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2. Materiali e Metodi
2.1 VETTORI
I vettori sono molecole di DNA capaci di replicarsi in maniera autonoma che possono essere utilizzati per trasferire o amplificare frammenti di DNA esogeni.
I più comuni sono basati su plasmidi composti da moduli discreti che conferiscono varie caratteristiche.
In questo lavoro di tesi ho utilizzato vari costrutti.
Costrutti usati per produrre RNA cappato:
pCS2-Xhmga2-CR: contiene la coding region di di Xhmga2β escluse le regioni 5' e 3' UTR;
pCS2-hPatz: contiene la coding region della variante 4 di patz1 di Homo sapiens, subclonato dal plasmide pCEFL-hPatz-HA, prestatoci gentilmente da Monica Fedele, Istituto di Endocrinologia e Oncologia Sperimentale (IEOS) CNR, Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare, Università di Napoli Federico II;
pCS2-nucβgal: contiene la regione codificante per una forma di beta galattosidasi a localizzazione nucleare. Il corrispondente mRNA è usato come tracciante nelle iniezioni.
Costrutti usati per i probe antisenso:
TOPO-Xtwist, contiene un cDNA di Xtwist (circa 1kb) clonato in pCR2.1-TOPO.
pGEM-T-Patz1; contiene un frammento di cDNA di Patz1 di Xenopus di 808 n, clonato per PCR da cDNA di Xenopus laevis nel vettore pGEM-T.
2.2 DIGESTIONE DI DNA
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l’ossatura del DNA rompendo i legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3' di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5' del nucleotide successivo.
Tale processo può essere utilizzato per la linearizzazione di plasmidi al fine di ottenere RNA cappato o sonde di RNA, può essere usato per verificare la procedura di ligation, per trasferire un inserto in un vettore e per capirne l'orientamento all'interno di esso.
Per la reazione di digestione viene preparata la seguente miscela: X μl di Restriction Buffer 10x (per una concentrazione finale di 1x)
-15 μg di DNA
-30μl
La miscela è incubata O.N. A 37°C e la reazione è fermata con inattivazione termica a 65°C per 10 min, o per aggiunta di 1 ul di EDTA 0.5M.. Per verificare l'effettiva digestione viene fatto correre 1 μl del volume di reazione; questa aliquota è diluita in TE o dH2O, e caricata su gel d'agarosio dopo aggiunta di colorante; viene quindi fatta
correre, tramite elettroforesi, insieme ad un campione di controllo di DNA non digerito e ad un marcatore di pesi molecolari.
2.3 PURIFICAZIONE DI DNA PLASMIDICO
La purificazione di DNA digerito ha previsto l’utilizzo del kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-UP”, Promega.
Se la digestione non è completa, è preferibile effettuare una corsa elettroforetica per isolare la banda di DNA digerito.
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si aggiunge alla banda di gel un volume pari a 1 μl/mg di gel di Membrane Binding Solution e la miscela viene incubata a 50-65°C fino a che la banda di gel non sia completamente dissolta;
la miscela viene caricata su un filtro inserito in una provetta di raccolta e viene incubata per 1 min a R.T.;
si effettua una centrifuga a 10000 g per 1 min, si scarta l'eluato;
si aggiungono 700 μl di Membrane Wash Solution, si centrifuga a 10000 g per 1 min e si scarta l'eluato;
si aggiungono 500 μl di Membrane Wash Solution, si centrifuga a 10000 g per 5 min e si scarta l'eluato;
si centrifuga per ulteriori 5 min a 10000 g e si trasferisce il filtro in una provetta di raccolta sterile;
si aggiungono 35 μl di acqua milliQ, si incuba per 1 min a R.T. E si centrifuga per 1 min a 10000 g.
Per risalire alla concentrazione del DNA ottenuto un’aliquota del campione viene sottoposto a una misurazione allo spettrofotometro e alla comparazione dell'intensità della banda su in elettroforesi su gel rispetto a un campione a concentrazione nota.
La soluzione di DNA purificato viene conservata a -20°C.
2.4 LIGATION
La reazione di ligation permette di legare le estremità di DNA attraverso l'azione dell’enzima T4DNA ligasi in modo da formare molecole di DNA ricombinante, ad esempio per legare un inserto all'interno di un vettore.
In questo particolare caso, per evitare la chiusura del vettore su se stesso (self-ligation), le sue estremità vengono fosforilate usando l'enzima
Shrimp-Alkaline-30
Phosphatase (SAP). 1U di SAP, in presenza dell'appropriato SAP-buffer è in grado di defosforilare fino a 1μg di vettore. L’enzima viene poi inattivato termicamente incubando la miscela a 65°C per 15 min.
La miscela di defosforilazione può essere direttamente utilizzata nella reazione di ligation.
