensione di RNA totale, conservato in etanolo assoluto dopo trattamento con DNasi-I, contenente 1 μg di RNA, viene centrifugato a 12000x g per 15 minuti a 4°C. Il pellet viene lavato con etanolo 70%, centrifugando a 12000x g per 10 minuti a 4°C, quindi essiccato e risospeso in 5 ml di H2O RF. I campioni vengono

denaturati a 65°C per 15 minuti, centrifugati rapidamente e messi in ghiaccio.

Si aggiunge la seguente mix di retrotrascrizione: 4μl Buffer di retrotrascrizione 5X (Gibco-BRL) ; 2μl DTT (Ditiotreitolo, Gibco-BRL) ; 0.1μl RNase inhibitor (40U/μl, Boehringer Mannheim) ; 1μl Superscript II (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, 200U/μl, Gibco-BRL) ; 1μl Oligo-d(T)12 primer 25μM (Gibco-BRL) ;

H2O fino a un volume finale di 20 μl.

I campioni sono incubati per 1 ora a 37°C, quindi la trascrittasi inversa viene inattivata, portando la temperatura a 95 °C per 5 minuti. A questo punto si dispone di un pool di ss-cDNA di sequenza complementare ad una porzione estesa della regione 3’ terminale, degli mRNA cellulari. L’elevata processività della trascrittasi inversa,

garantisce che l’mRNA della leptina venga retrotrascritto per un buon tratto, oltre l’ultima porzione di sequenza nota al 3’ UTR.

2.12.2 Fase di amplificazione per PCR.

Ad 1μl del prodotto di retrotrascrizione, viene aggiunta la mix generica di amplificazione del punto 2.8.

I primers utilizzati sono:

Primer F= Leptin F 3’ UTR 20 μM Primer R= Oligo-d(T Anchor)12

La reazione di PCR viene condotta nelle seguenti condizioni 93°C/ 5 ‘ 93°C / 30’’ 58°C / 30’’ 72°C / 1’ 72°C / 7’

La sequenza del primer Leptin F 3’ UTR, è equivalente ad una tratto del 3’ nella sequenza nota del trascritto della leptina; si ottiene quindi un ds-cDNA della porzione ingnota del 3’UTR del messaggero, compresa tra la regione analoga al primer Leptin F 3’ UTR e la coda di poliadenilazione. (vedi figura 3).

2.13 Sequenziamento del cDNA della Leptina.

Il cDNA ottenuto per 3’ RACE, corrispondente alla regione terminale 3’UTR dell’ mRNA della leptina, è stato sottoposto a purificazione (Qiaquick gel extraction kit, Qiagen) e sequenziamento automatico utilizzando il “Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS)-Quick start kit” (GenomeLab™ , BeckmanCoulter).

Il cDNA viene aggiunto alla seguente mix di sequenziamento: 8 μl DTCS ; 2 μl di primer (3.2 μM) e dH2O fino a 20μl.

La soluzione viene sottoposta a PCR con il seguente programma

96°C/ 20’’ 50°C / 20’’ 60°C / 4’

Al prodotto di PCR si aggiunge la seguente mix di purificazione: 5μl: 2μl Na-acetato 3M pH=5.2 ; 2μ Na-EDTA 125 mM pH=8 ; 1μg glicogeno e 60 μl di etanolo assoluto freddo.Si uniforma la soluzione con vortex e si sottopone a centrifugazione a 13000 rpm per 15’ a 4°C. Il pellet ottenuto viene lavato con 200 μl di etanolo 70% freddo, centrifugando a 13000 rpm per 5’ a 4°C. Si ripete il lavaggio, quindi il pellet viene essiccato all’aria e risospeso in 40μl di soluzione SLS (sample loading solution,fornito con il kit) e caricato sul sequenziatore automatico (Beckman).

2.14 Retrotrascrizione ed amplificazione (RT-PCR) dell’ mRNA di

CPEB.

Tramite RT-PCR, è stata valutata la presenza di mRNA per la proteina CPEB (cytoplasmic polyadenylation element binding protein) nel tessuto adiposo bianco di topo, utilizzando RNA totale estratto da adipociti. Come controllo positivo e negativo è stato utilizzato RNA totale estratto rispettivamente da ovaie e milza di topo (vedi punto 2.10).

2.14.1 Fase di retrotrascrizione.

Il procedimento è analogo a quello descritto al punto 2.12.

