UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN

BIOSICUREZZA E QUALITÀ DEGLI ALIMENTI

STUDIO

IN

VITRO

DELL’ATTIVITÀ

METABOLICA

DEL

MICROBIOTA

INTESTINALE

UMANO

IN

SEGUITO

A

CONSUMO

DI

COLINA

Laureanda: FERRETTI CINZIA

Primo relatore: Correlatore:

Dott.ssa MONICA AGNOLUCCI Prof. DOMENICO CERRI

Secondo relatore:

Dott. KIERAN TUOHY

Tutor:

Dott.ssa LORENZA CONTERNO

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Dedico questo lavoro

alle colonne portanti della mia vita

che mi hanno sostenuto sempre fino in fondo

… mamma e papà

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INDICE

RIASSUNTO 5

1. INTRODUZIONE 7

1.1 Il microbiota intestinale 7

1.1.1 Composizione del microbiota intestinale 7

1.1.2 Principali funzioni del microbiota intestinale 11

1.1.2.1 Il microbiota intestinale come organo metabolico 12 1.1.2.2 Il microbiota intestinale come organo immunitario 17

1.2 Interazione dieta - microbiota - ospite 19

1.2.1 Modulazione del microbiota intestinale: prebiotici e probiotici 19 1.2.2 Metabolismo microbico della fosfatidilcolina e rischio cardiovascolare 21

1.3 Studio della composizione del microbiota intestinale 23

1.3.1 Tecniche coltura-dipendenti 23

1.3.2 Tecniche coltura-indipendenti 24

1.4 Modelli in vitro per lo studio del microbiota intestinale 26

1.4.1 Fermentazioni coloniche in colture tipo batch 27

1.4.2 Colture continue 28

1.4.3 Analisi delle fermentazioni del microbiota intestinale 29

1.5 Scopo della tesi 30

2. MATERIALI E METODI 32

2.1 Substrati 32

2.2 Digestione gastro-intestinale in vitro di filetto di manzo 33 2.3 Colture fecali in batch a pH controllato in anaerobiosi 34 2.4 Analisi coltura-indipendente del microbiota intestinale mediante ibridazione

fluo-rescente in situ (FISH) e conta diretta al microscopio a fluorescenza 35 2.4.1 Determinazione dell’incorporazione del deuterio tramite Raman-FISH 38 2.5 Determinazione del consumo di colina libera mediante saggio enzimatico –

spettrofotometrico di ossidazione della colina 38

2.6 Determinazione della produzione di trimetilammina (TMA) mediante GC-MS 39 2.7 Analisi statistica dei dati e delle componenti principali (PCA) 41

4

3. RISULTATI E DISCUSSIONE 43

3.1 Verifica dell’applicabilità del metodo analitico per la quantificazione della colina, e del metodo strumentale GC-MS per la quantificazione della TMA 44

3.1.1 Metodo di determinazione della colina 44

3.1.2 Metodo di determinazione della TMA 46

3.2 Risposta del microbiota intestinale a tre diverse concentrazioni di colina 48 3.3 Evoluzione del microbiota intestinale in presenza di colina e di un digerito di carne 56 3.4 Metabolismo della colina e fermentazione in vitro con due volumi diversi di

fermen-tazione 68

3.4.1 Analisi dell’incorporazione del deuterio nelle cellule batteriche 71

4. CONCLUSIONI 73

RIFERIMENTI 74

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RIASSUNTO

Il corpo umano ospita una grande varietà e quantità di microrganismi che costituiscono il microbio-ta intestinale. Esso svolge impormicrobio-tanti funzioni: fornisce nutrienti all’ospite, aiumicrobio-ta nella digestione di componenti complessi contenuti nei cibi, costituisce una barriera contro l’invasione di microrgani-smi patogeni e contribuisce al mantenimento dell’omeostasi immunitaria. In molti studi, è stato di-mostrato come i composti ingeriti con la dieta possano andare a modificare la composizione e l’attività del microbiota intestinale e quindi lo stato di salute dell’ospite. Ne sono un esempio la car-ne e la lecitina da cui vengono rilasciate piccole molecole quali la carnitina e la colina metabolizza-te da parmetabolizza-te del microbiota inmetabolizza-testinale, con produzione di trimetilammina (TMA). Questa piccola mo-lecola viene ossidata a livello del fegato a TMA-N-ossido (TMAO), correlata a patologie coronache ed alla genesi di eventi cardiovascolari avversi. Secondo l’OMS, le malattie cardiovascolari ri-mangono tuttora la principale causa di morte nel mondo, e in particolare nei paesi sviluppati.

In questo lavoro sperimentale si è voluto studiare, utilizzando un modello in vitro di fermentazione intestinale, il comportamento di alcune specie batteriche del microbiota in relazione al metabolismo della colina. Per raggiungere tale obiettivo, le popolazioni microbiche contenute in feci umane sono state messe in coltura tipo batch con controllo di pH, in anaerobiosi stretta ed a temperatura control-lata, in presenza di colina o di un digerito di carne, confrontati con l’effetto prebiotico dell’inulina. Alcune colture inoltre sono state allestite in presenza di acqua deuterata. Sono stati valutati il cam-biamento della popolazione microbica, il consumo di colina e la produzione di TMA, oltre a misu-rare l’incorporazione del deuterio da parte dei microorganismi. Per misumisu-rare le modifiche di diverse popolazioni batteriche è stata utilizzata l’ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) di speci-fiche sequenze dell’rRNA 16S. Per determinare l’attività metabolica in relazione alla colina e alla TMA sono stati messi a punto, rispettivamente, un saggio enzimatico spettrofotometrico e l’analisi gas-cromatografica accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS). Sono state quantificate le con-centrazioni della TMA prodotta durante le 24 ore di fermentazione, ed il consumo di colina libera. Si è potuto così correlare il consumo di colina con la produzione di TMA.

In presenza di colina si é osservata la crescita di Desulfovibrio spp., Enterobacteriaceae, ed alcuni clostridi. In ogni modo, le diverse quantità di colina influiscono in egual misura sulla crescita della maggior parte dei gruppi batterici studiati. L’inulina ha determinato l’incremento significativo di bi-fidobatteri, Bacteroidaceae e Prevotellaceae, dei batteri del gruppo del Clostridium

coccoides-Eubacterium rectale, i lattobacilli e gli enterococchi, quando aggiunta alla colina. Inoltre, anche se

6 sembra apportare un vantaggio risultante nell’incremento di alcune popolazioni batteriche, rispetto a quanto determinato dalla sola presenza del derivato dalla carne.

Le popolazioni batteriche appartenenti ai generi Clostridium cluster I & II e Desulfovibrio, e alla famiglia delle Enterobacteriaceae, sono state correlate alla produzione di TMA.

Le fermentazioni condotte con volumi differenti hanno prodotto profili microbici paragonabili per abbondanza anche se non in valore assoluto e la fermentazione in presenza di acqua deuterata ha confermato di consentire di metter in evidenza cellule microbiche metabolicamente attive. Le os-servazioni di questo studio hanno consentito di formulare le ipotesi e le variabili per ulteriori appro-fondimenti in merito alla correlazione di specifici gruppi batterici del microbiota intestinale coin-volti nella produzione di TMA che prevedranno l’utilizzo di colina marcata con isotopi non radioat-tivi. Visto il coinvolgimento della TMA nella produzione di metaboliti pro-aterogenici questi ulte-riori approfondimenti risultano necessari per meglio poter modulare con la dieta l’attività del mi-crobiota intestinale nella promozione della salute umana.