• Non ci sono risultati.

giorni dopo l'infezione

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Condividi "giorni dopo l'infezione"

Copied!
19
0
0

Testo completo

(1)

4. Risultati

4.1 Infezione di iDC con FIV.

Per verificare la sensibilità delle iDC feline al FIV abbiamo scelto due ceppi virali diversi: 1) FIV-Pet, appartenente al clade A, in colture da oltre 200 passaggi sulla linea cellulare FL-4 cronicamente infetta (Yamamoto et al, 1991) e adattato a crescere nel nostro laboratorio, sulla linea cellulare MBM sulla quale viene anche titolato. 2) FIV-M2 un ceppo primario isolato e cresciuto sulla linea MBM ( Matteucci et al., 1995) appartenente al clade B. Abbiamo scelto due ceppi che avessero lo stesso titolo virale espresso in DI50 misurato sul linea MBM.

Abbiamo rilevato tramite il test ELISA la p25 nel supernatante a diverse diluizioni (figura 8).i due ceppi avevano lo stesso titolo di 3,1x 105 DI50. Con i due ceppi virali descritti abbiamo infettato le iDC prodotte da sangue periferico, dal quale sono stati isolati PBMC tramite centrifugazione su gradiente, seminati in piastre da 24 pozzetti con GMC-SF e IL4 secondo il protocollo di Freer et al.,2005. Da pozzetti con 3x106 PBMC venivano prodotte approssimativamente 1-2 x105 DC. Le iDC sono state infettate con diverse dosi di supernatante infetto FIV-Pet (tipo A ) o FIV-M2 (tipo B) per 2h a 37° C, secondo il protocollo utilizzato nel nostro laboratorio per infettare i PBMC e la linea cellulare MBM.

Abbiamo ricercato la presenza di p25 intracellulare con il FACS e la presenza di p25 nel supernatante con il test ELISA a partire da 48h, 96h, 120h dall’infezione, ma i risultati ottenuti erano inconsistenti. È noto che se le colture appena messe in contatto con il virus vengono centrifugate a 1600xg per 45’ a 35°C (spinoculazione) e poi incubate a 37°C, risultano più suscettibili al virus e inoltre i tempi della crescita virale si accorciano. Questo è stato dimostrato anche per HIV

(2)

(O’Doherty et al., 2000), perciò abbiamo deciso di applicare questa tecnica anche nei nostri esperimenti. Abbiamo infettato, le dendritiche prodotte, con FIV-Pet o FIV-M2 in tre dosi differenti, 2375, 4750 e 9500 DI50. Abbiamo usato come controllo, una linea di cellule T feline MBM (2x105 cellule /pozzetto) infettate con 4750 e 9500 DI50, usando il protocollo standard oppure la spinoculazione, seguita da 2 ore di incubazione a 37°C. Tutte le cellule sono state lavate due volte ed è stata conservata un’aliquota di supernatante dell’ultimo lavaggio per poter valutare il contenuto di virus residuo. Dopo due, tre, quattro giorni dall’infezione venivano raccolte aliquote di supernatante per valutare la crescita virale. Come si può notare dalla figura 9, le DC spinoculate (simboli vuoti) hanno prodotto abbondanti quantità di virus mentre le DC infettate a gravità ambiente (simboli pieni) portavano ad una bassa infettività. La spinoculazione mostra che il virus presenta il suo massimo picco dopo due giorni dall’infezione e poi rimane più o meno stabile nel tempo. Dalla figura si nota anche che FIV-Pet replica in modo più efficiente sulle iDC (fig. 9a ) di quanto non faccia FIV-M2 (fig. 9b) e i valori di p25 ritrovati nel supernatante sono paragonabili a quelli misurati nelle MBM (fig. 9c). In tutti i casi la resa virale è direttamente proporzionale alla dose usata per l’infezione. L’esperimento ripetuto con iDC ottenute a partire da gatti diversi a dato risultati sovrapponibili (dati non mostrati).

(3)

Figura 8. Dosaggio di p25 nel supernatante di FIV-Pet e FIV-M2.

DO450 densità ottica a 450nm.

