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Ispiratrice e fondatrice del campo di ricerca sulla mutagenesi chimica e sulla mutagenesi ambientale. Charlotte Auerbach ( )

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Academic year: 2022

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(1)

Studiò le sostanze che possono reagire con il materiale genico e causarne mutazioni

Dimostrò l’effetto mutageno del solfuro di dicloroetile = gas mostarda (C4H8Cl2S)

Ispiratrice e fondatrice del campo di ricerca sulla mutagenesi chimica e sulla

mutagenesi ambientale

Charlotte Auerbach (1899-1994)

Confrontò gli effetti mutageni delle radiazioni ionizzanti e delle sostanze chimiche.

Dai suoi primissimi esperimenti fu evidente che le

mutazioni prodotte chimicamente erano principalmente mosaici mentre quelle indotte tramite radiazioni

ionizzanti erano cambiamenti whole-body.

Inoltre, il rapporto tra mutazioni puntiformi e mutazioni cromosomiche era differente, essendo molto più alto dopo il trattamento chimico che dopo radiazioni ionizzanti.

(2)

Tipo di danno

Lesioni al DNA

Estensione del danno e gravità

Risposta cellulare

Quantità e tipo di

danno tollerabile Danno eccessivo e/o irriparabile

Attivazione del

network della risposta Attivazione della

pathway apoptotica Intrinseco

Modificazioni spontanee di basi, errori di replicazione

Agenti chimici Endogeni Esogeni (radicali (mutageni liberi) chimici)

Radiazioni

Ultravioletti Ionizzanti

Appaiamenti errati, inserzioni, delezioni, rotture del DNA

Modificazioni di basi, siti abasici, rotture del DNA

Addotti di DNA, crosslink, rotture del DNA

Dimeri di pirimidina, modificazioni di basi

Siti abasici, modificazioni di basi, rotture del DNA

(3)

Tipi di danno al DNA

Spontanei:

Errori durante la

replicazione del DNA, errori nell’appaiamento del DNA omologo durante la ricombinazione, agenti endogeni prodotti dal metabolismo cellulare come i radicali liberi.

Indotti:

• Agenti fisici: raggi X, gamma, UV)

• Agenti chimici

(alchilanti;

inibitori sintesi

dessoribonucleotidi;

intercalanti)

(4)

mutazione

mutazione gameti

embrione

organismo

Gameti

Lintero organismo porta la

mutazione (in eterozigosi)

Area mutata

(5)

I diversi tipi di mutazioni

Mutazioni geniche (o puntiformi) Mutazioni cromosomiche

F Mutazioni nel numero dei cromosomi

F Mutazioni nella struttura

(6)

Mutazioni geniche

Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un ’ altra

Altri tipi di mutazione si originano in seguito alla perdita (delezione) o alla inserzione di una base nel filamento del DNA

*Se la mutazione avviene RNA, le conseguenze sono alcune

•   Sostituzione

•   Delezione

•   Inserzione

*

(7)

Tipi di mutazioni geniche

F F

purine: (A) adenina, (G) guanina

pirimidine: (C) citosina, (T) timina, (U) uracile

(8)

Tipi di mutazioni geniche

(9)

Tipi di mutazioni geniche

(10)

Sostituzione di una base nucleotidica con unaltra

La sostituzione di una base può avere conseguenze più o meno grandi sul prodotto finale (la proteina specificata da quel gene).

In base alle conseguenze se ne distinguono tre tipi:

•   mutazioni silenti

•   mutazioni missenso

•   mutazioni non senso

(11)

11

Mutazioni silenti . Se in seguito alla sostituzione di una base si ottiene una tripletta che specifica per lo stesso aminoacido la proteina prodotta sarà la stessa

Fino a quattro diverse triplette specificano lo

stesso aminoacido (il codice genetico è degenerato)

Le sostituzioni silenti riguardano la terza base del

codone, quella che varia tra codoni diversi che specificano

lo stesso aminoacido

(12)

Mutazioni missenso . Nella maggior parte dei casi la nuova tripletta codifica per un diverso aminoacido

La proteina avrà quindi lo stesso numero di aminoacidi ma una sequenza che differisce per un aminoacido

CCU GCU

Prolina Alanina

La gravità degli effetti di una sostituzione dipenderà dalla somiglianza tra l’aminoacido sostituito e il nuovo e dalla posizione della

sostituzione

(13)

Mutazioni nonsenso .