Ad 1μl del prodotto di retrotrascrizione viene aggiunta la mix generica di amplificazione descritta al punto 2.8, la coppia di primers utilizzata in questo caso, è la seguente:

Primer F = CPEB F 20μM Primer R = CPEB R 20μM

La reazione di PCR viene condotta nelle seguenti condizioni:

93°C/ 5 ‘ 93°C / 30’’ 58°C / 30’’ 72°C / 1’ 72°C / 7’ 4°C ad libitum

30 cicli

Il cDNA corrispondente all’mRNA di CPEB così prodotto, viene risolto per elettroforesi su gel di agarosio al 2%.

2.15 Saggio di poliadenilazione RACE-PAT

2.15.1 Fase di retrotrascrizione.

Dall’RNA conservato in etanolo assoluto dopo trattamento con DNasi I, si preleva un’aliquota contenente 1 μg di RNA. Si ottiene un pellet tramite centrifugazione a 12000x g per 15 minuti a 4°C. Il pellet viene lavato con etanolo 70% centrifugando a 12000x g per 10 minuti a 4°C, quindi risospeso in 5 ml di H2O RF. Viene aggiunto 1 μl

di oligo dT anchor primer (vedi punto 2.9) 200 μg/μl. La soluzione viene incubata a 65°C per 8 minuti, quindi trasferita in ghiaccio. Si aggiunge velocemente la seguente mix di retrotrascrizione: 4μl Superscript II Buffer 5X (Invitrogen) ; 1μl RNasi inhibitor

(Invitrogen) ; 1μl DTT (ditiotreitolo) 0.1M (Invitrogen) ; 1μl dNTP 10mM (Roche) ; 1μl Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Superscript II: 200U/μl, Invitrogen); 4μl DEPC H2O

La reazione di retrotrascrizione, viene eseguita nella macchina da PCR nelle seguenti condizioni:

42°C / 60’ 65°C / 15’ 4°C / ad libitum

2.15.2 Fase di amplificazione.

Questa fase viene eseguita in duplicato e in parallelo per ogni campione.

Ad 1 μl del prodotto di retrotrascrizione di ogni campione, viene aggiunta la mix generica di amplificazione indicata al punto 2.8 .

I primer utilizzati sono i seguenti:

amplificazione leptina: Primer F = Leptin #1, 20 μM

Primer R = olgod(T) anchor primer, 20 μM

controllo negativo Primer F = AP2F, 20 μM

Primer R = olgod(T) anchor primer, 20 μM

La reazione viene condotta nelle seguenti condizioni:

93°C/ 5 ‘ 93°C / 30’’ 58°C / 30’’ 72°C / 1’ 72°C / 7’ 4°C ad libitum

35 cicli con Primer F= leptin #1

/

Il prodotto finale del procedimento di RACE-PAT, viene sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio in TAE al 2% per 2 ore ad una differenza di potenziale di 70-90V.

Viene conservata una foto (acquisita al transilluminatore) del profilo elettroforetico. affiancato da una scala centimetrica di riferimento, allineata al segnale del ladder (1Kb DNA ladder, Gibco-BRL).

2.16 Saggio di poliadenilazione LM-PAT (ligase mediated-Polyadenylation

La tecnica di LM-PAT è una modificazione del metodo RACE-PAT descritto al punto precedente.

2.16.1 Fase di incubazione e ligation.

All’RNA risospeso in H2O RF, come descritto al punto 2.11, vengono aggiunti 20

ng di un oligo dT, p(dT)12-18 . I campioni vengono denaturati a 65°C per 5-10 mninuti,

quindi trasferiti rapidamente a 42 °C.

Per ogni campione si aggiungono 13 μl della seguente mix di ligation: 2μl T4-Ligasi Buffer 10X (Biolabs, contenente DTT e ATP) ; 1μl RNase-Out (Invitrogen) ; 1μl dNTPs 10mM ; 1μl T4 Ligasi (Biolabs) ; 8μl H2O DEPC , quindi vengono incubati a 42 °C per

30’

Si aggiunge 1 μl di oligo d(T)12 primer (vedi punto 2.9) 200 ng/ml, segue

incubazione per 2 ore a 12°C.

2.16.2 Fase di retrotrascrizione.

I campioni sono Incubati per 2 minuti a 42°C, viene aggiunto 1 μl di Superscript II (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase: 200U/μl, Invitrogen) a ciascuna mix ed incubata a 42 °C per 1 ora. Segue inattivazione termica della trascrittasi inversa a 65 °C per 20 minuti.

Un volume di 1.2 μl di cDNA così ottenuto, viene amplificato tramite PCR e sottoposto a corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% come descritto nel caso della RACE-PAT (vedi punto 2. 15).

