Studiò le sostanze che possono reagire con il materiale genico e causarne mutazioni
Dimostrò l’effetto mutageno del solfuro di dicloroetile = gas mostarda (C4H8Cl2S)
Ispiratrice e fondatrice del campo di ricerca sulla mutagenesi chimica e sulla
mutagenesi ambientale
Charlotte Auerbach (1899-1994)
Confrontò gli effetti mutageni delle radiazioni ionizzanti e delle sostanze chimiche.
Dai suoi primissimi esperimenti fu evidente che le
mutazioni prodotte chimicamente erano principalmente mosaici mentre quelle indotte tramite radiazioni
ionizzanti erano cambiamenti whole-body.
Inoltre, il rapporto tra mutazioni puntiformi e mutazioni cromosomiche era differente, essendo molto più alto dopo il trattamento chimico che dopo radiazioni ionizzanti.
Tipo di danno
Lesioni al DNA
Estensione del danno e gravità
Risposta cellulare
Quantità e tipo di
danno tollerabile Danno eccessivo e/o irriparabile
Attivazione del
network della risposta Attivazione della
pathway apoptotica Intrinseco
Modificazioni spontanee di basi, errori di replicazione
Agenti chimici Endogeni Esogeni (radicali (mutageni liberi) chimici)
Radiazioni
Ultravioletti Ionizzanti
Appaiamenti errati, inserzioni, delezioni, rotture del DNA
Modificazioni di basi, siti abasici, rotture del DNA
Addotti di DNA, crosslink, rotture del DNA
Dimeri di pirimidina, modificazioni di basi
Siti abasici, modificazioni di basi, rotture del DNA
Tipi di danno al DNA
Spontanei:
Errori durante la
replicazione del DNA, errori nell’appaiamento del DNA omologo durante la ricombinazione, agenti endogeni prodotti dal metabolismo cellulare come i radicali liberi.
Indotti:
• Agenti fisici: raggi X, gamma, UV)
• Agenti chimici
(alchilanti;inibitori sintesi
dessoribonucleotidi;
intercalanti)
mutazione
mutazione gameti
embrione
organismo
Gameti
L’intero organismo porta la
mutazione (in eterozigosi)
Area mutata
I diversi tipi di mutazioni
Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche
F Mutazioni nel numero dei cromosomi
F Mutazioni nella struttura
Mutazioni geniche
Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un ’ altra
Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA
*Se la mutazione avviene RNA, le conseguenze sono alcune
• Sostituzione
• Delezione
• Inserzione
*
Tipi di mutazioni geniche
F F
purine: (A) adenina, (G) guanina
pirimidine: (C) citosina, (T) timina, (U) uracile
Tipi di mutazioni geniche
Tipi di mutazioni geniche
Sostituzione di una base nucleotidica con un ’ altra
La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene).
In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi:
• mutazioni silenti
• mutazioni missenso
• mutazioni non senso
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Mutazioni silenti . Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa
Fino a quattro diverse triplette specificano lo
stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato)
Le sostituzioni silenti riguardano la terza base del
codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano
lo stesso aminoacido
Mutazioni missenso . Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido
La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido
CCU GCU
Prolina Alanina
La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l’aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della
sostituzione
Mutazioni nonsenso .
Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione)UAG AAG
Lisina Codone di stop
Delezione o inserzione di una base
(mutazioni per spostamento della griglia di lettura-frameshift)
Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base
In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata
A U G A G G A C U C C C G G A U U A
A U G A G G A A C U C C C G G A U U A
A (inserzione)
Met Arg Thr Pro Gly Leu
Reversione e soppressione
• Reversione vera
• Reversione di codone
• Reversione per soppressione
– soppressione interna (intragenica) – soppressione esterna (intergenica)
AAC CCC AGT GAT GTC AAA
Asn Pro Ser Asp Val Phe
Sequenza selvatica
AAC CCC ACT GAT GTC AAA
Asn Pro Thr Asp Val Phe
Sequenza mutata
AAC CCC AGT GAT GTC AAA
Asn Pro Ser Asp Val Phe
Reversione vera
AAC CCC TCT GAT GTC AAA
Asn Pro Ser Asp Val Phe
Reversione di codone
Reversione per soppressione interna (intragenica)
Enzima
attivo
Ser - Leu - Phe - Iso - Gly - Leu
Enzima inattivo Enzima attivo
Ser - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu
Thr - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu
Mutazioni spontanee
Notevole variabilità
• dimensione del gene
• suscettibilità (hot spots)
• da specie a specie
La frequenza di reversione è significativamente più bassa della frequenza di mutazione in avanti
Il tasso di mutazione si può calcolare dagli effetti fenotipici delle mutazioni (usando linee di laboratorio omozigoti)
Oppure si può calcolare confrontando direttamente sequenze di DNA
basato sugli effetti fenotipici nei metazoi:
10-6 - 10-5 mutaz./gamete/generazione/locus
basato su confronti di sequenze di DNA:
10-9 mutaz./pos. nucleotidica/anno
Alcuni esempi: con 10
-5mutazioni per locus per generazione (una mutazione ogni 100.000
gameti)
se in Drosophila ci fossero 10.000 geni funzionali, avremo una mutazione ogni 10 genomi aploidi.
Una popolazione di 500.000 individui (1.000.000 di genomi aploidi) porta almeno 100.000 nuove mutazioni ad ogni generazione.
se nell’uomo ci fossero 100.000 geni funzionali, avremo una mutazione ogni genoma aploide.
Una popolazione di 500.000 individui (1.000.000 di genomi aploidi) porta almeno 1.000.000 nuove mutazioni ad ogni generazione.
Teoria adattativa
Teoria genetica
Test di fluttuazione di Luria e Delbruck
Le mutazioni nei batteri avvengono come errori spontanei, indipendenti dall’agente selettivo
II I III
La tecnica del piastramento in replica conferma che l’insorgenza delle mutazioni è un evento spontaneo e casuale che può avvenire in qualsiasi momento e colpire il genoma in qualsiasi punto
(la resistenza batterica è infatti il risultato di mutazioni preesistenti)
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
1. Tautomeria
3. Danno ossidativo 2. Radiazioni naturali
4. Errori di crossing over 5. Elementi trasponibili 6. Errori nella replicazione
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
1. Tautomeria: modificazioni spontanee ed occasionali delle basi del DNA (depurinazione, deaminazione)
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
F le radiazioni UV causano la formazione di dimeri di timina 2. Radiazioni naturali:
F raggi X rompono lo scheletro del DNA
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
3. Danno ossidativo
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
4. Errori del crossing over durante la meiosi
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
5. Destabilizzazione indotta dagli elementi trasponibili a DNA
Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?
5’-AGCTAATCGTA-3’
3’-TCGATTAGCATAAAAACGAGGC-5’
5’-AGCTAATCGTA-3’
3’-TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5’
A Protrusione dell’elica stampo
5’-AGCTAATCGTATTT TGCTCCG-3’ 3’-TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5’
Delezione di una base nell’elica nuova
A
6. Errori nella replicazione
6. Errori nella replicazione
6a. Scivolamento su sequenze ripetute
6. Errori nella replicazione
6b Incorporazione errata di una base
Le mutazioni, utili per la comprensione
della struttura genica
mappa genetica (o di associazione)
Le mutazioni per la comprensione della funzione genica
Esperimento di Beadle and Tatum
Relazione tra genotipo e fenotipo
Tipi di mutazioni
1. Nulle (o equivalenti) 2. Neomorfe
3. Ipomorfe 4. Ipermorfe 5. Amorfe 6. Antimorfe
Espressione ectopica
Le mutazioni possono essere recessive o dominanti
1. allele nullo (o equivalente)
• variazione che non modificano né la quantità, né la qualità biochimica e funzionale del prodotto genico
• il prodotto genico risulta invariato e normalmente localizzato
• esempi sono le circa 12,000 differenze della
sequenza del DNA codificante che si osservano
nella popolazione umana che non hanno alcuna
conseguenza patologica nota
2. allele neomorfo
• neomorfo (neo=nuovo) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico nuovo o una funzione nuova
• si distingue solo didatticamente dall’allele ipermorfo, in quanto
• ➛
in alcune forme di cancro l’allele neomorfo è una chimera di due geni, dovuta ad una traslocazione cromosomica, come ilcromosoma di fusione Philadelphia, con la comparsa della nuova proteina bcr-abl (caso di leucemia mieloide cronica)
2. allele ipomorfo
• variazione della sequenza del DNA che riduce la quantità di prodotto genico e/o la sua qualità funzionale
• tali alleli sono silenti e recessivi e possono agire più come modificatori del fenotipo che come causa diretta di
patologia
• alleli ipomorfi possono però essere causa di malattia se in emizigosi
• esempio: gli alleli ipomorfi del gene della distrofina,
localizzato sul cromosoma X, che determinano quadri di distrofia muscolare di Becker nei maschi (emizigoti).
