CAPITOLO 3
Capitolo 3
MATERIALI E METODI
3.1 AREA DI STUDIO
Per realizzare questo studio sono stati utilizzati tre allevamenti di cavalli con diversa tipologia gestionale ubicati nelle province di Siena e di Pisa.
3.2 ANIMALI
224 campioni fecali individuali raccolti ogni sei mesi da alcuni cavalli ospitati in tre allevamenti della Toscana con diversa tipologia di gestione sono stati analizzati per la ricerca di A. perfoliata e delle altre due specie di cestodi del cavallo.
3.2.1 Allevamento 1
Allevamento di cavalli Purosangue Inglese “Razza del Pian del lago” (Figura 3.1) sito nel comune di Siena, fa parte di un’azienda agricola che si estende per circa 130 ettari.
La popolazione dei cavalli è rappresentata da soggetti stanziali e da nuovi cavalli che vengono importati ogni anno dall’Irlanda a circa 8 mesi di età e permangono in allevamento fino all’anno successivo. I cavalli vengono allevati in recinti all’aperto suddivisi in gruppi per la loro età e per il peso corporeo, raramente si ricorre alla stabulazione in box soprattutto per i soggetti in accrescimento fino all’età di diciotto mesi.
Figura 3.1: Puledri Purosangue Inglese in gruppo nel paddock dell’ Allevamento 1 (foto di
R.Gliozzo)
L’azienda utilizza un piano di profilassi vaccinale e antiparassitario costante per quest’ultimo è previsto l’utilizzo a rotazione di diversi farmaci antiparassitari con la somministrazione della molecola di antielmintico ogni sessantacinque giorni circa. I cavalli vengono alimentati con mangimi in pellet, integratori e fieno di prati polifiti.
Da questo allevamento sono stati analizzati con l’esame coprologico un totale di 105 campioni (Tabella 3.1).
Tabella 3.1: campioni destinati all’esame coprologico allevamento 1
Totale novembre-dicembre 04 36 maggio-giugno 05 35 novembre-dicembre 05 18 maggio-giugno 06 16 Totale 105
Inoltre, contestualmente all’esame coprologico, 16 campioni fecali dello stesso allevamento sono stati sottoposti ad esame di nested-PCR, e il siero di 9 cavalli utilizzato per la ricerca di anticorpi specifici contro A. perfoliata. Per la valutazione dell’efficacia del farmaco, 5 campioni fecali di cavalli precedentemente risultati positivi per i cestodi Anoplocefalidi sono stati sottoposti al trattamento antiparassitario con Equimax® (VIRBAC) ivermectina (18,7 mg/g) e di praziquantel (140,3 mg/g); le loro feci raccolte dopo 15 giorni dalla somministrazione della molecola cestodicida e analizzate mediante nested-PCR.
3.2.2 Allevamento 2
Allevamento di cavalli Tiro Pesante Rapido (TPR) “Il Boschetto” (Figura 3.2) sito all’interno del parco di San Rossore (PI). L’azienda alleva i soggetti allo stato brado in regime di zootecnia biologica, sui cavalli pertanto non vengono effettuati trattamenti antiparassitari.
I cavalli dell’allevamento rappresentati da due stalloni e da varie fattrici di diversa età con i rispettivi puledri, rappresentano una popolazione stanziale e autoctona in quanto non vengono introdotti nuovi soggetti ogni anno.
L’alimentazione è rappresentata dal pascolo polifita con integrazione di fieno nel periodo invernale.
Da questo allevamento sono stati analizzati con l’esame coprologico un totale di 44 campioni (Tabella 3.2).
Tabella 3.2: campioni destinati all’esame coprologico allevamento 2
Totale novembre-dicembre 04 14 maggio-giugno 05 9 novembre-dicembre 05 12 maggio-giugno 06 9 Totale 44
Inoltre, contestualmente all’esame coprologico, 8 campioni fecali dello stesso allevamento sono stati sottoposti ad esame di nested-PCR, e il siero di 4 cavalli utilizzato per la ricerca di anticorpi specifici contro A. perfoliata. In questo allevamento non è stato possibile valutare l’efficacia del trattamento in quanto l’azienda alleva gli animali in regime di agricoltura biologica.
3.2.3 Allevamento 3
L’allevamento 3 (Figura 3.3) è sito presso le scuderie di San Rossore, alleva cavalli di razza Purosangue Inglese da destinare alle corse al galoppo. I cavalli hanno età superiore ai 18 mesi ed in allevamento vengono introdotti animali nuovi ogni anno, molti di questi importati anche dall’Inghilterra.