2.17 Southern blotting.

I gel della corsa elettroforetica dei saggi di poliadenilazione vengono immersi in HCl 0.25M per circa 15 minuti, lavati con H2O distillata e trattati con soluzione

denaturante (NaCl, 1.5M ; NaOH, 0.5) per 30 minuti su agitatore basculante.

Dopo un lavaggio con H2O distillata, ogni gel viene sottoposto a due lavaggi,

ciascuno da 15 minuti, con soluzione neutralizzante (NaCl 1.5M ; Tris-HCl 0.5M pH = 7.2; EDTA, 10mM).

Viene allestito un apparato per Southern blot (come descritto in Sambrook et al., 1989) utilizzando un filtro di nitrocellulosa (HybondTM N+; Amersham ) e SSC 20X (NaCl 3M ; Sodio citrato, 0.3M) come buffer di trasferimento per capillarità. Alla fine del trasferimento del DNA (overnight blotting) il filtro viene rimosso, lavato con SSC 20X e sottoposto a cross-linking del cDNA con la membrana, in stufa a 80°C per 2 ore.

Per controllare l’avvenuto trasferimento alla fine del Southern blotting, il gel recuperato, viene tenuto per 15 minuti in una soluzione acquosa di bromuro di etidio 1:1000, quindi lavato con acqua distillata per 10’ e osservato al transilluminatore.

2.18 Allestimento della sonda marcata con α(

P)dCTP.

Per determinare la specificità del segnale ottenuto tramite RACE-PAT o LM-PAT, il filtro viene ibridato con una sonda che riconosce una zona del 3’UTR della leptina “nested“, ovvero interna al frammento prodottoto con la PCR.

Tale frammento si genera utilizzando la coppia di primers sotto riportata (vedi figura 3).

Primer F= Leptin 3’ Probe F 20μM Primer R= Leptin 3’ Probe R 20μM

Le condizioni di NESTED-PCR sono le seguenti:

90 °C/5’ 94°C/30’’ 54 °C / 30’’ 72 °C / 45’’ 72 °C / 5’ 4°C ad libitum

2.18.1 Isolamento banda e HOT-PCR.

Il prodotto di Nested-PCR, viene risolto su un low melting temperature gel di agarosio all’1%. La porzione di gel contenente la banda all’ altezza attesa di 200 pb, viene tagliata e sciolta in termostato a 65°C per 10 minuti, una aliquota di 1.2 μl viene utilizzata per la riamplificazione in presenza di precursore radioattivo, utilizzando la seguente mix: 5μl PCR Buffer 10X (Roche) ; 2μl Primer F= (Leptin 3’ Probe F, 20μM) ; 2μl Primer R= (Leptin 3’ Probe R, 20μM) ; 4μl Mix nucleotidi trifosfati (dATP+dTTP+dGTP, Boehringer Mannheim) 2.5mM ; 0.5μl Mix dNTPs completi 0.25 mM (Boehringer Mannheim) ; 5μl (α32_{P)dCTP (10μCi/μl, Amersham) ; 0.6μl Taq}

polimerasi (5U/ml, National Dioagnostic.Polymed) ; H2O fino a volume di 50ml

Le condizioni di PCR sono le seguenti:

90 °C/5’ 94°C/1’ 53 °C / 2’ 4°C ad libitum 30 cicli

26 cicli

2.18.2 Purificazione sonda.

Viene impiegata la tecinca chiamata Spin-column chromatography, utilizzando una micro colonna di Sephadex ProbeQuanttm G-50 (Amersham) che permette di purificare il DNA marcato dai nucleotidi non incorporati. Il Sephadex viene risospeso con Il buffer contenuto nelle colonne, tramite un pre-spin a 3000x g in microcentrifuga (Eppendorf) per 1 minuto. L’eluito viene scartato e si aggiunge un volume di 50 μl di prodotto di HOT-PCR alla colonna. L’eluizione si ottiene per centrifugazione a 3000x g in microcentrifuga per 1 minuto. Nel tubo di raccolta è contenuta la sonda di DNA marcato con α(32_{P)dCTP. L’attività della sonda viene letta con un contatore-β (LKB}

Wallac 1211 RACK BETA).