La reazione avviene nella seguente miscela:
X μl di vettore e inserto (per un rapporto molare 1:3-1:5)
-2U di Ligasi T4 (5U se le molecule hanno blunt ends) blunt ligation)
La miscela è incubata per 10 min a 22°C (o per 60 min in caso di blunt ends). L'enzima viene inattivato con uno shock termico di 10 min a 65°C.
La miscela di reazione può essere usata direttamente per effettuare la trasformazione batterica. Vengono aggiunti 3-7-10 μl della miscela a 100 μl di cellule competenti DH5α.
La presenza dell'inserto di DNA viene verificata attraverso lo screening bianco-blu legato alla attività della galattosidasi o per screening delle colonie per PCR.
2.5 TRASFORMAZIONE BATTERICA
Per la trasformazione batterica sono stati usati E.coli del ceppo DH5α. Sono caratterizzati da un'elevata efficienza di trasformazione e presentano delle caratteristiche utili nelle tecniche di DNA ricombinante:
- la mutazione endA1 inattiva una endonucleasi intracellulare che degrada il plasmide nei metodi di miniprep;
- l'allele mutato Δ(lacZ)M15 è necessario per il fenomeno di α-complementazione con il gene della β-galattosidasi per lo screening
bianco-31 blu;
- recA elimina la ricombinazione omologa riducendo le delezioni e la multimerizzazione del plasmide.
La trasformazione del ceppo di cellule competenti è stata effettuata secondo il seguente protocollo:
510 ng di vettore vengono aggiunti a 100 μl di cellule batteriche conservate a -80° e scongelate;
la soluzione è tenuta in ghiaccio per 30 secondi;
la soluzione è sottoposta a shock termico a 42-45°C per 3 minuti e poi nuovamente in ghiaccio per 5 minuti;
le cellule sono piastrate su un terreno di crescita solido selettivo contenente ampicillina (100 μg/ml), antibiotico specifico per la selezione del plasmide; le piastre sono incubate O.N. a 37°C.
Il controllo negativo è rappresentato dalla piastratura di cellule batteriche a cui non è stato aggiunto il vettore plasmidico.
Ciascuna singola colonia ottenuta è trasferita in terreno di crescita liquido contenente 100 μg/ml di ampicillina e incubata O.N. a 37°C al fine ottenere una maggiore quantità di vettore da estrarre.
Per l'estrazione di DNA tramite mini-prep sono usati 5 ml di terreno di crescita, per l'estrazione di DNA tramite midi-prep sono usati 100 ml di terreno di crescita.
Il mezzo di crescita usato per i terreni liquidi e solidi è il Lysogeny-Broth, il quale contiene:
NaCl 1% Bacto Tryptone 1% Bacto yeast extract 0,5%
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2.6 ESTRAZIONE DI DNA PLAMIDICO: mini-prep
La Miniprep di DNA plasmidico è una tecnica di laboratorio utilizzata in biologia molecolare per l'estrazione, su piccola scala, di DNA plasmidico dai batteri trasformati che lo contengono. Per ciascuna reazione si parte da una singola colonia batterica inoculata in 5 ml di brodo di crescita L.B. contenente ampicillina ad una concentrazione pari a 100 μg/ml. La coltura è incubata O.N. a 37°C in uno shacker fino al raggiungimento della fase stazionaria della crescita batterica.
Per tale tecnica è stata utilizzato il kit “Wizard plus minipreps DA purification” della Promega.
Il protocollo utilizzato è il seguente:
la coltura viene centrifugata a 10000 g per 5 min. Il sovranatante viene scartato e il pellet è risospeso in 200 μl di Cell Resuspension Solution;
la soluzione viene agitata con vortex e tenuta a R.T. Per 5 min;
vengono aggiunti 250 μl di Cell Lysis Solution e la provetta viene invertita delicatamente 5-6 volte e incubata a R.T. per 5 min;
vengono aggiunti 350 μl di soluzione S3 e la provetta viene invertita 5-6 volte; la soluzione viene centrifugata a 14000 g per 10 min;
il sovranatante viene trasferito in una colonnina con filtro sterile, a sua volta inserita in una provetta di raccolta;
la soluzione è centrifugata a 14000 g per 1 min a R.T. e l'eluato viene scartato; vengono aggiunti 750 μl di Column Wash Solution e la soluzione è centrifugata
a 14000 g per 1 min a R.T. e l'eluato viene scartato;
il passaggio precedente viene ripetuto con 250 μl di Column Wash Solution; la soluzione viene centrifugata a 14000 g per 10 min,
la colonnina con filtro viene trasferita in una provetta sterile, vengono aggiunti 35 μl di R.F. H2O, incubando la colonnina a R.T. Per 1 min;
si opera centrifuga a 14000 g e il filtro viene scartato.
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e comparazione dell'intensità della banda su gel rispetto a un campione a concentrazione nota.
La soluzione viene conservata a -20°C.