3. allele ipermorfo
• ipermorfo (iper= aumentato) è l’allele che determina l’aumentata quantità o funzione di un prodotto genico
• è associato di regola ad un tratto genetico dominante, in quanto l’aumentata espressione/funzione non può essere limitata
dall’allele non mutato
• un esempio è l’aumentata funzione del recettore per l’FGF3
(Fibroblast Growth Factor Receptor 3) che causa l’acondroplasia (nanismo dismorfico) che è appunto a trasmissione autosomica dominante
(In achondroplasia, the mutated form of the receptor is constitutively active and this leads to severely shortened bones).
5. allele amorfo
• variazione di sequenza del DNA drastica: corrisponde
classicamente alla delezione (cancellazione) della sequenza codificante del gene;
• un allele amorfo può essere prodotto da altri tipi di mutazione (per es.: possono avere la medesima conseguenza di una
delezione totale del gene)
• in emizigosi, se colpisce una funzione genica essenziale (es emofilia, distrofia muscolare di Duchenne, etc) può essere causa di una malattia genetica
• l’allele amorfo in eterozigosi, in genere, è presente in un portatore sano di una malattia autosomica recessiva
• può essere, da solo, causa di malattia se riguarda un gene in cui il 50% del dosaggio (prodotto dall’ allele non mutato) è
6. allele antimorfo (o dominante negativo)
• antimorfo (anti=contro) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico antagonistico
• è il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui
prodotto proteico funziona in cooperazione con altre proteine
• particolari mutazioni rendono la proteina di “disturbo” a tutte le altre pur essendo queste ultime perfettamente normali
• un esempio è dato dal collagene in cui più geni (NB: due alleli per ogni gene) contribuiscono alla formazione delle proteine ciascuno producendo una parte delle catene di base:
➛ una mutazione in un solo allele produce un effetto negativo complessivo
Espressione ectopica
L'ectopia (dal greco ἔκτοπος (éktopos) che è fuori di posto) è la disposizione di un gene nel punto sbagliato.
Per espressione ectopica di un gene si intende l'espressione di un gene con una localizzazione differente da quella normale.
L'espressione ectopica può portare in alcuni casi alla formazione di organi ectopici (per esempio nel moscerino Drosophila
melanogaster.
Per ottenere l'espressione ectopica di un gene si può farlo precedere da un elemento enhancer nel promotore.
In questo caso si ottiene generalmente una sovraespressione ectopica, ovvero un'espressione del gene elevata in tutto
l'organismo, quindi anche in tessuti e organi dove non si trova in
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Relazione tra genotipo e fenotipo: utilizzo delle mutazioni per identificare nuove funzioni proteiche
selvatico Presenza di
photorecettori extra (EGFR costitut. attivo)
Soppressione del fenotipo (mutazione in un gene dowstream)
selvatico Retina degenerata (dom. poliglutammina espanso)
Soppressione del fenotipo
Suppression second-site modifier screen
EGFR: epidermal growth factor receptor