2.19 Ibridazione su filtro.

I filtri di nitrocellulosa provenienti dal Southern Blot (vedi punto 2.17) vengono inseriti in tubi di idonea capienza, ai quali vengono aggiunti rispettivamente 4 o 8 ml (le dimensioni dei filtri sono variabili in relazione al numero di campioni trattati) di un buffer di ibridazione commerciale: Rapid Hyb Buffer (Amersham). I tubi vengono chiusi e disposti su un dispositivo rotante in stufa a 65 °C per 1 ora. La sonda viene denaturata a 95°C per 10 minuti, quindi aggiunta nei tubi, in una quantità tale che la sua attività sia pari a 1x106 cpm per ogni ml di soluzione di ibridazione. I tubi vengono lasciati a ruotare per tutta la notte, viene quindi scartato il buffer di ibridazione, i filtri vengono estratti e sottoposti a 2 lavaggi di 30 minuti in stufa a 65°C su supporto rotante, con la soluzione di lavaggio (0.1X SDS in 2X SSC). I filtri vengono quindi sigillati in pellicola trasparente su un supporto di carta 3MM in modo che non si secchino, ed esposti a lastra autoradiografica (BiomaxTM MS, Kodak) a -80 °C per periodi variabili di tempo (2-4 ore) in funzione dell’esposizione desiderata. Alternativamente i filtri vengono direttamente valutati per quanto riguarda il loro contenuto di 32P, tramite esposizione su Phospho-Imager.

2.20 Analisi del contenuto di

P.

Viene utilizzato un Cyclone Phospho Imager (Packard Bioscience, Perkin Elmer), dotato di una lastra sensibile all’emissione β del 32_{P, sulla quale vengono applicati i}

filtri di nitrocellulosa ibridati con sonda radioattiva e tenuti in esposizione al buio per un tempo variabile, in base all’intensità del segnale osservato sulle lastre autoradiografiche (circa 20 minuti per ogni filtro). Il segnale acquisito dalla lastra del Cyclone, a parità di tempo di esposizione, è direttamente proporzionale alla quantità di sonda ibridata sui filtri. Il software di cui l’apparecchio è dotato (OptyQuant), genera un’immagine replica del filtro di nitrocellulosa e consente di comparare l’intensità del segnale rilevato in punti differenti della lastra. L’intensità del segnale di fondo (background noise) viene sottratta dal segnale della sonda. Sulle immagini acquisite dallo strumento, vengono campionati i valori di intensità di segnale a 4 livelli diversi lungo l’intera estensione degli smear per ogni campione di ciascun esperimento (vedi figura 17). Per ogni smear, il segnale rilevato a ciascun livello, viene normalizzato per l’intensità della banda minima da cui lo smear origina. In questo modo è possibile paragonare valori di intensità assoluti tra smear di intensità relativa differenti.

2.21 Estratto di proteine totali da adipociti o da cervello di topo.

Il fat pad estratto dagli animali sacrificati (o il cervello nel caso dei campioni utilizzati come controllo positivo), è stato omogenato in un lysis buffer (3ml di lisys buffer per ogni mg di tessuto) composto da: Tris 20 mM PH = 7.5 ; NaCl , 150mM ; Glicerolo 10% ; Triton X-100 1% ; EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 10mM PH = 8 ; tavoletta di inibitore Roche (Roche Molecular Biochemicals, 1 tab per 10 ml di soluzione).; H2O fino a volume (solitamente 20ml).

L’omogenato è stato poi centrifugato a 13000 rpm per 30’ a 4 °C. Lo strato di grasso superiore e il pellet sono stati scartati ed è stata recuperata la fase intermedia di cui abbiamo valutato la concentrazione proteica (vedi punto 2.23).

2.22 Preparazione di sinaptosomi.

I topi sono stati sacrificati per decapitazione e l’ippocampo è stato prelevato velocemente ed omogeneizzato, con potter, in 40 volumi di saccarosio 0.32 M, pH 7.4 . L’omogenato è stato centrifugato a 1000xg per 5 minuti e il surnatante ottenuto è stato centrifugato nuovamente a 12000xg per 20 minuti, in modo da ottenere un pellet contenente i sinaptosomi (Whittaker, 1988).

2.23 Determinazione del contenuto proteico con metodo BIO-RAD

Viene costruita una curva di taratura di concentrazione proteica utilizzando diluizioni note e progressive di BSA (bovine serum albumine; Sigma), dalle quali viene prelevata una aliquota da 100μl ed addizionata a 500μl BIO-RAD Protein assay Dye Reagent Concentrate (Coomassie Brilliant Blue G250) diluito 1:4 in H2O distillata; viene letta, allo spettrofotometro (DU62 Spectro, Beckam), l’assorbanza della soluzione così ottenuta ad una lunghezza d’onda λ= 595nm. Si misura l’assorbanza di una aliquota di 100μl prelevata da ciascun campione trattata nello stesso modo dello standard; la concentrazione ignota dei campioni, viene quindi dedotta dallo specifico valore di assorbanza rispetto alla curva di taratura

2.24 Western Blotting.

Con lo scopo di valutare la presenza della proteina CPEB (cytoplasmic poliadenylation binding protein) nel tessuto adiposo bianco di topo, un estratto proteico di questo tessuto, viene sottoposto a SDS-PAGE (sodium dodecylsulphate-polyacrylammide gel electrophoresys) e successivo immunoblotting su filtro di nitrocellulosa, come descritto da Sambrook et al. (Sambrook et al. , 1989).