In questo allevamento si eseguono i trattamenti antiparassitari solo dopo analisi coprologica dei soggetti. I cavalli vengono alimentati con mangimi in pellet, integratori e fieno di prati polifiti.
Da questo allevamento sono stati analizzati con l’esame coprologico un totale di 75 campioni (Tabella 3.3).
Tabella 3.3: campioni destinati all’esame coprologico allevamento 3
Totale novembre-dicembre 04 23 maggio-giugno 05 22 novembre-dicembre 05 15 maggio-giugno 06 15 Totale 75
Inoltre, contestualmente all’esame coprologico, 18 campioni fecali dello stesso allevamento sono stati sottoposti ad esame di nested-PCR, e il siero di 12 cavalli utilizzato per la ricerca di anticorpi specifici contro A. perfoliata. Per la valutazione dell’efficacia del farmaco, 13 campioni fecali di cavalli precedentemente risultati positivi per Anoplocephala
spp. sono stati sottoposti al trattamento antiparassitario con Equimax® (VIRBAC)
ivermectina (18,7 mg/g) e di praziquantel (140,3 mg/g); le loro feci raccolte dopo 15 giorni dalla somministrazione della molecola cestodicida e analizzate mediante nested-PCR.
3.3 TECNICHE DI LABORATORIO
3.3.1 Analisi copromicroscopica per determinare la prevalenza dei cestodi
Anoplocefalidi nei tre allevamenti considerati
Per valutare la prevalenza dei cestodi nei tre allevamenti considerati, nel periodo compreso tra novembre 2004 e giugno 2006 campioni fecali individuali di cavalli, prelevati direttamente dall’ampolla rettale di ciascun animale ogni 6 mesi per un periodo di due anni, sono stati sottoposti ad esame coprologico per la ricerca sia di A. perfoliata, e delle altre due specie che interessano il cavallo, secondo la metodica illustrata da Proudman ed Edwards (1992).
In totale sono stati analizzati 224 campioni fecali. Quando possibile, cioè nel caso fosse sempre presente in allevamento, ciascun cavallo è stato campionato per due campionamenti successivi, uno corrispondente al periodo novembre-dicembre ed il secondo corrispondente al periodo maggio-giugno dell’anno successivo. Questo corrisponde al periodo di permanenza dei cavalli nell’Allevamento 1 e 3.
Per l’analisi copro-microscopica è stata scelta la tecnica di Proudman e Edwards (1992). Quaranta grammi di ciascun campione fecale sono stati miscelati con 10 ml di acqua in una capsula di porcellana fino ad ottenere una consistenza pastosa, e poi pressati in un colino.
saccarosio (350 ml di zucchero granulare e 450 ml di acqua di fonte calda) e centrifugato ulteriormente per 10 minuti a 1200g. Le provette sono state poi colmate con la soluzione a base di saccarosio fino alla formazione di un menisco convesso su cui è stato apposto un vetrino copri-oggetto (Figura 3.4).
Dopo due ore, il vetrino coprioggetto è stato rimosso, posto su vetrino porta-oggetto (Figura 3.5) ed esaminato al microscopio ottico a 10 e 25 X al fine di valutare la presenza di uova di Anoplocefalidi (Figura 1.2 e 1.5).
Figura 3.4: Provette in attesa di esame con il vetrino coprioggetto
Figura 3.5: Vetrino portaoggetti con i due vetrini coprioggetto per campione da analizzare al
3.3.2 Esame sierologico con test (ELISA)
Su alcuni cavalli (25), risultati sia positivi che negativi all’esame coprologico, presso il laboratorio “Diagnosteq Equine Division, Learhurst Neston Liverpool CH647TE ENGLAND” unico centro di referenza mondiale per questo tipo di analisi, è stato eseguito il test siero-diagnostico mediante ELISA secondo la metodica illustrata da Proudman e Tress (1996). Ciò è stato fatto sia per confermare i dati ottenuti con il test coprologico, che per operare un confronto tra i diversi metodi diagnostici attualmente disponibili.
A tal fine, il siero di 8 cavalli risultati positivi e di 9 cavalli risultati negativi all’esame coprologico per la ricerca di A. perfoliata secondo la metodica illustrata da Proudman ed Edwards (Proudman e Edwards, 1992), ed i sieri di ulteriori di 8 cavalli, risultati positivi ad un precedente esame coprologico ed in seguito trattati con Equimax ® (VIRBAC), prelevati dopo 3 mesi dal trattamento, sono stati sottoposti ad esame sierologico per ricerca di anticorpi contro A. perfoliata.
