58
Parte sperimentale
Parte sperimentale
Parte sperimentale
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Materiali e Metodi.
I punti di fusione sono stati determinati usando l’apparecchiatura Reichert Kofler. Gli spettri di risonanza magnetica nucleare di routine sono stati registrati in soluzione DMSO-d6 o CDCl3-d6 su un Bruker operante a 400MHz. Il potere ottico rotatorio (α) usando un
polarimetro Perkin Elmer modello 343. L’evaporazione è stata eseguita sotto vuoto (evaporatore rotante). L’analisi TLC è stata effettuata in Merck 0,2 millimetri con fogli di alluminio prerivestiti in gel di silice (60F-254). Per la cromatografia su colonna è stato utilizzato gel di silice 60 (230-400 mesh).
Tutti i reagenti usati sono prodotti commerciali e tutti i solventi sono di grado analitico. I composti 5-nitro-2-fenilindolo 943, N-Boc-L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico 1339, N-Boc-L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 14, L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico
1539 e L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 16 sono stati preparati secondo le procedure descritte in precedenti lavori.
Procedura generale di sintesi di derivati 2-(fenilindolo-3-il)-gliossilamidici (1-6).
Ad una soluzione sotto agitazione e raffreddata a 0° di 2-fenilindolo (0.500 g, 2.6 mmol) disponibile commercialmente, in 10 ml di etere etilico appena distillato viene aggiunto goccia a goccia ossalil cloruro (0.31 ml, 3.6 mmol) in 2 ml dello stesso solvente. La miscela viene mantenuta a temperatura ambiente per 3 ore. Il precipitato formato viene raccolto tramite filtrazione sotto vuoto e viene utilizzato per la reazione successiva senza ulteriori purificazioni.
Una soluzione dell’appropriato dipeptide nella sua forma di estere metilico
((L)-Fenilalanina-(L)-Leucina; (L)-Valina-(L)-Leucina; (L)-Leucina-(L)-Valina;
(L)-Isoleucina-(L)-Isoleucina; (L)-Isoleucina-(L)-Valina; (L)-Valina-(L)-Isoleucina) (0.7 mmol) in 5 ml di toluene anidro viene aggiunta, goccia a goccia, ad una sospensione sotto agitazione e in bagno di ghiaccio di gliossil cloruro 7 (0.177g, 0.63 mmol), in 15 ml dello stesso solvente. Successivamente viene aggiunta trietilammina (1.6 mmol, 0.23 mL) e la miscela di reazione è lasciata a temperatura ambiente per circa 4 ore ( analisi TLC) e poi filtrata. Il precipitato raccolto viene lavato con una soluzione acquosa al 5% di NaHCO3 e
60 Il toluene viene rimosso sotto pressione ridotta e il residuo solubilizzato in CH2Cl2. La
soluzione organica viene lavata con:
• NaHCO3 al 5%
• H2O
• HCl 10% • H2O
Dopo essiccamento su MgSO4 il solvente viene evaporato cosi da ottenere un’altra
porzione del composto desiderato. I composti 1-6 vengono infine purificati tramite cromatografia flash (Miscela eluente: Acetato di etile/Esano 4:6).
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere metilico 1. Resa 50%; p.f. 95-97°C; α = -36; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.84-0.91 (m, 6H, 2CH3);
1.51-1.53 (m, 2H, CH2); 2.72-2.88 (m, 3H, CH2, CH); 3.59 (s, 3H, COOCH3); 4.29-4.32
(m, 2H, 2CH); 7.06-7.49 (m, 11H, Ar-H); 7.77 (d, 1H, Ar-H, J = 8.2 Hz); 8.41 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 6.8 Hz); 8.76 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 8.2 Hz); 12.32 (bs, exch. D2O,
1H, NH).
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Valina-(L)-Leucina estere metilico 2. Resa 50%; p.f. 107-110°C; α = -32; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.82-0.93 (m, 12H, 4CH3);
1.52-1.57 (m, 3H, CH2, CH); 1.89-1.96 (m, 1H, CH); 3.59 (s, 3H, COOCH3); 3.9-4.2 (m, 1H,
CH ); 4,23-4.31 (m, 1H, CH); 7.17-7.25 (m, 2H, Ar-H); 7.40-7.45 (m, 3H, Ar-H); 7.49-7.63 (m, 2H, Ar-H); 7.97 (d, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz); 8.34 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 7.2
Hz); 8.52 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 8.8 Hz); 12.35 (bs, exch. D2O, 1H, NH).