Se il nuovo codone che si forma dalla sostituzione codifica per il segnale di stop avremo una proteina più corta della precedente (dipende dal punto in cui è avvenuta la sostituzione)

UAG AAG

Lisina Codone di stop

(14)

Delezione o inserzione di una base

(mutazioni per spostamento della griglia di lettura-frameshift)

Talvolta l’errore consiste nell’inserire una base in più nella sequenza del DNA. Altre volte durante la replicazione o durante la riparazione del DNA si ha la perdita di una base

In entrambi i casi la lettura di tutta la sequenza che segue viene completamente alterata

A U G A G G A C U C C C G G A U U A

A U G A G G A A C U C C C G G A U U A

A (inserzione)

Met Arg Thr Pro Gly Leu

(15)

Reversione e soppressione

• Reversione vera

• Reversione di codone

• Reversione per soppressione

– soppressione interna (intragenica) –  soppressione esterna (intergenica)

AAC CCC AGT GAT GTC AAA

Asn Pro Ser Asp Val Phe

Sequenza selvatica

AAC CCC ACT GAT GTC AAA

Asn Pro Thr Asp Val Phe

Sequenza mutata

AAC CCC AGT GAT GTC AAA

Asn Pro Ser Asp Val Phe

Reversione vera

AAC CCC TCT GAT GTC AAA

Asn Pro Ser Asp Val Phe

Reversione di codone

(16)

Reversione per soppressione interna (intragenica)

Enzima

attivo

Ser - Leu - Phe - Iso - Gly - Leu

Enzima inattivo Enzima attivo

Ser - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu

Thr - Leu - Phe - Iso - Arg - Leu

(17)

Mutazioni spontanee

Notevole variabilità

•  dimensione del gene

•  suscettibilità (hot spots)

da specie a specie

La frequenza di reversione è significativamente più bassa della frequenza di mutazione in avanti

Il tasso di mutazione si può calcolare dagli effetti fenotipici delle mutazioni (usando linee di laboratorio omozigoti)

Oppure si può calcolare confrontando direttamente sequenze di DNA

basato sugli effetti fenotipici nei metazoi:

10-6 - 10-5 mutaz./gamete/generazione/locus

basato su confronti di sequenze di DNA:

10-9 mutaz./pos. nucleotidica/anno

(18)

Alcuni esempi: con 10

-5

mutazioni per locus per generazione (una mutazione ogni 100.000

gameti)

se in Drosophila ci fossero 10.000 geni funzionali, avremo una mutazione ogni 10 genomi aploidi.

Una popolazione di 500.000 individui (1.000.000 di genomi aploidi) porta almeno 100.000 nuove mutazioni ad ogni generazione.

se nell’uomo ci fossero 100.000 geni funzionali, avremo una mutazione ogni genoma aploide.

Una popolazione di 500.000 individui (1.000.000 di genomi aploidi) porta almeno 1.000.000 nuove mutazioni ad ogni generazione.

(19)

Teoria adattativa

Teoria genetica

Test di fluttuazione di Luria e Delbruck

Le mutazioni nei batteri avvengono come errori spontanei, indipendenti dallagente selettivo

II I III

(20)

La tecnica del piastramento in replica conferma che l’insorgenza delle mutazioni è un evento spontaneo e casuale che può avvenire in qualsiasi momento e colpire il genoma in qualsiasi punto

(la resistenza batterica è infatti il risultato di mutazioni preesistenti)

(21)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

1. Tautomeria

3. Danno ossidativo 2. Radiazioni naturali

4. Errori di crossing over 5. Elementi trasponibili  6. Errori nella replicazione

(22)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

1. Tautomeria: modificazioni spontanee ed occasionali delle basi del DNA (depurinazione, deaminazione) 

(23)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

F le radiazioni UV causano la formazione di dimeri di timina 2. Radiazioni naturali:

F raggi X rompono lo scheletro del DNA

(24)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

3. Danno ossidativo

(25)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

4. Errori del crossing over durante la meiosi

(26)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

5. Destabilizzazione indotta dagli elementi trasponibili a DNA 

(27)

Da che cosa sono causate le mutazioni spontanee?

5-AGCTAATCGTA-3

3-TCGATTAGCATAAAAACGAGGC-5

5-AGCTAATCGTA-3

3-TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5

A Protrusione dellelica stampo

5-AGCTAATCGTATTT TGCTCCG-3 3-TCGATTAGCATAAA ACGAGGC-5

Delezione di una base nellelica nuova

A

6. Errori nella replicazione

(28)

6. Errori nella replicazione

6a. Scivolamento su sequenze ripetute

(29)

6. Errori nella replicazione

6b Incorporazione errata di una base

(30)

Le mutazioni, utili per la comprensione

della struttura genica

(31)
(32)

mappa genetica (o di associazione)

(33)

Le mutazioni per la comprensione della funzione genica

Esperimento di Beadle and Tatum

(34)

Relazione tra genotipo e fenotipo

(35)