I sieri sono stati prelevati e successivamente conservati a –18°C fino al momento della spedizione, avvenuta mediante contenitore termico mantenuto sotto 0° C con ghiaccio secco.
I Venticinque campioni di siero sono stati analizzati nel laboratorio di Liverpool per la ricerca degli anticorpi contro A. perfoliata con il metodo riportato da Proudman (Proudman
et al., 1996a).
Le piastre da immunologia sono state incubate a 4°C per 16 h con l’antigene ad una concentrazione di 2 mg di proteina per pozzetto (0,1 ml) in una soluzione tampone di carbonato/bicarbonato (0,1 M, pH 9,6). Le piastre sono state lavate tre volte con la
con 0,1 ml di siero in esame per pozzetto, diluito a 1/800 nel 2% SMP/PBS e incubate per 1 ora a temperatura ambiente.
Le piastre sono state lavate tre volte, e 0,1 ml di IgG di siero di capra anti IgG di cavallo coniugati a perossidasi (1/1000 nel 2% LSP /PBS) sono stati poi aggiunti per ciascun pozzetto e il tutto incubato per 1 ora a temperatura ambiente.
Vengono successivamente eseguiti due lavaggi con il 2% LSP/PBS-Tween e un lavaggio finale con PBS-Tween prima dell’ incubazione con 100 ml di acido azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6 solfonici) a una concentrazione di 0,5 mg/ml in tampone citrato (pH 4.2) in ciascun pozzetto.
Le piastre vengono incubate per 20 minuti al buio a temperatura ambiente, prima della lettura della densità ottica (OD) a 405 nm su un lettore fotometrico di micropiastre.
L’interpretazione dei risultati, espressi in valore di densità ottica (OD) ELISA, si basa sulla loro correlazione con l’intensità di infestazione (Proudmanet al., 1998).
Il titolo anticorpale in OD risultato dall’esame sierologico può quindi indicare un’infestazione bassa (low), moderata (moderate), alta (high), (Proudman et al., 1998). Queste corrispondono a:
< 0.200: Low - Zero o bassa intensità di infestazione. Indica che l’infestazione non è
probabilmente un problema.
3.3.3 Tecnica diagnostica di biologia molecolare con nested-PCR
Al fine di individuare una tecnica più sensibile per la diagnosi di A. perfoliata, è stata applicata per la prima volta in questo studio, contestualmente all’esame copromicroscopico e al test ELISA, una tecnica di nested-PCR.
I campioni, destinati alla tecnica di nested PCR sono stati analizzati presso il Dipartmento di Scienze Biomediche Comparate della Facoltà di Medicina Veterinaria dell’ Università di Teramo, con la collaborazione del Dr Donato Traversa e colleghi.
La tecnica diagnostica molecolare di nested PCR è stata eseguita su 42 campioni fecali esaminati prima del trattamento e su 18 campioni fecali dopo la somministrazione del farmaco, in questo ultimo caso la raccolta delle feci è avvenuta dopo 15 giorni dal trattamento.
Un quantitativo di circa 30 gr di feci degli stessi campioni analizzati con la tecnica copromicroscopica sono stati congelati a -20°C per effettuare la metodica di nested-PCR. Dopo lo scongelamento lento a temperatura ambiente, circa 10 g di ciascuno dei 42 campioni fecali pre-trattamento e dei 18 campioni fecali post somministrazione del farmaco, sono stati concentrati mediante la tecnica di arricchimento di Proudman ed Edwards (Proudman e Edwards, 1992) e 200 µl della sospensione concentrata di ciascun campione sono stati sottoposti a tre cicli di congelamento/scongelamento (azoto liquido 5 min, 95°C 5 min) e centrifugati a 13000 rpm per 2 minuti. I pellet ottenuti sono stati sottoposti ad estrazione del DNA mediante QIAamp DNA Mini Stool Kit (Qiagen S.p.A., Milan, Italy). Il DNA estratto è stato sottoposto a nested PCR.
nested-PCR di Drogemuller e colleghi (Drogemuller et al, 2004).
Nel primo step sono state amplificate parte delle regioni 18S, della ITS-1, della 5.8S, della ITS-2 e parte della 28S impiegando i primers universali S-18 (forward-5’-TAACAGGTCTGTGATGCC-3’) e LT-3 (reverse-5’-CAACTTTCCCTCACGGTACTTG -3’) i quali sono stati usati per l’identificazione molecolare degli stadi di sviluppo dei
Digenei della famiglia degli Opecoelidae (Jousson et al., 1999) mentre nel secondo step è
stata amplificata la regione ITS-2 mediante i primer specifici di A. perfoliata AP-ITS-2-3F (forward-5’-AATTGTGGGGGCTTCTCTTA-3’) e AP-ITS-2-2R (reverse-5’-ACCTCGTGCCTTTCTTTAT-3’) come descritto da Drogemuller e colleghi (Drogemuller
et al, 2004).