2.7 ESTRAZIONE DI DNA PLASMIDICO: midi-prep
La Midiprep di DNA plasmidico è una tecnica di laboratorio utilizzata in biologia molecolare per l'estrazione, su grande scala, di DNA plasmidico dai batteri trasformati che lo contengono. Per ciascuna reazione si parte da una singola colonia batterica inoculata in 100 ml di brodo di crescita L.B. contenente ampicillina ad una concentrazione pari a 100 μg/ml. La coltura è incubata O.N. a 37°C in uno shaker
fino al raggiungimento della fase stazionaria della crescita batterica.
Per tale tecnica è stata utilizzato il kit “Nucleobond Xtra-Midi plasmid purification” della Macherey-Nagel.
Il protocollo utilizzato è il seguente:
la coltura viene centrifugata a 5000 g per 30 min a 4°C . Il sovranatante viene scartato e il pellet è risospeso in 8 ml di Resuspension Solution, contenente RNasi;
la soluzione viene agitata mediante vortex e tenuta a R.T. Per 5 min;
vengono aggiunti 8 ml di Lysis Buffer e la provetta viene invertita delicatamente 5-6 volte e incubata a R.T. per 5 min;
le colonne con filtro e membrana di silice vengono lavate con 12 ml di Equilibration Buffer;
la reazione di lisi viene fermata aggiungendo al 8 ml di Neutralization Solution e la provetta viene invertita 5-6 volte;
il lisato viene trasferito nella colonna con filtro sterile, a sua volta inserita in una provetta di raccolta e si attende che la soluzione venga filtrata;
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sono aggiunti altri 5 ml di Equilibration Buffer al filtro che viene poi scartato; sono aggiunti 8 ml di Wash Solution alle colonne affinchè passino attraverso la
membrana di silice;
le colonne sono posizionate in provette di poliallomeri per centrifuga e vengono aggiunti 5 ml di Eluition Solution;
vengono aggiunti 3,5 ml di isopropanolo all'eluato che viene agitato tramite vortex e poi incubato a R.T. Per 2 min;
la soluzione è centrifugata a 15000 g per 30 min a 4°C e il sovranatante viene scartato;
il pellet viene lavato per due volte con 200 μl di etanolo al 70%.
il pellet viene lasciato asciugare completamente e risospeso in 100 μl di R.F. H2O.
Per risalire alla concentrazione di DNA ottenuti si opera una misura allo spettrofotometro e una comparazione dell'intensità della banda su gel rispetto a un campione a concentrazione nota.
La soluzione viene conservata a -20°C.
2.8 ELETTROFORESI SU GEL
L'elettroforesi su gel d'agarosio è stata utilizzata per controllare l'effettiva digestione di frammenti di DNA, per valutare la concentrazione di DNA estratto da mini o midi-prep, per valutare la concentrazione e la qualità dell'RNA estratto dagli embrioni, per valutare la concentrazione dell'RNA cappato trascritto in vitro o per verificare i prodotti di PCR. In particolare è stato utilizzata per effettuare l'RT-PCR (vedi paragrafo “2.19 RT-PCR”).
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Il gel di agarosio è preparato sciogliendo polvere di agarosio all'1% w/v in TBE all'1%. La soluzione è portata ad ebollizione e viene aggiunto bromuro d'etidio (Br-Ed) diluito 1:20000 partendo dallo stock 10 μg/μl. La soluzione viene versata in uno stampo doptato di appositi pozzetti. Una volta polimerizzato, il gel viene posto in una vasca per elettroforesi con TBE 1x.
Ai campioni viene aggiunto il loading buffer per una concentrazione finale 1x.
Il DNA o RNA viene caricato negli appositi pozzetti e viene applicata alla vasca una differenza di potenziale. La visualizzazione delle bande avviene attraverso una lampada-UV che eccita il Br-Ed intercalato nei filamenti di acido nucleico.
DNA Loading Buffer:
6x 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)
0.03% blu di bromofenolo (corre come frammenti di 300-400bp) 0.03% xilene cianolo FF (corre come frammenti di 4000bp) 60% glicerolo
60 mM EDTA
RNA loading buffer 2x: 95% formamide
0.025% SDS
0.025% blu di bromofenolo (corre poco più veloce del rRNA 5S) 0.025% xilene cianolo FF ( corre poco più veloce del rRNA 18S) 0.025% bromuro d'etidio 0.5 mM EDTA TBE 5x: EDTA 10 mM Tris borate 450 mM Acqua Elix
36 2.9 ANALISI ALLO SPETTROFOTOMETRO
Le analisi allo spettrofotometro viene usato per misurare la concentrazione e la purezza del DNA estratto da mini o midi-prep, per misurare la concentrazione dell'RNA estratto dagli embrioni, per misurare la concentrazione dell'RNA cappato trascritto in vitro.
