114 CAPITOLO 11
DISCUSSIONE DEI RISULTATI
L’Ischemia-Riperfusione renale individua un quadro patologico complesso dove l’interruzione dell’apporto ematico, seguita da una completa riperfusione d’organo, è responsabile di estesi fenomeni tubulo tossici e perdita della funzione d’organo, in misura variabile a seconda dell’entità e della durata della fase ischemica.
Durante la fase ischemica, oltre all’esaurimento delle riserve energetiche, responsabili della generazione di radicali liberi dell’ossigeno nella successiva riperfusione, si innescano numerosi segnali molecolari responsabili anche della produzione di citochine e chemochine, dell’attivazione di enzimi pro-infiammatori (es. COX-2 ed iNOS), dell’espressione di molecole d’adesione, oltre che responsabili del destino apoptotico della cellula. L’innesco di una risposta infiammatoria generalizzata alimenta e sostiene il danno radicalico per la presenza dell’infiltrato infiammatorio. Con questo studio sperimentale si è cercato di analizzare alcuni aspetti molecolari dell’attività nefroprotettiva del RSV, un polifenolo presente principalmente negli acini di uva e nel vino, dotato di numerose attività biologiche; lavori sperimentali su ratto evidenziano una sua azione nefroprotettiva, caratterizzata da un miglioraramento dei livelli di proteinuria, ipoalbuminemia, iperlipidemia [Nihei et al., 2001], creatinina sierica oltre che di riduzione del collasso glomerulare [Giovannini et al., 2001].
Nella progettazione di questo studio sperimentale sono stati presi in considerazione i dati farmacocinetici di questo composto, che ha uno scarso assorbimento, a fronte di una relativamente diffusa distribuzione tissutale.
Nella prima fase sperimentale gli animali hanno ricevuto un’unica somministrazione i.v. di RSV in modo da consentire di raggiungere le concentrazioni plasmatiche di 150-200 nM; la
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somministrazione è stata fatta 1h prima dell’evento ischemico dato che il composto è rapidamente eliminato nelle urine dopo circa 4h [Bertelli A.A.E. et al. Int J Tissue React.,1996].
I dati ottenuti confermano il ruolo nefroprotettivo del RSV sia in termini morfologici che funzionali, come riportato dalle immagini istologiche, dall’analisi della proteinuria e creatinina plasmatica. È nostra opinione che la protezione da parte del RSV sia imputabile alla modulazione dell’espressione di enzimi pro-infiammatori (es.COX) piuttosto che ad una attività antiradicalica/antiossidante.
Dati presentati in un altro lavoro sperimentale prodotto nel nostro laboratorio [Tesi di Dottorato di Guarini M., 2008] evidenziano infatti l’assenza di un effetto antiossidante da parte del RSV a queste concentrazioni anche nelle primissime fasi riperfusive, quando si ha la produzione di ROS [Qiao X. et al., 2005]. Le differenze tra i dati ottenuti e quelli pubblicati in altri lavori in merito all’effetto antiossidante è probabilmente tutto da attribuire alle basse concentrazioni di RSV usate nel nostro studio.
Al contrario, l’effetto del RSV sull’espressione di COX-2 è cruciale, in quanto l’aumento dell’espressione di questo enzima pro-infiammatorio è completamente inibita dalla somministrazione del polifenolo.
Per questo motivo abbiamo voluto indagare se fosse possibile individuare alcuni possibili segnali molecolari attivati o inibiti durante l’ischemia e riperfusione e modulati dal RSV; nello specifico è stata valutata l’attivazione di ERK 1/2 e AKT, in quanto sono entrambi coinvolti in numerosi meccanismi di protezione e sopravvivenza cellulare [Egom EE. et al., 2011, Lu Z .and Xu S., 2006]: i dati ottenuti hanno evidenziato una attivazione di ERK 1/2 dopo appena 30’ dalla somministrazione di RSV, mentre una attivazione di AKT solo dopo circa 3h (RSV TI+90’) dalla soministrazione i.v di RSV.
Anche negli animali con I/R si è osservato un’attivazione di questi segnali; in particolare il segnale ERK 1/2 presenta l’attivazione massimale al termine dell’ischemia per poi attenuarsi nelle
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successive fasi di riperfusione, mentre AKT si attiva nella primissima fase di riperfusione (I/R 5’) e i suoi livelli rimangono alti anche dopo 24h di riperfusione.
Oltre al fatto che questo dato permette di ipotizzare l’interazione del RSV con strutture recettoriali di membrana, come già altri autori suggeriscono [Klinge CM. et al., 2008], lo studio dei segnali ERK e AKT nel gruppo di animali trattati con RSV prima dell’evento ischemico confermerebbe il ruolo precondizionante [Chander et al., 2005] di questo composto come ulteriore meccanismo nefroprotettivo.