(4)

Figura 9. Infezione di iDC con FIV. iDC prodotte da 3x106 PBMC, spinoculate (simboli vuoti) o incubate a gravità ambiente (simboli pieni), con 9505 (♦), 4750 (■)o 2375 (●) DI50 di FIV-Pet (a) o FIV-M2 (b). (c)MBM spinoculate (simboli pieni ) oppure no (simboli vuoti) con le due dosi più alte di FIV-Pet. Ai tempi indicati dall’infezione i supernatanti delle cellule sono stati analizzati per il contenuto di p25 con il test ELISA. DO450 densità ottica a 450nm. Il supernatante delle cellule normali aveva un DO450<0,005 a tutti i tempi in cui è stato testato. Si considerano positivi valori di DO450 superiori a 0.050.

4.2 Cinetica di produzione di FIV-Pet da parte di iDC.

(5)

Dato che il ceppo primario FIV-M2 si replicava con scarsa efficienza sulle iDC , abbiamo proseguito la sperimentazione con il ceppo FIV-Pet.

Non avendo osservato in figura 9 crescita virale nel tempo, abbiamo voluto cercare il tempo in cui cominciava la produzione virale dopo la spinoculazione.

Per questo abbiamo anticipato i tempi di analisi a 8 ore, 24 ore,e 48 ore, infettando iDC, PBMC e PBMC attivati con ConA con 4750 DI 50 di FIV-Pet. La figura 10(a) mostra che iDC infette presentavano l’antigene capsidico nel supernatante già dopo 8 ore dall’infezione e che la sua quantità continuava ad aumentare a 24 ore e si manteneva costante da 24 ore a 48 ore. I PBMC e PBMC attivati con ConA mostravano maggiori quantità di p25 nel supernatante che continuava ad aumentare anche dopo 48h (figura 10b). In figura 10 si può osservare che agli stessi tempi nelle colture non sottoposte a spinoculazione non si rileva crescita virale.

(6)

Figura 10. Cinetica di comparsa di FIV-PET su iDC. a) iDC generate da 3 x 106 PBMC (▲) o da 6 x 106 PBMC (■) oppure b) 3 x 106 PBMC a riposo (♦) o stimolati con ConA (●), sono state spinoculate(simboli pieni) o incubate a gravità ambientale (simboli vuoti) con 4750 DI50 di FIV-Pet. Ai tempi indicati dall’infezione le colture sono state analizzate per il contenuto di p25 con il test ELISA. DO450: densità ottica a 450nm. Il supernatante delle cellule normali aveva DO450 <0,038 a tutti i tempi. I dati in a) e in b) sono riportati con scale differenti. Si considerano positivi valori di DO450 superiori a 0,050.

(7)

4.3 Espressione di FIV da parte di iDC infette ed effetto citopatico.

Per confermare i dati precedenti, mediante un analisi con il FACS abbiamo rilevato la presenza intracellulare di p25. Sono state utilizzate iDC prodotte da due gatti diversi, e MBM usate come controllo positivo, infettate con 4750 DI50 di FIV-Pet con spinoculazione e dopo due giorni: fissate, impermeabilizzate e trattate con anticorpo fluoresceinato specifico per la p25. L’analisi è stata fatta prendendo in considerazione di 5x104 iDC o MBM in un gate FSC x SSC. I risultati sono mostrati, nella figura 11a. Nel primo pannello sono rappresentanti i grafici delle iDC e delle MBM non infette, nel secondo pannello quelli delle iDC e MBM infette. I numeri in alto a destra mostrano la percentuale di cellule positive. La proporzione di iDC infette variava dal 6% all’8%. Le cellule usate come controllo erano positive per il 14%. Inoltre abbiamo osservato che iDC infettate con una dose più bassa di FIV-Pet (1500 DI 50), dopo 6 giorni dall’infezione, mostravano grandi sincizi (figura 12). I preparati fissati e colorati con il metodo descritto da Tozzini (vedi materiali e metodi) sono stati fotografati con un ingrandimento 400x. In figura 12 a) e b) sono mostrati sincizi osservati su iDC infette mentre in c) è mostrato un preparato di iDC non infette. Tutti questi risultati hanno confermato che le iDC feline possono essere infettate da FIV.