Ciascun campione è diluito in acqua milliQ e viene misurata l'assorbanza a diverse lunghezze d'onda. L'assorbanza a 260 nm (A260nm) viene usata per la misura della concentrazione. I rapporti A260nm/280nm e A260nm/230nm sono usati per valutare l'eventuale contaminazione dei campioni da parte di proteine o sali.
Lo spettrofotometro usato è il Gene Quant pro, Amersham Bioscience.
2.10 TRASCRIZIONE DI RNA CAPPATO
La sintesi in vitro di RNA cappato è necessaria per effettuare le microiniezioni negli embrioni. É stato usato il kit mMessage mMachine, Ambion. L'RNA sintetizzato presenta il cappuccio RNA 7-metilguanosina, ma non la coda di poli-A . Essa viene aggiunta una volta che l'RNA si trova nell'embrione grazie al segnale di sintesi della coda di poli-A presente sul trascritto sintetico (i vettori di espressione hanno incorporata una sequenza che viene copiata durante la trascrizione in vitro).
Il DNA di partenza è contenuto in un vettore di espressione. Esso deve essere opportunamente linearizzato ottenendo estremità 5'-overhanging in modo da evitare la sintesi di mRNA dal filamento complementare di quello desiderato. La sintesi in vitro è possibile grazie alla possibilità di usare uno o più specifici promotori virali presenti nei vettori, in particolare, nei nostri esperimenti il promotore per la SP6 RNA polimerasi.
37
viene preparata una miscela aggiungendo componenti nel seguente ordine: 10 μl di 2x NTP/cap mix
Acqua Nucleasi free per un volume finale di 20 μl 2μl di Reaction Buffer 10x
800-1000 ng del plasmide linearizzato 2 μl di enzyme mix (SP6 o T7)
la reazione viene incubata per 2h a 37°C;
viene aggiunto 1 μl di Turbo Dnasi e viene incubata per 15 min a 37°C;
vengono aggiunti 115 μl acqua Nucleasi free e 15 μl di Ammonium Acetate Stop Solution;
sotto cappa aspirante a flusso laminare viene aggiunto un uguale volume di miscela di fenolo:cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1), la miscela viene agitata con vortex e centrifugata per 5 min a 14000 g.
la fase acquosa viene raccolta in una provetta sterile da 1,5 ml e viene e aggiunto un ugual volume di isopropanolo;
la soluzione è raffreddata a -80°C per 40 min; la soluzione è centrifugata a 14000 g per 15 min;
il sovranatante viene scartato e il pellet è lavato 2 volte con etanolo al 70% pre-raffreddato;
quando il pellet è completamente asciutto viene risospeso in 22 μl di acqua milliQ.
Per risalire alla concentrazione di RNA ottenuti si opera misura allo spettrofotometro e comparazione dell'intensità della banda su gel rispetto a un campione a concentrazione nota.
38 2.11 TRASCRIZIONE DI SONDE DI RNA
La sintesi di specifiche sonde antisenso è necessaria per effettuare lìanalisi d'espressione attraverso l'ibridazione in situ. Le sonde presentano uridine digossigenate (Dig-dUTP) che le rendono riconoscibili da specifici anticorpi coniugati con fosfatasi alcalina (AP anti-DIG) per la rivelazione colorimetrica del segnale.
La sintesi in vitro è possibile grazie alla presenza sul vettore di specifici promotori virali quali T7, SP6 o T3.
Il protocollo attuato è il seguente:
viene preparata una miscela aggiungendo componenti nel seguente ordine: 2 μl di DTT 100 μM 2 μl di Transcription Buffer 10x 2 μl di DIG-Nucleotide mix 1 μl di Rnasin Solution 2 μl di RNA polimerasi (SP6, T7 o T3) 2 μg di DNA linearizzato
acqua milliQ fino a un volume finale di 20 μl la reazione viene incubata per 2h a 37°C;
vengono aggiunti 2 μl di Dnasi e la reazione è incubata per 15 min a 37°C; vengono aggiunti 2.2 μl di Ammonio Acetato 5mM per una concentrazione
finale di 0.5 mM;
vengono aggiunti 48 μl di etanolo al 100% e la reazione è incubata a -20°C per 40 min;
la reazione è centrifugata a 14000 g per 15 min;
il sovranatante viene scartato e il pellet è lavato 2 volte con etanolo al 70% pre-raffreddato;
39 milliQ.
Per risalire alla concentrazione di RNA ottenuti si opera misura allo spettrofotometro e comparazione dell'intensità della banda su gel rispetto a un campione a concentrazione nota.
La soluzione contenente la sonda è stata diluita alla concentrazione di 10 ng/μl (10x) con l'Hybridization Solution buffer e conservata a -20°C.