Sulla base dei dati emersi abbiamo pertanto sviluppato una seconda sessione sperimentale in vitro, per stabilire se la modulazione di questi ed altri segnali molecolari da parte del RSV, potesse determinare l’aumento dell’espressione di proteine responsabili della sopravvivenza cellulare. Per questo abbiamo deciso di studiare come target primario SIRT-1, in quanto è un enzima appartenente alla famiglia degli istoni deacetilasi (HDAC) coinvolto in molteplici processi cellulari, che nell’insieme favoriscono la sopravvivenza cellulare [North et al., 2004; Sinclair et al., 2006; Finkel et al., 2009]. SIRT1 è localizzata sia nel nucleo che nel citoplasma ed è espressa in tutti gli organi, anche se prevalente nei tessuti ad alto metabolismo energetico [Michishita et al., 2005]. Studi condotti su colture di cellule di mammifero evidenziano il ruolo “emergenzionale” di SIRT1 che è attivata in risposta alla deprivazione dei fattori di crescita ed all’aumentato stress ossidativo [Denu, 2003], oltre ad interagire e deacetilare fattori chiave coinvolti nella risposta allo stress [Yeung et al., 2004] modulandone l’attività trascrizionale. Recentemente è stato dimostrato che in presenza di un danno ipossico SIRT1 deacetila e quindi attiva il fattore di trascrizione HIF-2α, che regola l’attivazione di numerosi geni, codificanti per fattori di difesa cellulare verso insulti di tipo ipossico [Dioum et al.;2009]. Proprio a livello renale studi condotti su topi [He et al., 2010] hanno dimostrato la presenza di SIRT1 in particolare nella zona midollare; essendo questa la zona sottoposta maggiormente a condizioni di stress ossidativo, tale presenza fa supporre un ruolo antiossidante della SIRT1. Infatti, gli stessi autori [He et al, 2010] hanno indagato il ruolo della SIRT1 nella protezione da questo tipo di danno silenziando le cellule per il gene sirt1 ed esponendo
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in seguito queste cellule a stress ossidativo (H2O2) sia in presenza che in assenza del resveratrolo: nelle cellule silenziate la sopravvivenza cellulare era significativamente ridotta allo stimolo ossidativo rispetto a quelle non silenziate e che in queste ultime la presenza del resveratrolo, pur se dotato di attività antiossidante, non risultava vantaggioso per le cellule [Wenjuan HE et al, 2010]. Il ruolo cardine dell’espressione di SIRT-1 nella protezione da danno ossidativo è confermata anche in un altro lavoro [Hasegawa et al.,2008] in vitro su cellule del tubulo prossimale renale: se pure uno stimolo di natura ossidativa (H2O2) a concentrazioni crescenti, determini un aumento dell’espressione della SIRT1, nel caso di cellule trasfettate per over-esprimere la SIRT1 e successivamente incubate con H2O2 si osservava una marcata riduzione del numero di cellule apoptotiche.
Partendo da questi studi sperimentali, abbiamo voluto valutare se il RSV anche a basse concentrazioni, paragonabili a quelle ottenute negli studi di cinetica, fosse in grado di aumentare l’espressione della SIRT-1.
Per far questo non era possibile avvalersi di un modello animale che prevedesse una sola somministrazione, come pure era necessario avere la certezza che aumentando il numero di applicazioni fosse possibile determinare un aumento dell’espressione di SIRT-1; questi aspetti restavano interrogativi data la rapida cinetica ed escrezione dei composti fenolici.
La seconda fase sperimentale, condotta in vitro su cellule immortalizzate di tubulo prossimale renale umano (HK-2), ha dimostrato che queste cellule, aumentano l’espressione basale di SIRT-1 dopo 24h di incubazione con basse concentrazioni di RSV. Sebbene l’aggiunta di RSV 200 nM al terreno di coltura determini l’attivazione dei tre segnali molecolari indagati (ERK 1/2, AMPK e AKT), ERK ed AKT risultano attivarsi nelle prime fasi di incubazione, mentre AMPK solo tardivamente, se pure in modo più consistente.
Lo studio comparativo con cellule incubate in presenza dello stimolo ossidativo (H2O2) evidenzia un’analoga sequenza di attivazione di questi segnali da parte di H2O2, confermando l’ipotesi che
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l’azione precondizionante del RSV sia dovuta in gran parte all’attivazione di segnali molecolari in grado di condizionare l’espressione genica, oltre che l’attivazione di alcuni enzimi.
In particolare, l’utilizzo di inibitori specifici per ERK e AMPK hanno evidenziato l’importanza del segnale AMPK nel regolare l’espressione genica di SIRT-1.
Se confrontati con i dati degli studi condotti con cellule trasfettate, i livelli di espressione di SIRT-1 dopo incubazione con RSV subiscono solo un modesto incremento; tuttavia tale aumento risulta significativo e correlato con l’effetto citoprotettivo osservato in cellule tubulari incubate per 24h con RSV ed esposte allo stimolo citotossico ossidativo (H2O2).