(8)

Figura 11. Espressione della p25 di FIV in iDC e MBM. Sono stati analizzati con il FACS, 5 x 104 eventi in FSC x SSC (pannelli sulla destra) e i risultati sono stati riportati come grafici di densità di intensità SSC x FL-1. I numeri all’interno dei riquadri mostrano la percentuale di cellule positive.

(9)

Figura 12. Effetto citopatico su iDC infette con FIV-Pet. a) e b) sincizi osservati dopo 6 giorni dall’infezione. c) iDC normali. Le cellule sono state colorate con 0,3% di cristal violetto in 20% di metanolo e fotografate a 400x.

(Tozzini et al.,1992).

(10)

4.4 Infezione di mDC.

Ci siamo anche chiesti se la maturazione potesse alterare la suscettibilità delle DC all’infezione con FIV. In un lavoro, precedente è stato dimostrato che le iDC possono maturare in presenza di LPS, come è stato descritto per DC di altre specie, mentre altri stimoli sono risultati meno efficienti (Freer et al., 2005). Sono state generate iDC feline e dopo 5 giorni trattate o no, con 10ng/ml di LPS, dopo altri due giorni sono state infettate con 4750 DI 50 di FIV-Pet e due giorni dopo l’infezione le cellule sono state raccolte e lavate. Secondo il protocollo descritto in precedenza a 18, 24, 48 ore è stata misurata la quantità di p25 nel supernatante di coltura. Come si può vedere in figura 13, la maturazione non altera la suscettibilità al virus, infatti le mDC permettono al virus di replicarsi e il rilascio di virus nel supernatante è paragonabile a quello delle iDC. In questo studio è stata anche titolata l’infettività del virus prodotto su cellule MBM. La tabella 1 mostra che l’infettività di FIV nei supernatanti di DC prelevate a 0, 18, 24, 48 ore dall’ infezione, sia per le iDC che per le mDC l’infettività diventa misurabile a partire da 24 ore e risulta uguale o di poco superiore a 48 ore. Sebbene la determinazione della p25 con il test ELISA (figura13) e la determinazione dell’

infettività (tabella1) abbiano una sensibilità diversa, i risultati portano alla stessa conclusione. Come è mostrato in figura 13 le mDC producono una quantità di FIV addirittura più alta delle iDC (p<0.01 a 18 ore; p<0.05 agli altri tempi).

Anche in tabella 1 si può osservare che le mDC producono quantitativi di virus infettanti maggiori delle iDC e paragonabili a quelli prodotti da PBMC attivati con ConA .

(11)

Figura 13. iDC e mDC producono FIV dopo l’infezione. iDC (■) e mDC (□) sono state infettate con 4750 DI50 di FIV-Pet. Ai tempi indicati dall’infezione è stata misurata la quantità di p25 in ELISA. I valori rappresentano la media ±DS di colture in triplicato di un gatto singolo. Il supernatante di cellule normali aveva una DO450 < 0,045 a tutti i tempi analizzati.

0 0,2 0,4 0,6 0,8

0 12 24 36 48

giorni dopo l'infezione

DO

450

(12)

Tabella 1. FIV infettante rilasciato da iDC e mDC in confronto con PBMC, stimolati con ConA a vari tempi dall’infezione. a)I dati sono riportati come DI50/ml di supernatante di coltura. b ) I PBMC sono stati stimolati con ConA per due giorni

(13)

4.5 Il virus non altera la maturazione delle DC.

Per esaminare se il FIV influenza la capacità delle DC di maturare, le abbiamo spinoculate con 4750 DI5o di FIV-Pet o solo terreno iDC al 5° giorno di coltura e dopo 24 ore le cellule sono state trattate o no con 20ng/ml di LPS. Per verificare l’avvenuta maturazione, le cellule sono state marcate con due anticorpi specifici per iDC feline, MHC di classe II e B7.1 che in esperimenti precedenti erano risultati i migliori marcatori di maturazione. Come è mostrato nella figura 14, le cellule trattate con LPS, mostrano gli stessi profili di MHC di classe II e di B7.1, sia che siano infette (linea tratteggiata in grassetto) o no (linea continua in grassetto). È degno di nota il fatto che il FIV, di per sè, non porta le DC a maturazione, visto che le iDC infette (linee tratteggiate) e no (linee continue) mostravano gli stessi profili, per entrambi gli indicatori di maturazione. Abbiamo inoltre valutato l’abilità di queste cellule di stimolare linfociti T allogenici, dato che questa è considerata un’importante indicazione della maturazione delle DC.