Hybridization Solution: Salt Solution 1x formammide 50% Dextran 10% torula tRNA 1mg/ml Denhardt’s Solution 1x milliQ water Salt Solution 10x: NaCl 134 g Tris-HCl pH 7.5 14.04 g Tris Base 1.34 NaH2PO4*2H2O 7.8 g NaHPO4 7.1 g EDTA pH8 100ml Denhardt’s 100x: BSA 2% Ficoll 2% polivinilpirrolidone 2%
40
2.12 WHOLE- MOUNT IN SITU HYBRIDATION (WISH)
L’ibridazione in situ whole-mount (WISH) (Harland, 1991) è una tecnica comune utilizzata per studiare l'espressione genica attraverso la localizzazione di trascritti di mRNA specifico all'interno di un organismo in sviluppo. Tale tecnica può essere usata sia su embrioni wild type che su embrioni precedentemente iniettati con diversi costrutti (vedi paragrafo “Microiniezione degli embrioni”).
La WISH sfrutta l’appaiamento specifico che avviene fra le coppie di basi azotate e che rende possibile l’associazione molecolare fra due sequenze polinucleotidiche complementari. La presenza di nucleotidi digossigenati (Dig-dUTP) nelle sonde antisenso le rende riconoscibili da specifici anticorpi coniugati con fosfatasi alcalina (AP anti-DIG). Quest’ultima, in presenza di un opportuno substrato colorimetrico (BMPurple, Roche), produce un precipitato colorato che si deposita stabilmente nel sito di localizzazione dell’enzima.
Preparazione degli embrioni
Gli embrioni allo stadio desiderato vengono raccolti e fissati in MEMFA 1x per 1h a R.T. in bascula e successivamente conservati in etanolo al 100% a -20°C fino al momento dell'utilizzo.
Se gli embrioni sono stati iniettati con β-gal il protocollo di WISH può avere inizio dopo la procedura di rivelazione del tracciante (vedi paragrafo “rivelazione della β-gal).
Reidratazione degli embrioni
Gli embrioni sono tenuti in etanolo 100% a R.T. sulla bascula per 10-15 min.
Si effettua un lavaggio da 5 min in etanolo al 25 % in PTw e un lavaggio da 5 min in Ptw. Tutti i lavaggi sono effettuati in agitazione orizzontale.
Permeabilizzazione degli embrioni
Gli embrioni sono incubati in PTw e Proteinasi K 10 µg/ml (1:2000) per 5(-15) min in verticale a R.T., senza agitazione. Vengono effettuati 2 lavaggi da 3 min in Ptw in agitazione orizzontale.
41 Acetilazione
Vengono effettuati 2 lavaggi da 5 min in trietanolammona (TEA) 0.1M, pH 7-8 con Hcl in agitazione orizzontale e 1 lavaggio da 5 min in PTw in agitazione orizzontale.
Post-fissazione
Gli embrioni vengono incubati in PFA 4% in Ptw per 20 min e poi vengono effettuati 2 lavaggi da 5 min in PTw in agitazione orizzontale.
Preibridazione
Vengono aggiunti 250 µl di NIH a 1 ml di PTw e gli embrioni sono incubati per 5 min in agitazione orizzontale a R.T.
Si pongono gli embrioni in 0.5 ml di NIH e vengono incubati per 1-6 h a 62°C.
Ibridazione
Il probe viene generalmente utilizzato allo 0.1X (1X = 1 ng/ml) diluito in NIH. Se richiesto può essere usato anche a concentrazioni minori o maggiori. La miscela di ibridazione viene denaturata per 2 min a 95°C, poi posta in ghiaccio, agitata in vortex e quindi brevemente centrifugata. L'NIH viene sostituito con la soluzione contenente la sonda e incubare O/N a 62°C.
Eliminazione della sonda in eccesso
La miscela contenente il probe viene rimossa e vengono effettuati 2 lavaggi da 30 min con SSC 2X-CHAPS 0.1%; 2 lavaggi da 30 min con SSC 0.2X-CHAPS 0.1% e 2 lavaggi da 15 min in MABT 1X a R.T.
Incubazione con anticorpo:
Gli embrioni sono preincubati in MABT 1X-Blocking 2%-FBS (o LS) 20% per 30 min a R.T., in agitazione orizzontale.
La soluzione viene sostituita con l'anticorpo diluito 1:2500 in MABT 1X-Blocking 2%-FBS (o LS) 20%; l'anticorpo antidigossigenina (Roche) va agitato in vortex e tenuto in ghiaccio.
42
L'incubazione viene effettuata per 4h a R.T. in agitazione verticale. Eliminazione dell'anticorpo in eccesso
Vengono effettuati 6 lavaggi da 1h in MABT 1X a R.T. Di questi, uno, preferibilmente non il primo, O/N a 4°C.
Rivelazione
Viene effettuato 1 lavaggio da 5 min in AP Buffer in agitazione orizzontale.