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Valina estere metilico 3. Resa 50%; p.f. 93-103°C; α = -34; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.79-0.90 (m, 12H, 4CH3);
1.22-1.34 (m, 4H, 2CH,CH2); 3.59 (s, 1H, COOCH3); 4.12-4.25 (m, 2H, 2CH); 7.13-7.27 (m,
4H, Ar-H); 7.44-7.48 (m, 3H, Ar-H); 7.56-7.60 (m, 1H, Ar-H); 7.97 (d, 1H, Ar-H, J = 7.2 Hz); 8.17 (bs, exch. D2O, 1H, NH). 8.65 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 8.6 Hz); 12.30 (bs,
61
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Isoleucina-(L)-Isoleucina estere metilico 4. Resa 50%; p.f. 95-100°C; α = -30; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.79-0.89 (m, 12H, 4CH3);
1.19-1.21 (m, 3H, CH, CH2); 1.74-1.76 (m, 3H, CH,CH2); 1.74-1.76 (m, 3H, CH, CH2);
3.59 (s, 3H, COOCH3); 4.14-4.19 (m, 2H, 2CH); 7.16-7.24 (m, 2H, Ar-H); 7.42-7.58 (m,
4H, Ar-H); 7.58-7.62 (m, 2H, Ar-H); 7.94 (d, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz); 8.24 (d, 1H, NH, exch. D2O, J = 7.6 Hz); 8.56 (d, exch. D2O, 1H, NH, J = 8.8 Hz); 12.35 (bs, exch. D2O,
1H, NH).
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Isoleucina-(L)-Valina estere metilico 5. Resa 50%; p.f. 106-110°C; α =-31; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.81-0.94 (m, 14H,
6CH3,CH2); 1.41-1.44 (m, 1H, CH); 1.63-1.66 (m, 1H, CH); 3.61 (s, 3H, COOCH3);
4.13-4.20 (m, 2H, 2CH); 7.14-7.29 (m, 2H, Ar-H); 7.44-7.46 (m, 4H, Ar-H) ; 7.60-7.64 (m, 2H, Ar-H); 7.96 (d, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz); 8.23 (d, exch D2O, 1H, NH, J = 7.4 Hz); 5.58 (d,
exch D2O, 1H, NH, J = 9.2 Hz); 12.36 (bs, exch D2O, 1H, NH).
2-[(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Valina-(L)-Isoleucina estere metilico 6. Resa 65.8%; p.f. 90-94°C; α = -27; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.81-0.84 (m, 12H, 4CH3);
1.21-1.43 (m, 2H, CH2) ; 1.76-1.85 (m, 2H, 2CH); 3.59 (s, 3H, COOCH3); 4.05-4.24 (m,
2H, 2CH); 7.18-7.59 (m, 8H, Ar-H); 7.97 (d, 1H, Ar-H, J = 7.4 Hz); 8.24 (d, 1H, exch. D2O, NH, J = 7 Hz); 8.56 (d, exch D2O, 1H, NH, J = 8.8 Hz); 12.36 (bs, exch. D2O, 1H,
NH).
Procedura di sintesi del 5-nitro-2-fenilindolo 9.
Ad una soluzione di sodio nitrato (1.40 g, 16.5 mmoli) in acido solforico concentrato (50 ml) viene aggiunta, in bagno di ghiaccio, una soluzione di 2-fenilindolo (3.00 g, 15.5 mmoli) in 100 ml dello stesso solvente. La reazione viene lasciata sotto agitazione per 5 minuti e successivamente dilutita con acqua e ghiaccio. Il precipitato formato viene raccolto tramite filtrazione e purificato tramite cristallizzazione da diclorometano.
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Procedura generale di sintesi di:
N-Boc-L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico 13. N-Boc-L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 14.
