RIASSUNTO 4
ABSTRACT 7
Introduzione 9
1.1 Lo Sviluppo del Sistema Nervoso 10 1.1.2 Formazione delle vescicole encefaliche 12
1.2 L’Epitalamo 13
1.3 L’organo pineale in Xenopus laevis 15
1.3.1 Sviluppo 15
1.3.2 Struttura e Funzione 16 1.3.2.1 L’organo pineale 16
o L’organo frontale 17
o L’epifisi 18
1.4 Controllo genetico dello sviluppo dell’organo pineale 20
1.4.1 Xrx1 20
1.4.2 Xotx5 21
1.4.3 Xenopus notochord-specific, Xnot2: 22 1.5 I Ritmi circadiani 25
1.6 Il gene “Brain Specific homeobox” 29 1.6.1 Bsh in Drosophila melanogaster 29
1.6.2 Bsx in topo 33
1.7 Scopo del lavoro di tesi 36
Materiali e metodi 38
2.1 Trasformazione di cellule di E.coli ed amplificazione del DNA plasmidico. 39 2.1.1. Trasformazione 39 2.1.2 Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina “(miniprep”) 40 2.1.3 Estrazione di DNA plasmidico su media scala (“midiprep”) mediante colonne
NUCLEOBOND 41
2.2. Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione 43
2.3 Purificazione del DNA 44 2.3.1 Estrazione fenolica 44 2.3.2 Precipitazione alcolica 45 2.4 Elettroforesi su gel di agarosio 45 2.5 Ibridazione in situ “whole mount” 47
2.5.3 Preparazione della sonda per gli esperimenti di “whole mount” 53 2.5.4 Preparazione dell’ “Egg extract” 54 2.5.5 Depigmentazione (“bleaching”) 55 2.5.6 Inclusione degli embrioni in paraffina 55 2.5.7 Sezioni di embrioni 56
2.5.8 Fotografie 57
2.6 Microiniezione di embrioni di Xenopus laevis 57 2.6.1 Sintesi in vitro dei trascritti da microiniettare (Melton et al., 1985) 58 2.7 Reazione cromogenica per la β-galattosidasi 59 2.8Crescita degli embrioni di Xenopus laevis in condizioni cicliche di luce 60
2.9 Cloni 61
Risultati 63
Premessa 65
3.1 Analisi dell’espressione genica di Xbsx 65 3.1.2 Confronto fra il “pattern” d’espressione di diversi geni espressi nell’organo pineale e
Xbsx 71
3.2 Effetto della sovraespressione di geni espressi precocemente nel territorio
dell’organo pineale su Xbsx 73 3.2.1 Effetto della sovraespressione di Xrx1 73 3.2.2. Effetto della sovraespressione di Xnot2 77 3.2.3 Effetto della sovraespressione di Xotx5b su Xbsx. 81 3.3 Analisi della sovraespressione di Xbsx 84
3.4. Analisi dei ritmi circadiani 91 3.4.1 Analisi dell’espressione di Aanat-2. 91 3.4.2 Analisi dell’ espressione di Irbp. 93 3.4.3. Analisi dell’espressione circadiana di Aanat-2 e Irbp. 94
Discussione 98
Xbsx durante lo sviluppo di Xenopus laevis 99 La regolazione dell’espressione di Xbsx 101 Il ruolo di Xbsx nell’organo pineale 102
Conclusioni 107
Bibliografia 109
RIASSUNTO
Il sistema foto-neuroendocrino traduce le condizioni di luce ambientali nella produzione di segnali endocrini e neuroendocrini. Centrale per questo processo è l’organo pineale che svolge un ruolo evolutivamente conservato nella sintesi ciclica e nel rilascio ritmico di melatonina, un ormone che è in grado di influenzare il ritmo del sonno e della riproduzione. Nei Vertebrati inferiori l’organo pineale contiene fotorecettori la cui attività mette in moto un orologio endogeno circadiano e regola la trascrizione nei pinealociti.
Dalla letteratura sono noti geni caratterizzati da una trascrizione che varia con un robusto ritmo giorno-notte. Recentemente sono stati identificati alcuni geni chiave dell’orologio circadiano, il cui nucleo è costituito dai fattori di trascrizione Clock e Bmal1. Tuttavia poco si sa sui meccanismi che regolano l’espressione di questi geni sia temporalmente che spazialmente.
Nel mio lavoro di tesi ho analizzato l’espressione e la funzione di Bsx (“Brain Specific homeobox”), un nuovo gene “homeobox” espresso nell’organo pineale dell’anfibio anuro Xenopus laevis. Bsx, omologo di Bsh di Drosophila melanogaster, è un gene altamente conservato, isolato infatti oltre che in Xenopus laevis anche in topo e uomo. L’omeodominio di Bsx è caratterizzato dalla presenza in posizione 50 di un residuo di glutammina, specifico di molti membri della famiglia “homeobox” come i geni Hox della classe Antennapedia.
Ho inizialmente determinato il profilo di espressione di Xbsx durante lo sviluppo embrionale, attraverso ibridazioni in situ su embrioni interi (“whole mount”) e successive sezioni istologiche, confrontandolo con l’espressione di geni notoriamente trascritti nel complesso pineale, quali Xrx1, Otx5 e Xnot2.
Xbsx è già presente a stadio di neurula precoce con una marcatura localizzata in poche cellule disposte bilateralmente nel Diencefalo dorsale presuntivo;
successivamente, con la chiusura del tubo neurale, si osserva la fusione delle due aree di espressione lungo la linea mediana proprio in corrispondenza della regione che darà origine all’organo pineale.