Si sostituisce la soluzione con 500 µl di BM Purple e gli embrioni sono mantenuti coperti in agitazione verticale fin quando la precipitazione del substrato non dà un segnale soddisfacente. Gli embrioni sono fissati incubandoli in MEMFA 1X per 40 min-1 h (o a 4°C O/N) in agitazione orizzontale.
Bleaching:
Viene effettuato 1 lavaggio da 10 min in etanolo assoluto.
Gli embrioni sono poi incubati fino a completo sbiancamento (bleaching) in soluzione di bleaching sotto luce fredda. Gli embrioni sono conservati in etanolo al 100% a -20°C. PBS 10x: NaCl 80 g KCl 2 g Na2HPO4 7,63 g KH2PO4 2 g
acqua milliQ per un volume finale di 1L pH 7.4 con NaOH PTw 0.1%: PBS 1x Tween20 0.1% acqua milliQ
43 PFA 20%:
dissolvere la polvere al 20% (w/v) in acqua milliQ 10 µl NaOH 10M
riscaldare a 50°C per alcune ore fino a completo scioglimento della polvere la soluzione può essere conservata a -20°C
NIH solution:
Blocking Reagent Roche 1% formammide 50% SSC 20x 25% riscaldare a 65°C per 1h torula tRNA 1 mg/ml Heparin 0.1 mg/ml Chaps 0.1% Tween20 0.1% EDTA 5mM acqua milliQ SSC-Chaps 0,1%:
SSC 20x diluito alla concentrazione finali di 2x o 0,2x Chaps 10% (v/v) diluito allo 0,1% (v/v)
acqua milliQ
SSC 20x (saline-sodium-citrate): 3M NaCl
300mM sodio citrato pH 7 con HCl
44 Blocking-Solution:
Lamb serum 10% o 20%
Blocking Reagent Roche 1% o 2% TBS-X 0.1% TBS-X 0.1%: TBS 1x Triton-X 100 0.1% acqua milliQ TBS 10x: Tris 0.5M NaCl 1.38M KCl 0.027M pH 8 con HCl MEMFA 1x: formaldeide 3,7%
sali MEM 1x (10x stock: MOPS 1M pH7.4, EGTA 20 mM, MgSO4 10mM) acqua milliQ AP-buffer: NaCl 0,1M (2 ml di soluzione 5M) MgCl2 0,05M (5 ml di soluzione 1M) Tris-HCl 0,1M pH 9,5 (10 ml di soluzione 1M) Tween20 0.1% (v/v) (100 µl di soluzione al 10%) Tetramisole 0.048% (w/v) (48 mg)
acqua milliQ (83 ml per un volume finale di 100 ml)
45 Bleaching-Solution: 6,66 ml H2O2 30% 1,25 ml SSC 20x 2,5 ml formammide 43 ml di acqua milliQ
2.13 MICROINIEZIONE DI EMBRIONI DI XENOPUS
La microiniezione è quella tecnica che permette l’introduzione di DNA, RNA o altro in uova fecondate di Xenopus laevis. Questa tecnica è stata utilizzata con lo scopo di studiare in vivo la funzione di specifiche sequenze geniche bloccandone l’espressione, grazie all’utilizzo di oligonucleotidi antisenso morpholino, o sovraesprimendole, iniettando il messaggero senso. A seconda delle finalità dello studio, vengono iniettate sia molecole di RNA che di DNA.
L’acido nucleico introdotto viene progressivamente perso a causa di eventi di degradazione e di diluizione. Sebbene la presenza del DNA o RNA esogeno sia temporanea, gli effetti provocati dalla perturbazione nell’espressione genica dell’embrione possono essere duraturi.
Per ottene embrioni di Xenopus laevis le rane devono essere stimolate la sera precedente la fecondazione con gonadotropina corionica umana (hCG). L'iniezione di 400 µl di hCG, pari a 800 U.I., viene effettuata a livello del sacco linfatico dorsale sul dorso della rana.
Il testicolo viene prelevato dal maschio anestetizzato con MMS 0.1% tramite operazione e conservato nella soluzione Testis a 4°C.
Le uova vengono raccolte in piastre Petri alle quali viene aggiunta una piccola porzione di testicolo macerato.
Dopo circa 30-40 min è possibile osservare la rotazione corticale, che evidenzia la riuscita della fecondazione.
46
quale è lasciata agire per circa 5 min e lavare con MMR 0.1x.
Durante l'iniezione le uova vanno tenute in una soluzione densa di Ficoll (Ficoll PM400, GE Healthcare) al 4% in MMR 0.1x per ridurre la fuoriuscita del citoplasma dal foro di iniezione.
É stato utilizzato il Drummond Micro-Injector sul quale viene montato un microcapillare di vetro contenente la soluzione da iniettare, la quale fuoriesce grazie alla pressione di un pistone. Il volume di iniezione usato (pulse) è di circa 10 nl.