Ad una soluzione di N-Boc-L-Leucina o N-Boc-L-Fenilalanina (0.9 mmoli) in DMF anidra (10 ml), sotto atmosfera di azoto, viene aggiunto CDI (0.146 g, 0.9 mmoli). La soluzione viene lasciata in agitazione, a temperatura ambiente, per 2 ore. Successivamente viene aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di L-Fenilalanina o L-Leucina, nella loro forma di estere etilico (1.8 mmoli), in 5 ml dello stesso solvente. Il dipeptide 13 o 14 si forma quantitativamente in circa 4-5 ore (analisi TLC). Il solvente viene evaporato sotto pressione ridotta e il residuo triturato con una soluzione acquosa satura di NaHCO3, lavato
con acqua e infine filtrato, per ottenere il prodotto desiderato. I composti 13 e 14 sono stati utilizzati nella reazione successiva senza ulteriori purificazioni.
N-Boc-L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico 13. Resa 90%; p.f. 74-76°C (lit. ref. n°39 p.f. 78-80°C);
N-Boc-L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 14. Resa 86%; p.f. 103-105°C (lit. ref. n°45 p.f. 109-112°C);
Procedura generale di sintesi di:
L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico 15. L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 16.
Ad una soluzione del composto 13 o 14 (0.3 mmoli) in 10 ml di CH2Cl2 viene aggiunto
acido trifluoroacetico (2ml, 20 mmoli) e la miscela è lasciata a temperatura ambiente per 6 ore (analisi TLC). Il solvente viene poi evaporato sotto pressione ridotta per ottenere un residuo solido che viene ripreso con acqua. La soluzione ottenuta è alcalinizzata (pH 5-10) tramite aggiunta di K2CO3, ed estratta con CH2Cl2. Dopo essicazione su MgSO4, il
solvente organico è eliminato tramite evaporazione sotto pressione ridotta per ottenere il composto desiderato. I composti 15 e 16 sono stati utilizzati nelle successive reazioni senza ulteriori purificazioni.
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L-Leucina-L-Fenilalanina estere etilico 15. Resa 80%; p.f. 263-266 (lit. ref. n° 39 p.f. 268-270 °C)
L-Fenilalanina-L-Leucina estere etilico 16. Resa 78%; p.f. 160-163 (lit. ref. n°45 p.f 150-154)
Procedura generale per la sintesi di:
5-[nitro-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico17. 5-[nitro-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere etilico 18.
Ad una soluzione sotto agitazione e raffreddata a 0° di 5-nitro-2-fenilindolo 9 (0.658 g, 2.6 mmol) in 10 ml di etere etilico appena distillato viene aggiunto goccia a goccia ossalil cloruro (0.97 ml, 11.2 mmol) in 2 ml dello stesso solvente. La miscela viene mantenuta a temperatura ambiente per 12 ore. Il precipitato formato viene raccolto tramite filtrazione sotto vuoto e viene utilizzato per la reazione successiva senza ulteriori purificazioni.
Una soluzione del composto 15 o 16 (4.9 mmoli) in 5 ml di toluene anidro viene aggiunta goccia a goccia, in bagno di ghiaccio, ad una sospensione del composto 10 (4.3 mmoli) in 15 ml dello stesso solvente. Successivamente viene aggiunta una soluzione di trietilammina (1.33 ml, 9.5 mmoli) e la miscela di reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per circa 4 ore (analisi TLC) e poi filtrata. Il precipitato raccolto viene lavato con una soluzione acquosa al 5% di NaHCO3 e raccolto nuovamente per avere
una prima aliquota del prodotto desiderato. Il toluene viene rimosso sotto pressione ridotta e il residuo solubilizzato in CH2Cl2. La soluzione organica viene lavata con:
• NaHCO3 al 5%
• H2O
• HCl 10% • H2O
Dopo essiccamento su MgSO4 il solvente viene evaporato cosi da ottenere un’altra
porzione del composto desiderato. I composti 17 o 18 vengono infine purificati tramite cromatografia flash (Miscela eluente: Acetato di etile/Esano 4:6).