Qui l’espressione di Xbsx perdura per tutto lo sviluppo embrionale, continuando ad essere presente anche nel girino. Xbsx può essere quindi considerato uno dei marcatori più precoci dell’organo pineale.
Per capire quali fossero i fattori che regolano l’espressione di Xbsx ho analizzato Xrx1, Otx5 e Xnot2 valutandone la capacità di attivare l’espressione di Xbsx tramite microiniezione del loro mRNA in embrioni precoci. In seguito alla sovraespressione di Xrx1 e di Xnot2 si osservano aree di attivazione ectopica di Xbsx in regioni prosencefaliche, con una frequenza che aumenta in maniera dose-dipendente. Al contrario la microiniezione di Xotx5 induce espressione ectopica di Xbsx solo debolmente ed a bassa frequenza.
Per capire se Xbsx svolga un ruolo nello sviluppo del complesso pineale, ho effettuato esperimenti di microiniezione del suo mRNA e analizzato eventuali cambiamenti nell’espressione di Otx5, Xnot2 e Xrx1. I dati ottenuti non hanno mostrato modificazioni rilevanti nell’espressione di questi due marcatori e questo sembra quindi indicare che Xbsx non sia sufficiente da solo a specificare il territorio che darà origine all’organo pineale.
Vista l’espressione così specifica di Xbsx nell’organo pineale, una possibile ipotesi è che possa essere coinvolto nella regolazione dei ritmi circadiani. Per saggiare questa ipotesi è necessario avere come riferimento geni la cui espressione nella pineale è caratterizzata da variazioni cicliche legate ai ritmi circadiani. I marcatori principalmente usati per questo scopo sono Aanat (“N- acetyltransferase”) e Irbp (“Interphotoreceptor binding protein”) la cui espressione durante lo sviluppo di Xenopus laevis non è ancora stata descritta.
Mediante una ricerca effettuata in banche dati ho individuato gli omologhi di Xenopus di questi due geni e, tramite ibridazioni in situ, ne ho verificato l’espressione nell’organo pineale.
Successivamente ho verificato la loro espressione ritmica tramite ibridazione in situ “whole-mount” effettuata direttamente su cervelli di Xenopus prelevati a stadio 46. I risultati ottenuti nell’esperimento hanno evidenziato chiaramente la capacità del gene Aanat2, ma non di Irbp, di rispondere in maniera ciclica a ritmi costanti di luce/buio.
Gli effetti della sovraespressione o della perdita di funzione di Xbsx sull’espressione di Aanat-2 permetteranno in futuro di valutare il ruolo di questo gene nel controllo dei ritmi circadiani.
ABSTRACT
The photo-neuroendocrine system translates enviromental light conditions into the circadian production of endocrine and neuroendocrine signals.
Central to this process is the pineal organ, which has a conserved role in the cyclicl synthesis and release of melatonin. In lower Vertebrates the pineal organ contains photoreceptors whose activity entrains an endogenous circadian clock and regulates trancription in pinealocytes.
Several genes whose transcription varies with robust circadian rhythm have been described. The core of the biological clock is constituted by the transcription factors, like CLOCK and BMAL1. Nevertheless little is known about mechanisms implicated in the regulation of these genes.
In this work I have analysed the expression and function of Xbsx (Brain Specific homeoboX), a new homologue of the Drosophila Brain Specific homeobox, Bsh, expressed in the pineal organ of Xenopus laevis .
Xbsx displays a homeodomain containing, in position 50, a glutammine residue found in many other homeobox families such as the Antennapedia- class Hox genes.
The developmental expression pattern of Xbsx was defined by “whole mount in situ hybridation” followed by hystological sections and compared to the expression of other genes known to be expressed in the pineal organ.
Xbsx transcriptions are first detected at the early neurula stage in few cells located bilaterally in the prospective dorsal diencephalon roof, corrisponding to the epiphysial anlage. Here Xbsx expression persists until tailbud stages. Thus Xbsx represents a very early marker of the pineal organ.
To unravel the genetic network controlling Xbsx activation in such specific regionAfterwards I tested the effects of Xrx1, Xotx5b and Xnot2 microinjection on Xbsx expression, Overexpression of Xrx1 and Xnot2 induces Xbsx ectopic activation in the prosencephalic region in a dose-dependent manner. Instead, Xotx5b microinjection activates Xbsx at a lower extent than the other two genes.
significantly changes in Xrx1, Xotx5b and Xnot2 expression, suggesting that Xbsx is not sufficient to specify the pineal organ identity.
The pineal complex is the main structure responsible for the production of melatonin, which in turn regulates circadian rhythms. As Xbsx is expressed in the pineal organ, it is conceivable that this gene might be involved in the control of circadian rhythms
To test this hypothesis it is necessary to isolate Xenopus genes known to be characterized by circadian expression in other species. To this purpose I idebtified the Xenopus homologue ofi Aanat-2 (N-Acetyltransferase) and Irbp (Interphotoreceptor binding protein) and verified their expression in the pineal organ.
The rhythmical expression of these genes was also tested by whole mount in situ hybridation on dissected stage 46 tadpoles brains. The results have clearly show the Aanat-2, but not Irbp, is expressed in a cyclic manner when embryos are exposed to alternating rhythms of light/dark.
Aanat-2 will be an essential marker for Xbsx gain- and loss of function experiments aimed at addressing the role of this homeobox gene in circadian rhythms control.