Gli embrioni iniettati sono stati mantenuti in Ficoll per circa 1h per poi essere trasferiti in MMR 0.1x in modo da evitare infezione batterica e non interferire con i movimenti di gastrulazione. Sono mantenuti a 14°C per almeno una notte. Successivamente sono tenuti a 14°C-18°C-22°C a seconda della velocità di crescita desiderata.
Una volta raggiunto lo stadio desiderato gli embrioni sono fissati per il protocollo di ibridazione in situ o congelati a -80°C per l'estrazione di RNA.
Grazie al particolare processo di sviluppo dell'embrione di Xenopus è possibile iniettare l'embrione in un solo lato (identificabile dal tracciante) e usare il lato non iniettato come controllo interno.
MMS:
metil-metan-sulfonato dissolto alla concentrazione finale dello 0,1% (w/v) in acqua deionizzata (Sigma Aldrich)
Testis Solution: MMR 0,1x
Lamb Serum 10% gentamicina 20 μg/ml
47 MMR 0.1x: NaCl 0,1M KCl 2mM MgSO4 1mM CaCl2 2mM HEPES 5mM pH 7,8 EDTA 0,1 μM acqua mQ Dejelling Solution: DTT 3.2mM (160 μl di 1M) Tris-HCl pH8.8 0.2M (10ml di 1M)
mQ fino al volume finale (40ml to a final volume of 50ml)
2.14 MORPHOLINO ANTISENSE OLIGOs
Il morpholino è una molecola antisenso appositamente sintetizzata per bloccare il processo di traduzione. Tali molecole sono state iniettate in embrioni allo stadio di 4 blastomeri per interferire con l'espressione genica durante lo sviluppo.
Gli oligonucleotidi morpholino utilizzati in questi esperimenti sono:
MO-Msx1 che blocca la traduzione di Xmsx1 (Monsoro-Burq et al., 2005); MO-Slug che blocca la traduzione di Slug (Zhang et al., 2006);
Le sequenze degli oligonucleotidi morpholino sono:
MO-Msx1 5’-GCCATACAGAGAGATCCGAGCTGAG-3’ MO-Slug 5’-CGTGGCATTTTCACTGCGGGCGGGA-3’
48 2.15 RIVELAZIONE DELLA β-GAL
Per riconoscere il sito di iniezione negli embrioni si fa uso di un tracciante coiniettato con le molecole di interesse. In questi esperimenti è stata usata la proteina β-galattosidasi nucleare prodotta a partire dall'RNA cappato iniettato.
La rivelazione è ottenuta grazie all'utilizzo di un substrato cromogenico di tale enzima come la Salmon-Gal.
Il protocollo usato è il seguente:
gli embrioni sono incubati in MEMFA 1x per 30 min a R.T. in agitazione orizzontale;
vengono effettuati due lavaggi in PBS 1x per 5 min a R.T. in agitazione orizzontale;
gli embrioni vengono posti in 500 µl di Revelation Solution e incubati a 37°C fino a che il segnale della Salmon-Gal non sia visibile
gli embrioni sono incubati in MEMFA 1x per 30 min a R.T. in agitazione orizzontale;
vengono effettuati due lavaggi in PBS 1x per 5 min a R.T. in agitazione orizzontale;
gli embrioni possono essere conservati in etanolo al 100% a -20°C fino al momento dell'utilizzo.
MEMFA 1x:
3,7% formaldeide (stock al 37%)
1x sali MEM (10x: MOPS 1M pH7.4, EGTA 20 mM, MgSO4 10mM) acqua milliQ
Ferri Solution 10x:
300mM K3Fe(CN)6 (1.38 g)
300mM K4Fe(CN)6*3H2O (1.79 g)
49 Revelation Solution:
1x Ferri solution
5μl of Salmon-Gal (lo stock è 50mg/ml in metanolo) 1μl of MgCl2 1M
PBS 1x al volume finale di 500 μl
2.16 ESTRAZIONE DI RNA DAGLI EMBRIONI
Gli embrioni sono inizialmente congelati a -80°C e l'RNA è estratto utilizzando il kit “Nucleospin RNA II”, Macherey-Nagel.