Infine, questa fase ha evidenziato la capacità del RSV di up-regolare anche l’espressione di HIF-2α, un fattore di trascrizione che controlla i geni indotti durante l’ipossia o altri tipi stress [Semenza, 2000], in quanto in condizioni di normossia subisce una modificazione post traduzionale ad opera di idrossilasi specifiche O2-dipendenti [Bruick et al., 2001; Epstein et al., 2001; Mahon et al., 2001], la cui attività diminuisce con la riduzione dell’ossigeno, determinando un aumento della forma attivata di HIF.
Dato che HIF-2α è regolato anche da sistemi O2-indipendenti, è possibile che parte degli effetti precondizionanti passino dalla sua regolazione. Infatti l’aumento dell’espressione e attivazione di HIF-2α regola l’espressione dei geni che codificano per la superossido dismutasi, per il fattore di crescita endoteliale VEGF e per l’eritropoietina; fattori importanti di difesa cellulare soprattutto in tessuti e organi maggiormente suscettibili agli insulti di tipo ipossico, quali ad esempio rene, cuore ed encefalo [Dioum et al.;2009].
Grazie ai dati emersi dalle sperimentazioni in vitro è stato possibile allestire un’ultima sessione sperimentale su animale per valutare se la somministrazione ripetuta di RSV potesse costituire uno stimolo sufficiente a garantire una sommazione degli eventi associati all’attivazione dei segnali molecolari descritti, ovvero se una somministrazione ripetuta di basse concentrazioni di RSV potesse determinare un aumento dell’espressione di SIRT-1 tale da proteggere dall’insulto associato all’I/R. Dopo aver scelto come modalità di somministrazione quella intraperitoneale, rispetto a
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quella orale (vedi dati studio pilota Fig.51 pag. 104), è stato eseguito un trattamento subacuto di 15 giorni con RSV (300 µl 10uM). La scelta di sottoporre gli animali a I/R dopo 24h dall’ultima somministrazione di RSV è dovuta al fatto che, come già detto, in quest’ultima sessione sperimentale si voleva dimostrare che concentrazioni ematiche modeste di questo polifenolo nel caso di una somministrazione sufficientemente prolungata permette di osservare una up-regulation dell’espressione genica di SIRT-1, traducendosi in un aumento dei livelli proteici; ciò spiegherebbe alcuni degli effetti protettivi descritti in studi epidemiologici con soggetti che fanno uso, nella dieta, di alimenti contenenti RSV [Smoliga JM. Et al., 2011]. La particolarità di questa fase sta pertanto anche nei tempi sperimentali scelti, in quanto molti degli effetti biologici del RSV riportati in letteratura sono dovuti alla concentrazione di fenolo usata (spesso maggiore di 10µM) e per questo attribuibili all’azione anti-infiammatoria od anti-ossidante, comune ai polifenoli; tuttavia proprio le concentrazioni scelte, non verificate sull’uomo, non permettono di trovare una diretta corrispondenza coi dati epidemiologici citati.
I dati ottenuti dimostrano che nel caso di animali trattati 15gg con RSV per via intraperitoneale, si osserva un aumento dell’espressione basale di SIRT-1 a livello renale ed in particolare a livello tubulare. Tale aumento si osserva anche negli animali trattati per 15gg con RSV e poi sottoposti a I/R, rispetto agli animali ischemizzati e riperfusi per 24h; inoltre, questo dato correla con l’effetto protettivo del trattamento nei confronti del danno da I/R, come mostrato dall’analisi istologica e dei dati funzionali, analogamente a quanto già dimostrato in altri studi sperimentali in vitro [Hasegawa K. et al., 2008, He W.et al., 2010].
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CONCLUSIONI
I dati dello studio sperimentale in vivo ed in vitro dimostrano come il RSV sia una molecola complessa, capace di innescare segnali molecolari e regolare l’espressione genica, probabilmente dopo interazione con alcune strutture recettoriali [Li H., 2012, Klinge CM. et al., 2008]; inoltre viene dimostrato che modeste concentrazioni di RSV sono in grado di aumentare l’espressione basale di SIRT-1 nel tessuto renale, come risultato dell’attivazione di specifici segnali molecolari, primo tra tutti AMPK. Pertanto, anche se il RSV a concentrazioni micro molari ha una ben documentata azione anti-infiammatoria ed anti-ossidante, a concentrazioni nanomolari può regolare l’espressione genica di alcune proteine importanti per la sopravvivenza cellulare, come osservato in caso dell’aumentata espressione di SIRT-1; quest’ultimo aspetto avvalora i dati epidemiologici circa gli effetti cardio- e nefro-protettivi osservati in popolazioni che utilizzano, nella dieta, alimenti ricchi di polifenoli.
Pertanto, i dati emersi costituiscono un substrato scientifico per motivare ulteriori indagini circa il possibile utilizzo farmacologico dei polifenoli nel trattamento o nella prevenzione di patologie acute e croniche del tessuto renale.