Per entrambi gli step la reazione di PCR è stata eseguita su 25 µl di volume finale costituito da 12,5 µl ReadyMix RedTaq (Sigma, St. Louis, MO), 9 µl di acqua distillata, 0,5 µl del primer forward (50 picomoli), 0,5 µl del primer reverse (50 picomoli), 0.5 µg di albumina di siero bovino, 2,5 µl di DNA (estratto nel primo step/primo amplificato nel secondo step), e diluiti con acqua distillata per PCR (Sigma, St. Louis, MO).
I parametri utilizzati per il programma di amplificazione di entrambi gli step sono stati i seguenti: per lo step iniziale a 94°C per 7 min, seguito da 40 cicli di denaturazione a 94°C per 30s, annealing a 50°C per 30s, ed estensione a 72°C per 2min, con estensione finale a 72°C per 12min. In tutte le reazioni di PCR sono stai inclusi appropriati controlli positivi
(Traversa et al., 2004) da cavalli infettati con Ossiuridi, e/o Ciatostomini, e/o Habronema e Draschia e/o Gasterophilus (ma non con i cestodi).
I prodotti ottenuti sono stati visualizzati ai raggi UV previa corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% TBE, colorati con EtBr e fotografati con il sistema di documentazione BioRad GelDoc.
Tutti i prodotti di PCR ottenuti dal secondo step con il set primer AP-ITS-2-3F/AP-ITS-2-2R rilevati su gel di agarosio sono stati purificati su mini-colonne (Ultrafree-DA, Millipore, Bedford, MA) e sottoposti a sequenziamento automatico (MWG Biotech/M-Medical, Milan, Italy). Le sequenze sono state determinate in entrambi gli orientamenti (utilizzando gli stessi primer), allineandoli a vicenda e utilizzando il programma ClustalX (Thompson et al., 1997), verificando a vista per massimizzare la somiglianza globale. Inoltre, le sequenze sono state confrontate con quelle di A. perfoliata disponibili nel database GenBankTM con Nucleotide–Nucleotide BLASTsoftware (Altschul et al., 1997). È stata inoltre verificata, l'assenza di inibitori di PCR, da contaminanti di origine fecale nei campioni di DNA come descritto da Traversa et al. (2004).
3.4 FARMACO IMPIEGATO PER LA VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA DEL
TRATTAMENTO FARMACOLOGICO
Su Quarantuno dei quarantasei cavalli risultati positivi è stato possibile effettuare il trattamento farmacologico con una associazione di Ivermectina + Praziquantel Equimax® (VIRBAC) in un gel orale ( Tabella 3.4) che contiene per ogni grammo di prodotto le seguenti sostanze attive:
Tabella 3.4: Principi attivi Equimax® (VIRBAC)
IVERMECTINA european Ph 18,7 mg PRAZIQUANTEL european Ph 140,3mg
Il farmaco è attivo contro i nematodi, i cestodi e le larve di artropodi del cavallo con una somministrazione singola.
Il farmaco è stato somministrato in un’unica volta con il dosaggio appropriato al peso del cavallo da sottoporre a trattamento.
Figura 3.6: Schema del dosaggio del farmaco Equimax®(VIRBAC) in base al peso (Kg) del
soggetto da trattare (Virbac, 2002)
Al fine di valutare l’efficacia del trattamento con Equimax®(VIRBAC), 41 cavalli risultati positivi sono stati trattati ed i campioni fecali sono stati raccolti, quando possibile, entro un mese dalla somministrazione del farmaco per essere nuovamente analizzati mediante la metodica di Proudman ed Edwards (1992).
Per operare un confronto tra le tecniche diagnostiche utilizzate, dei quarantuno cavalli positivi all’esame coprologico, 18 di essi sono stati valutati anche con la tecnica di nested-PCR e 8 con l’esame sierologico.
3.5 ANALISI STATISTICA
I dati relativi alla prevalenza tra i diversi allevamenti, tra i campionamenti successivi di uno stesso anno e i campionamenti dello stesso periodo dei due anni consecutivi all’interno del singolo allevamento, sono stati elaborati mediante il test del χ 2 (Glantz, 2003a) usando software Mc Graw Hill (Glantz, 2003b).