Il protocollo eseguito è qui riportato:
sono aggiunti 350 µl di RA1 solution alla provetta contenente gli embrioni; sono aggiunti 3,5 µl di β-mercaptoetanolo e la provetta viene agitata tramite
vortex fin quando i tessuti non sono completamente disgregati;
la soluzione con il lisato cellulare viene trasferita in un sistema con filtro apposito (violet ring filter);
si centrifuga per 1 min a 11000 g;
il filtro viene scartato e si aggiungono 350 µl di etanolo al 70%;
il lisato è caricato in una provetta dotata di un altro filtro (blue ring filter) e centrifugata per 30 sec a 11000 g;
il filtro è posizionato in una nuova provetta;
si aggiungono 350 µl di Membrane Desalting Buffer e si centrifuga per 1 min a 11000 g;
si prepara una miscela di 10 µl di Reconstituted rDnase e 90 µl di Reaction Buffer for rDnase di cui se me aggiungono 95 µl al campione che viene incubato a R.T. per 15 min;
si aggiungono 200 µl di RA2 Solution che inattiva la rDnasi; si centrifuga per 30 sec a 11000 g e si scarta l'eluato;
50 scarta l'eluato;
si aggiungono 250 µl di RA3 Solution, si centrifuga per 2 min a 11000 g; si posiziona il filtro in una nuova provetta;
si eluisce con 30 µl di acqua RNase-free, si incuba per 1 min a R.T.; si centrifuga per 1 min a 11000 g.
Si quantifica la concentrazione di RNA tramite analisi spettrofotometriche e elettroforesi su gel e si controlla l'efficienza dell'estrazione.
L'RNA è conservato a -80°C.
2.17 RETROTRASCRIZIONE DI cDNA
L'RNA estratto dagli embrioni è stato retrotrascritto usando il kit “GO-Script reverse transcription system”, Promega.
La reazione di retrotrascrizione con primers aspecifici (oligo dT) consente la produzione di cDNA che verrà poi utilizzato nella reazione di RT-PCR semiquantitativa per determinare la quantità relativa di specifici trascritti.
Vengono preparate due reazioni, una a cui verrà aggiunto l’enzima trascrittasi inversa (RT) e un controllo negativo senza enzima. Eventuale presenza di prodotti di PCR in questo secondo campione indicherebbe una contaminazione della preparazione di RNA da parte di DNA genomico.
Il protocollo usato è il seguente:
Viene preparata la seguente miscela: 500 ng-5 µg di RNA
1 µl di primers oligo dT
51
si riscalda la miscela a 70°C per 5 min e si tiene in ghiaccio per altri 5 min; si prepara la miscela:
3µl MgCl2 (final concentration between 1.5-5mM) 1µl PCR nucleotide mix
0,5µl Recombinant Rnasin (20 units) 1µl Go-Script Reverse Transcriptase
6,5µl Nuclease-free water (volume finale 15µl)
Unire le due miscele e sottoporli ai seguenti cicli termici: 5min at 25°C (annealing)
60min at 42°C (estensione)
15min at 70°C (inattivazione enzimatica)
2.18 REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
La tecnica di reazione a catena della polimerasi PCR (polymerase chain reaction), permette di produrre un elevato numero di copie di una specifica sequenza di DNA attraverso un processo di amplificazione. La
reazione avviene tramite cicli ripetuti costituiti da 3 fasi:
1. Denaturazione termica del DNA stampo per separare i filamenti della doppia elica.
2. Appaiamento di oligonucleotidi complementari alle estremità della sequenza stampo che si intende amplificare.
3. Estensione di nuovi filamenti di DNA complementari allo stampo grazie all’attività di una DNA polimerasi DNA dipendente che utilizza gli oligonucleotidi come inneschi per la replicazione.
52 2.19 RT-PCR semiquantitativa
È stata utilizzata questa tecnica per valutare il livello di espressione genica negli embrioni wilde type durante lo sviluppo.
Dopo l'estrazione di RNA e la sintesi del primo filamento di cDNA, è stata effettuata una reazione di PCR per paragonare i livelli di espressione del gene Xpatz1.
Come controllo interno è stato analizzato il livello di espressione dell'ornitina decarbossilasi (ODC), gene costitutivo in base al quale è stata effettuata una normalizzazione delle intensità delle bande di DNA sottoposte a elettroforesi.
La miscela di reazione usata è la seguente: 5 μl Buffer Go-Taq Green 5x
-Taq polymerase (0,625U per ogni reazione) -3μl cDNA (ottenuto dal protocollo di retrotrascrizione)
Le condizioni di PCR sono state le seguenti:
a 55°C per 30 sec a 72°C per 45 sec
53 2.20 PRIMER UTILIZZATI
• Primer utilizzati per la RT-PCR e per il clonaggio del segmento corrispondete alla sonda per la WISH
Patz1F2: 5’-GGGAATTCGCATACACGGCACGAATAGTG-3’ Patz1R2: 5’-GGGAATTCGTGGTAGGACATCCTATCTTTG-3’ GAATTC: sito di restrizione dell’enzima BamHI
2.21 FOTOGRAFIE
Le fotografie degli embrioni interi sono state realizzate mediante una fotocamera digitale CoolSNAP-cf montata in asse focale ad uno stereoscopio Nikon SMZ1500 con l’ausilio di una coppia di fibre ottiche.
Il trattamento delle immagini è stato realizzato con l’ausilio del software Adobe Photoshop CS 5.1.