64
5-nitro-[2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico 17. Resa 74%; p.f. = 108-112°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.82 (dd, 6H, 2CH3, J =
6.36 Hz, J = 19.5 Hz); 1.06 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz); 1.22-1.29 (m, 1H, CH); 1.36-1.49
(m, 2H, CH2); 2.96-2.99 (m, 2H, CH2); 3.97 (q, 2H, CH2, J = 7.0 Hz); 4.15-4.22 (m, 1H,
CH) 4.46 (q, 1H, CH, J = 7.4 Hz); 7.22-7.28 (m, 5H, Ar-H); 7.45-7.47 (m, 3H, Ar-H); 7.62-7.65 (m, 2H, Ar-H); 7.68 (d, 1H, Ar-H, J = 8.8 Hz); 8.18 (dd, 1H, Ar-H, J = 8.8 Hz, J = 9.2 Hz); 8.45 (d exch. D2O, 1H, NHCO J = 7.2 Hz); 8.74 (d exch. D2O, 1H, NHCO, J =
8.4 Hz); 8.92 (d, 1H, Ar-H, J = 2.4 Hz); 13.00 (bs exch. D2O, 1H, NH).
5-nitro-[2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)- Fenilalanina (L)-Leucina estere etilico 18. Resa 70%; p.f. = 85-89°C. 1H NMR (400 MHz, CDCl3-d6) δ (ppm): 0.86 (t, 6H, 2CH3, J = 6.8
Hz); 1.06 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz); 1.42-1.56 (m, 3H, CH2CH); 2.96 (d, 2H, CH2, J = 6.8
Hz); 3.97 (q, 2H, CH2, J = 7.0 Hz); 4.35-4.39 (m, 1H, CH); 4.49-4.52 (m, 1H, CH); 6.18
(d, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz); 7.09-7.15 (m, 2H, Ar-H); 7.19-7.24 (m, 3H, Ar-H); 7.26-7.31 (m, 6H, Ar-H); 7.70 (d exch. D2O, 1H, NH, NHCO, J = 8 Hz); 7.98 (d exch. D2O, 1H,
NH, NHCO, J = 10.8 Hz); 8.86 (d, 1H, Ar-H, J = 2.0 Hz); 10.50 (bs exch. D2O, 1H, NH).
Procedura generale per la sintesi di:
5-[Amino-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico 19. 5-[Amino-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere etilico 20.
Una miscela del composto 17 o 18 (4.0 mmoli) e Pd/C (0.28g) in 20 ml di acetato di etile e 20 ml di metanolo viene idrogenata a temperatura ambiente e sotto vuoto. Nel momento in cui l’assorbimento di idrogeno cessa (3-4h) viene filtrato il catalizzatore ed evaporato il solvente per ottenere il composto desiderato.
I derivati 19 e 20 vengono ottenuti sufficientemente puliti da poter essere utilizzati nello step successivo senza ulteriori purificazioni.
65
5-[Amino-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico 19. Resa 71%; p.f. = 97-100°C; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.79 (dd, 6H, 2CH3, J =
6.4 Hz; J = 22.0 Hz); 1.06 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz); 1.11-1.15 (m, 1H, CH); 1.32-1.44 (m,
2H, CH2); 2.90-3.02 (m, 2H, CH2); 3.97-4.05 (m, 3H, CH, CH2, J = 7.2 Hz); 4.46 (q, 1H,
CH, J =7.6 Hz); 4.87 (bs exch D2O, 2H, NH2); 6.61 (dd, 1H, ArH, J = 2.4 Hz; J = 8.8 Hz);
7.16 (d, 1H, Ar-H, J = 8.8 Hz); 7.20-7.23 (m, 3H, Ar-H); 7.26-7.29 (m, 2H, Ar-H); 7.34-7.38 (m, 4H, Ar-H); 7.49 -7.51 (m, 2H, Ar-H); 8.33 (d exch D2O, 1H, NHCO, J = 7.2 Hz);
8.41 (d exch D2O, 1H, NHCO, J = 8.8 Hz); 11.92 (bs exch D2O, 1H, NH);
5-[Amino-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere etilico 20. Resa: 75%; p.f. = 110-113°C. 1H NMR (400 MHz, CDCl3-d6) δ (ppm): 0.79 (t, 6H, 2CH3, J = 6.8
Hz); 1.06 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz); 1.31-1.52 (m, 3H, CH2CH); 2.82 (d, 2H, CH2, J = 6.4
Hz); 3.43 (q, 2H, CH2, J = 7.0 Hz); 4.21-4.37 (m, 1H, CH); 4.47-4.52 (m, 1H, CH); 4.64
(bs exch D2O, 2H, NH2); 6.70 (dd, 1H, ArH, J = 2.4 Hz; J = 8.8 Hz) 7.16 (d, 1H, Ar-H, J
= 8.8 Hz); 7.20-7.23 (m, 3H, Ar-H); 7.26-7.29 (m, 2H, Ar-H); 7.34-7.38 (m, 4H, Ar-H); 7.49 -7.51 (m, 2H, Ar-H); 8.33 (d exch D2O, 1H, NHCO, J = 7.2 Hz); 7.51 (d exch. D2O,
1H, NH, NHCO, J = 8 Hz); 7.76 (d exch. D2O, 1H, NH, NHCO, J = 10.8 Hz); 10.21 (bs
exch. D2O, 1H, NH).