Abbiamo messo a contatto con PBMC, in piastre da 96 pozzetti mDC e iDC non infette o infette in rapporto stimulator:responder 1:100 e 1:33 per 4 giorni, poi abbiamo aggiunto in ogni pozzetto 1 µCi di timidina triziata per altre 18 ore.

Come si può vedere in figura 15, le mDC infette (○) sono efficienti come le mDC non infette (●) nello stimolare una risposta allogenica. Viceversa le iDC (□,■) non riescono ad attivare i PBMC neanche dopo l’infezione, indicando che il virus di per sé non è capace di portare a maturazione le DC.

(14)

Figura 14. L’esposizione al FIV non altera la maturazione. mDC (linea continua in grassetto); iDC (linea continua); iDC infette (linea tratteggiata) o maturate dopo l’infezione (linea tratteggiata in grassetto). L’istogramma ombreggiato rappresenta l’isotipo negativo delle iDC non infette.

(15)

Figura 15. Reazione allogenica. (●) mDC non infette; (○) mDC infette; (■) iDC non infette e (□) iDC infette con FIV-Pet sono state coltivate per quattro giorni con 105 PBMC allogenici in rapporto stimulator:responder indicato. Nelle ultime 18ore le cellule sono state esposte a 1µCi di timidina triziata. I risultati sono espressi in colpi per minuto (cpm) di colture in triplicato.

(16)

4.6 Le DC feline non esprimono il CD134.

Recentemente è stato dimostrato che il CD134 è uno dei recettori primari per i recettori di FIV di fresco isolamento, per lo meno per certi tipi virali come GL8, FO045 e altri(Shimojima M.,et al 2004). FIV-Pet che è un ceppo virale adattato a crescere su colture cellulari non sembra dipendere da tale recettore(Shimojima M.,et al 2004). Nel tentativo di capire il diverso comportamento di FIV-Pet e FIV-M2 sulle iDC. Abbiamo voluto verificare se le DC feline esprimessero il CD134. All’inizio è stato usato BerACT35, un anticorpo specifico per CD134 umano, ma contrariamente a quanto osservato da altri (Shimojima M.,et al 2004) noi non abbiamo osservato alcuna reattività né su cellule T attivate, né su MBM, né su iDC. Quindi abbiamo utilizzato un altro anticorpo monoclonale, che è stato generato e caratterizzato dal dottor Brian Willet, università di Glasgow, UK. Tale anticorpo è stato ottenuto da topi immunizzati con il CD134 ricombinante, analizzato in ELISA inizialmente con una proteina contro il CD134, poi con il vettore retrovirale CD134 di cellule trasdotte (Willet B, comunicazione personale). Abbiamo infettato con 4750 DI50 di FIV-Pet tramite spinoculazione MBM e iDC. Il giorno dell’analisi, le cellule sono state accuratamente risospese e staccate. Sono state marcate con l’anti-CD134 felino e analizzate al FACS. Come si può osservare in figura 16 questo anticorpo ha reagito bene con le cellule MBM (a) invece, non è stata rilevata nessuna reattività da parte delle iDC (b). In figura 16c sono riportati i dati ottenuti trattando le DC di un altro gatto con anti-CXCR4 che ha reagito sia sulle DC che su i T, contaminanti la coltura. Si può notare che sia le DC (istogramma grande ottenuto dal gate 1) sia le cellule T (istogramma piccolo ottenuto dal gate 2) sono risultati positivi.

(17)

Figura 16. Espressione del CD134 e CXCR4 sulle iDC. (a) MBM e (b) iDC sono state marcate con anti-CD134 felino . (c) iDC di un altro esperimento sono state marcate con anti-CXCR4. Istogramma grande: analisi del gate 1 (iDC);

istogramma piccolo: analisi nel gate 2 (cellule T). È stato usato come controllo negativo L8D8 (istogramma ombreggiato). I pannelli in alto in SSC x FSC rappresentano i gate d’analisi.

