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Introduzione
Nel settore farmaceutico, a partire dagli anni '50, il verificarsi di un danno a livello epatico indotto a seguito della somministrazione di un farmaco è diventato il motivo principale del ritiro dal mercato del farmaco stesso. Le ragioni per cui la valutazione dei danni viene eseguita a livello epatico sono legate al ruolo principale che il fegato umano svolge nella detossificazione dell'intero organismo.
Lo screening ad alto rendimento di tossicità dei farmaci può essere eseguito su colture statiche 2D o su colture 3D. Il limite principale di questo approccio è la possibilità di valutare l'eventuale tossicità solo a livello molecolare. Anche l'utilizzo di animali per test di questo tipo presenta degli svantaggi, legati alla distanza filogenetica tra questi e gli esseri umani. Pertanto, l'industria farmaceutica è alla ricerca di nuovi sistemi per lo screening dei farmaci che permettano di prevedere danni al livello epatico in maniera più accurata e fisiologicamente più realistica. Negli ultimi anni sono stati realizzati per questo scopo dei sistemi biologici micro-elettro-meccanici (bioMEMS), noti come
"organs-on-chip". Questi sistemi miniaturizzati permettono di riprodurre in vitro la micro-architettura caratteristica del fegato, fortemente legata all'esplicazione delle sue funzioni, e la perfusione tipica del comparto epatico.
L’obiettivo del presente lavoro di tesi è realizzare, su un substrato di silicio,
mediante tecniche di attacco elettrochimico, una struttura tridimensionale che
replichi l’architettura tipica del lobulo epatico, la più piccola unità funzionale del
fegato. La presenza dei sinusoidi, disposti a raggiera intorno alla vena
centrolobulare e separati gli uni dagli altri da cordoni di cellule parenchimali,
rende la geometria del sistema da riprodurre molto complessa. La progettazione
del microambiente si complica ulteriormente se si considera la morfologia
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dell’endotelio delle pareti sinusoidali, caratterizzato da clusters di finestre che permettono sia lo scambio di ossigeno e nutrienti tra il sangue e gli epatociti che la comunicazione intercellulare. Il sistema che questo studio si propone di realizzare è costituito di microcanali nanostrutturati progettati per replicare in vitro sia l’organizzazione degli epatociti in cordoni, tipica dell’architettura lobulare, che la comunicazione intercellulare. Il sistema è pensato per essere parte, in futuro, di un dispositivo microfluidico che integri un apparato per il drenaggio del mezzo di coltura in grado di simulare il flusso sanguigno nei sinusoidi epatici e la diffusione di ossigeno e nutrienti.
Il presente lavoro di tesi consiste di quattro capitoli:
Anatomia microscopica del fegato
“Organs-on-chip”: stato dell’arte
Micro e nano-strutturazione elettrochimica del silicio
Verso un modello in vitro di lobulo epatico
Nel Capitolo 1 si analizzano gli aspetti principali dell’anatomia e della fisiologia epatica. In particolare, l’attenzione è stata focalizzata sulla micro e nano architettura dell’unità funzionale del fegato, il lobulo epatico, di cui sono descritte in dettaglio le principali cellule e strutture che lo compongono e le relative dimensioni geometriche.
Nella prima parte del Capitolo 2 è stata fatta una breve panoramica sulle diverse tipologie di colture cellulari attualmente diffuse (2D e 3D) per comprendere le ragioni che hanno portato allo sviluppo di nuove piattaforme per colture, gli “organs-on-chip”, che mettono insieme le conoscenze nell’ambito dei sistemi micro-elettro-meccanici (bioMEMS), della microfluidica, della biomimetica e della biologia. Molti organi sono stati riprodotti in vitro con un approccio di questo tipo. La seconda sezione del capitolo è dedicata alla descrizione più dettagliata di questi dispositivi, focalizzando l’attenzione sui dispositivi realizzati per riprodurre in vitro l’architettura lobulare epatica.
Nell’ultima parte del capitolo viene descritta l’idea rivoluzionaria di riprodurre, su
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