Tipi di mutazioni

1. Nulle (o equivalenti) 2. Neomorfe

3. Ipomorfe 4. Ipermorfe 5. Amorfe 6. Antimorfe

Espressione ectopica

Le mutazioni possono essere recessive o dominanti

(36)

1. allele nullo (o equivalente)

•  variazione che non modificano né la quantità, né la qualità biochimica e funzionale del prodotto genico

•  il prodotto genico risulta invariato e normalmente localizzato

•  esempi sono le circa 12,000 differenze della

sequenza del DNA codificante che si osservano

nella popolazione umana che non hanno alcuna

conseguenza patologica nota

(37)

2. allele neomorfo

•  neomorfo (neo=nuovo) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico nuovo o una funzione nuova

•  si distingue solo didatticamente dall’allele ipermorfo, in quanto

•  ➛

in alcune forme di cancro l’allele neomorfo è una chimera di due geni, dovuta ad una traslocazione cromosomica, come il

cromosoma di fusione Philadelphia, con la comparsa della nuova proteina bcr-abl (caso di leucemia mieloide cronica)

(38)

2. allele ipomorfo

•  variazione della sequenza del DNA che riduce la quantità di prodotto genico e/o la sua qualità funzionale

•  tali alleli sono silenti e recessivi e possono agire più come modificatori del fenotipo che come causa diretta di

patologia

•  alleli ipomorfi possono però essere causa di malattia se in emizigosi

•  esempio: gli alleli ipomorfi del gene della distrofina,

localizzato sul cromosoma X, che determinano quadri di distrofia muscolare di Becker nei maschi (emizigoti).

(39)

3. allele ipermorfo

•  ipermorfo (iper= aumentato) è l’allele che determina l’aumentata quantità o funzione di un prodotto genico

•  è associato di regola ad un tratto genetico dominante, in quanto l’aumentata espressione/funzione non può essere limitata

dall’allele non mutato

•  un esempio è l’aumentata funzione del recettore per l’FGF3

(Fibroblast Growth Factor Receptor 3) che causa l’acondroplasia (nanismo dismorfico) che è appunto a trasmissione autosomica dominante

(In achondroplasia, the mutated form of the receptor is constitutively active and this leads to severely shortened bones).

(40)

5. allele amorfo

•  variazione di sequenza del DNA drastica: corrisponde

classicamente alla delezione (cancellazione) della sequenza codificante del gene;

•  un allele amorfo può essere prodotto da altri tipi di mutazione (per es.: possono avere la medesima conseguenza di una

delezione totale del gene)

•  in emizigosi, se colpisce una funzione genica essenziale (es emofilia, distrofia muscolare di Duchenne, etc) può essere causa di una malattia genetica

•  l’allele amorfo in eterozigosi, in genere, è presente in un portatore sano di una malattia autosomica recessiva

•  può essere, da solo, causa di malattia se riguarda un gene in cui il 50% del dosaggio (prodotto dall’ allele non mutato) è

(41)

6. allele antimorfo (o dominante negativo)

•  antimorfo (anti=contro) definito come causato da una mutazione che porta ad un prodotto genico antagonistico

•  è il risultato di una mutazione che colpisce un gene il cui

prodotto proteico funziona in cooperazione con altre proteine

•  particolari mutazioni rendono la proteina di “disturbo” a tutte le altre pur essendo queste ultime perfettamente normali

•  un esempio è dato dal collagene in cui più geni (NB: due alleli per ogni gene) contribuiscono alla formazione delle proteine ciascuno producendo una parte delle catene di base:

➛  una mutazione in un solo allele produce un effetto negativo complessivo

(42)

Espressione ectopica

L'ectopia (dal greco ἔκτοπος (éktopos) che è fuori di posto) è la disposizione di un gene nel punto sbagliato.

  Per espressione ectopica di un gene si intende l'espressione di un gene con una localizzazione differente da quella normale.

L'espressione ectopica può portare in alcuni casi alla formazione di organi ectopici (per esempio nel moscerino Drosophila

melanogaster.

Per ottenere l'espressione ectopica di un gene si può farlo precedere da un elemento enhancer nel promotore.

In questo caso si ottiene generalmente una sovraespressione ectopica, ovvero un'espressione del gene elevata in tutto

l'organismo, quindi anche in tessuti e organi dove non si trova in

(43)

43

Relazione tra genotipo e fenotipo: utilizzo delle mutazioni per identificare nuove funzioni proteiche

selvatico Presenza di

photorecettori extra (EGFR costitut. attivo)

Soppressione del fenotipo (mutazione in un gene dowstream)

selvatico Retina degenerata (dom. poliglutammina espanso)

Soppressione del fenotipo

Suppression second-site modifier screen

EGFR: epidermal growth factor receptor

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