(18)

4.7 Le iDC possono trasferire FIV-PET a PBMC attivati.

Abbiamo infettato iDC con FIV-Pet 4750 DI50 con spinoculazione, le abbiamo incubate per 2 ore a 37° C, lavate 2 volte e poi le abbiamo aggiunte a 5x 105 PBMC attivati con ConA. Come controllo abbiamo usato 5x 105 PBMC: non infetti, spinoculati, o coltivati con la stessa dose di virus a gravità ambiente.

Inoltre, per escludere che le cellule T potessero essere infettate dal virus rilasciato dalle DC senza il coinvolgimento del trasferimento attivo, i PBMC sono stati infettati senza essere lavati. Dopo 48 e 96 ore è stata verificata la presenza di p25 intracellulare al FACS analizzando 105 eventi. In figura 17 (a) sono mostrati i dati ottenuti dai PBMC non infetti, in figura 17 (b) sono rappresentati i dati ottenuti dai PBMC spinoculati con FIV-Pet e accuratamente lavati. Dopo 48h dall’infezione il 21.4 % di PBMC risultavano infetti, la percentuale decresceva al 13.5% dopo 96 ore. Se i PBMC venivano infettati senza spinoculazione e senza lavaggio (c), mostravano risultati sovrapponibili a quelli ottenuti con i controlli non infatti La figura 17 (d) mostra che già dopo 48h, 3,5% PBMC coltivati con DC infette erano positivi per la p25. La percentuale di cellule positive triplicava a 96 ore dall’infezione. Abbiamo anche la presenza di p25 nel supernatante di queste colture, i risultati presentavano lo stesso andamento di quelli ottenuti al FACS ( non mostrati ).

(19)

Figura 17. PBMC attivati con Con-A sono infettati in trans con FIV-Pet prodotto da iDC. I PBMC sono stati attivati con Con-A per 48 ore poi (a) lasciati normali; (b) spinoculati con FIV-Pet 4750 DI50 e lavati; (c) infettati e non lavati; (d) coltivati con iDC e lavate. I numeri in alto a destra rappresentano le percentuali di cellule T infette ai tempi rispettivi i dati sono mostrati in FL1 (p25) x SSC. (e) cellule T dopo 48h (le cellule normali e quelle infette sono indistinguibili); (f) iDC infette coltivate con le cellule T per 48h; (g) cellule T normali dopo 96h (le cellule normali e quelle spinoculate erano indistinguibili);

(h) iDC infette coltivate con le cellule T per 96h; Gli eventi sono stati analizzati in FSC x SSC.

Riferimenti

Documenti correlati

(1,00) (1,00) 166/202 (82%) 77% 0,493 0,20 0,39 Info Risultati Anteprima Modifica. Riepilogo Rivalutazione Valutazione manuale Analisi

Vedi tutte le valutazioni del corso Tabella per l'analisi dei risultati.. D# Testo domanda Testo risposta

1°Campione - Su 450 dipendenti (55% dei quali maschi) di un ente statale di Roma, il 36% ha dichiarato di essere contrario all'abbassamento dell'età pensionabile, il restante 64%

Il tasso è dato dal numero di iscritti nelle scuole secondarie di secondo grado per 100 giovani di età teorica corrispondente (14-18 anni).. Fino all’anno scolastico 81/82 andavano

Successivamente, si aggiunge ai dati la risposta di un altro cliente che dice “grande”... del settore turistico a

Nello stabilimento A si produce la metà dei pezzi, e di questi il 10% sono difettosi. Nello stabilimento B si produce un terzo dei pezzi, e il 7%

L’azienda Amerigo vende a cassette da 10 chilogrammi l’una, mentre l’azienda Burzi a cassette da 20 chilogrammi l’una. Nel grafico seguente sono rappresentati i prezzi praticati

il valore della frequenza relativa degli studenti provenienti dai Licei e dal Sud rispetto alla totalità degli studenti frequentanti il corso di Statistica. (1,00)