Come controllo positivo, è stato usato un estratto proteico di cervello e una preparazione di sinaptosomi. I campioni vengono risospesi in sample buffer 2X, in modo da uniformare la concentrazione proteica fra i campioni; 10ml di Sample buffer 2X contengono: 5ml TRIS-HCl 0.5 M pH=6.8 ; 0.8gr SDS (sodio dodecil solfato);

3.4ml Glicerolo; 15mg Blu di bromofenolo ; 1ml β-mercaptoetanolo ; H2O distillata fino

a volume

2.24.1 SDS-PAGE.

Si realizza un gel di poliacrilammide al 12% (Sambrook et al. , 1989). Per 1l di TRIS-HCl 1.5M pH=8.8 si prepara: 181.65gr di Trizma base in H2O e si aggiusta il pH

con HCl concentrato.

Per 1l di TRIS-HCl 0.5M pH=6.8 si prepara: 60.55gr di Trizma base in H2O e si pH con HCl concentrato

Per 10ml di Resolving gel 12% si prepara: 2.5ml TRIS-HCl 0.5 M (0.4% SDS) PH = 8.8; 4ml Acrilammide 40% ; 100μl SDS 10% ; 10μl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) ; 100μl APS (ammonio persolfato) 10% ; 3.3ml H20.

Per 4 ml di Stacking gel si prepara: 1.25ml TRIS-HCl 0.5 M (0.4% SDS) PH = 6.8 ; 660μl Acrilammide 30% ; 50μl SDS 10% ; 10ml TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) ; 100ml APS 10% ; 3.1ml H2O

I campioni in sample buffer, vengono quindi bolliti per 5 minuti e risolti sul gel per 15 minuti a 100 V poi a 180 V, fino a fuoriuscita del secondo colorante, utilizzando Running buffer 1X, (per 1 litro si prepara: 14.4gr Glicina ; 3gr Trizma base 1gr SDS ; H2O fino a volume).

Viene caricata una quantità di 50 -100 μg di proteine per ogni campione.

2.24.2 Immunoblotting.

Le proteine risolte per SDS-PAGE sono sottoposte ad elettroblotting (Sambrook et al., 1989) in transfer buffer 1X (per 1 litro si prepara: 14.4gr Glicina ; 3gr Trizma base ; 1gr SDS ; 200ml Metanolo ; H2O a volume) , utilizzando un filtro di nitrocellulosa

(Protran, Schleicher/Schuell, Germany) mantenendo l’apparato per 1 ora e 30 minuti a 100 V.

Il filtro viene rimosso e trattato con blocking solution (per 50 ml di Blocking solution Milk 4% si prepara: 45ml TBS; 2gr Milk (non fatty dry milk protein powder, Biorad) ; 0.2%Tween-20), in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente, per saturare l’area di filtro che non ha legato alcuna proteina dopo trasferimento (siti aspecifici).

Dopo lavaggio di 15 minuti in TTBS (0.1%Tween-20 in TBS) a temperatura ambiente, il filtro viene incubato con l’anticorpo primario (rabbit policlonale

anti-CPEB-1 abcam di topo, ab3465) ad una diluizione di 1:1000 in latte 2% e lasciato overnight in agitazione a 4 °C. Dopo 2 lavaggi da 15 minuti con TTBS ed uno da 10 minuti con TBS, il filtro viene incubato con l’anticorpo secondario (goat, anti-rabbit IgG-AP coniugate, Santa Cruz) diluito 1:3000 in latte al 2% per 2 ore in agitazione a temperatura ambiente. Seguono 2 lavaggi del filtro in TTBS da 15 minuti e uno da 10 minuti in TBS. L’espressione della proteina specifica è stata visualizzata utilizzando un saggio di chemioluminescenza (ECL, Amershan/Pharmacia Biotech) ed esponendo le lastre per un periodo di tempo variabile (1-20 min, la pellicola viene quindi sviluppata manualmente con Kodak Processing chemicals).

2.25 Analisi statistica.

I dati vengono espressi come media ± errore standard (SEM). Per analizzare le difefrenze tra i vari gruppi sperimentali è stato applicato il test di analisi della varianza (ANOVA) .

Per valutare la relazione esistente tra livelli di leptin/cell count e il livello di poliadenilazione ( valutato tramite la lunghezza dello smear), è stata applicata l’analisi di regressione lineare.