Procedura generale per la sintesi di:
5-[Isotiocianato-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico 21.
5-[Isotiocianato-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere etilico 22.
Ad una sospensione, sotto agitazione, del composto 19 o 20 (0.35 mmoli) in 10 ml di NaHCO3 al 6% vengono aggiunti 10 ml di CH2Cl2. Dopo circa 20 minuti di vigorosa
agitazione, viene aggiunto goccia a goccia il tiofosgene (0.028 ml, 0.35mmoli), in bagno di ghiaccio. La reazione viene lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 24 h (analisi TLC). Successivamente viene effettuata un’estrazione con CH2Cl2 e la fase organica viene
66 I composti 21 e 22 vengono infine purificati tramite cromatografia flash (Miscela eluente: Acetato di etile/Esano 4:6).
5-[Isotiocianato-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Leucina-(L)-Fenilalanina estere etilico
21. Resa 52%; p.f. = 92-95°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.84 (dd, 6H,
2CH3, J = 6.4 Hz; J = 9,24 Hz); 1.07 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz ); 1.24-1.33 (m, 1H, CH);
1.36-1.51 (m, 2H, CH2); 2.97-3.01 (m, 2H, CH2); 3.99 (q, 2H, CH2, J = 7.2 Hz); 4.17-4.23
(m, 1H, CH); 4.51 (q, 1H, CH; J = 6.8 Hz); 7.21 -7.24 (m, 5H, Ar-H); 7.34 (dd, 1H, Ar-H,
J = 2.0 Hz, J = 8.4 Hz); 7.43 -7.46 (m, 3H, Ar-H); 7.54 (d, 1H, Ar-H, J = 8.4 Hz); 7.60-7.62 (m, 2H, Ar-H); 7.95 (d, 1H, Ar-H, J = 2.0 Hz); 8.43 (d exch D2O, 1H, NHCO, J = 7.2
Hz); 8.68 (d exch D2O, 1H, NHCO, J = 8.4 Hz); 12.67 (bs exch D2O, 1H, NH);
5-[Isotiocianato-2-(fenilindolo-3-il)gliossil]-(L)-Fenilalanina-(L)-Leucina estere etilico
22. Resa: 50%; p.f. = 121-125°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 0.86 (t, 6H,
2CH3, J = 6.8 Hz); 1.06 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz); 1.42-1.56 (m, 3H, CH2CH); 2.96 (d, 2H,
CH2, J = 6.8 Hz); 3.97 (q, 2H, CH2, J = 7.0 Hz); 4.35-4.39 (m, 1H, CH); 4.49-4.52 (m,
1H, CH); 6.94 7.12 (m, 5H, ArH); 7.21 (dd, 1H, ArH, J = 2.0 Hz, J = 8.2 Hz); 7.38 -7.42 (m, 3H, Ar-H); 7.51 (d, 1H, Ar-H, J = 8.2 Hz); 7.52-7.54 (m, 2H, Ar-H); 7.81 (d, 1H, Ar-H, J = 2.2 Hz); 7.70 (d exch. D2O, 1H, NH, NHCO, J = 8 Hz); 7.98 (d exch. D2O, 1H,
