MATERIALI E METODI
Sperimentazione in vitro
Animali
Per la sperimentazione sono stati utilizzati ratti albini di ceppo Wistar di sesso maschile e di peso compreso fra 250 e 300 grammi.
Gli animali sono stati stabulati in gabbie che consentono libertà di movimento, con libero accesso ad acqua e cibo ed esposti a cicli alternati di luce/buio di 12 ore.
La sperimentazione è stata condotta in conformità alla legislazione italiana 116-92 e alla normativa della Comunità Europea 86-609, concernente l’utilizzo degli animali da esperimento.
Allestimento
Gli animali vengono sacrificati mediante dislocazione cervicale e dissanguamento, previa leggera anestesia.
In seguito ad incisione, la porzione toracica dell’aorta viene rapidamente asportata ed immersa in una soluzione salina di Tyrode, adeguatamente riscaldata a 37°C, nella quale viene fatto gorgogliare
La toelettatura dell’aorta avviene per rimozione del tessuto adiposo e connettivo che riveste il vaso. Il tessuto endoteliale viene asportato tramite un delicato raschiamento meccanico della parte interna dell’organo per mezzo di un ago da siringa.
Il preparato, così ripulito, viene sezionato in anelli della lunghezza di 5mm, ciascuno dei quali è alloggiato, tramite appositi ganci metallici e sotto un precarico di 2g, in un bagno per organi isolati del volume di 20ml.
Il bagno, termostatato alla temperatura di 37°C, contiene Tyrode nel quale viene fatto gorgogliare ininterrottamente il Carbogeno.
I ganci metallici inseriti nel lume dell’aorta, dei quali uno è fissato ad un sostegno sul fondo del bagno e l’altro è collegato al braccio di leva di un trasduttore isometrico, consentono la connessione dell’organo così allestito con un amplificatore che permette la registrazione delle variazioni di tensione.
Strumentazione
Bagno per organi isolati di 20ml di volume. Trasduttore isometrico, mod. Grass FT03. Amplificatore, mod. Buxco electronics.
Soluzione salina di Tyrode
SOLUTO grammi/litro mmoli/litro
NaCl 8.00 136.7 KCl 0.22 2.95 CaCl2 2H2O 0.26 1.8 MgSO4 7H2O 0.26 1.05 NaH2PO4 H2O 0.057 0.41 NaHCO3 1.00 11.9 Glucosio 1.00 5.5
Sostanze utilizzate
• Ach (acetilcolina cloruro) (Sigma) • Cloruro di potassio (Carlo Erba) • TEA (tetraetilammonio) (Sigma) • IbTX (iberiotossina) (Sigma)
• DMSO (dimetilsolfossido) (Carlo Erba)
Sostanze in esame fornite dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa (Prof. Filippo Minutolo)
Le seguenti sostanze sono state solubilizzate in DMSO
(dimetilsolfossido) per preparare la soluzione madre alla
concentrazione 10-2M: • IG 10 • MP 9 • IG 188 • IG 167 b • MP 56 a • MP 61 b • MP 53 b • MP 32 • IG 176 • IG 181 • IG 200 • MG 21 e • IG 208 d • IG 202 b • IG 174 b • IG 173
• MG 21 c • MG 25 b • IG 203 b • IG 204 b • IG 209 • TM 33 • TM 18 • FS 95 • AT 47 • GP 375 • GP 380 • GP 405
Sostanze in esame fornite dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa (Dott.ssa Taliani)
Le seguenti sostanze sono state solubilizzate in DMSO
(dimetilsolfossido) per preparare la soluzione madre alla
concentrazione 10-2M: • VKC 9 • VKC 10 • VKC 11 • VKC 12 • VKC 14 • VKC 15 • VKC 16 • VKC 17 • VKC 18 • VKC 19 • VKC 20 • VKC 21 • VKC 22 • VKC23
Soluzioni delle sostanze utilizzate
Le sostanze in esame sono state solubilizzate in DMSO, come precedentemente descritto, per preparare la soluzione madre alla concentrazione 10-2M.
Le diluizioni successive sono state fatte utilizzando la soluzione di Tyrode.
Il KCl è stato solubilizzato in Tyrode per preparare una soluzione 2M, per ottenere una concentrazione di 25mM nel bagno.
L’Ach è stata solubilizzata in EtOH per preparare la soluzione madre
con concentrazione 10-1M, le successive diluizioni sono state
effettuate utilizzando la soluzione di Tyrode per ottenere una concentrazione di 10-5M nel bagno.
Il TEA è stato solubilizzato in Tyrode per ottenere una soluzione 1M ovvero 10mM nel bagno.
L’IbTX è stata solubilizzata in H2O per soluzioni alla concentrazione
di 2x10-5M per ottenere, nel bagno, una concentrazione di 100nM.
Protocollo sperimentale
Dopo l’allestimento nei bagni secondo le modalità precedentemente descritte, gli anelli di aorta sono stati lasciati stabilizzare per circa 60 minuti.
Quindi è stato eseguito il controllo per verificare l’effettiva assenza dell’endotelio: l’organo è stato contratto con KCl 25mM e, raggiunta la massima contrazione (plateau), è stata somministrata Ach 10-5M. L’eliminazione dell’endotelio è stata considerata efficace quando il rilasciamento indotto dall’Ach è risultato inferiore al 10% rispetto alla contrazione ottenuta con KCl.
I preparati in cui il rilasciamento è risultato maggiore sono stati scartati.
Le curve sono state ottenute somministrando le soluzioni dei potenziali BK-openers ai preparati precontratti con KCl 25mM
partendo da una concentrazione di 10-8M, in concentrazioni crescenti,
in modo che ciascuna fosse 3 volte superiore alla precedente. La
massima concentrazione somministrata è stata di 3x10-5M per
escludere la componente vasorilasciante del DMSO.
Curve cumulative concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers testati su preparati precontratti con KCl 25mM: i
preparati sono stati contratti con KCl 25mM, dopo il raggiungimento del plateau sono state costruite le curve concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers a partire da una concentrazione di 10-8M.
Curve cumulative concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers testati su preparati precontratti con KCl 25mM in presenza di TEA 10mM: i preparati sono stati contratti con KCl
25mM e, al raggiungimento del plateau, è stato somministrato TEA 10mM. Dopo il raggiungimento del plateau sono state costruite le curve concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers a partire da una concentrazione di 10-8M.
Curve cumulative concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers testati su preparati precontratti con KCl 25mM in presenza di IbTX 100nM: i preparati sono stati contratti con KCl
25mM e, al raggiungimento del plateau, è stata somministrata IbTX 100nM.
Dopo il raggiungimento del plateau sono state costruite le curve concentrazione-effetto dei potenziali BK-openers a partire da una concentrazione di 10-8M.
Analisi dei dati (concentrazione-risposta)
Le risposte vasorilascianti sono state espresse in termini di efficacia e di potenza.
L’efficacia viene valutata in base all’effetto raggiunto dalla dose massima utilizzata (3x10-5M, dose limite), espressa come % della precontrazione. I composti che hanno mostrato un’efficacia < 20% sono stati considerati privi di significativa attività vasorilasciante.
La potenza viene espressa come pIC50 corrispondente logaritmo
negativo della concentrazione di agente rilasciante necessaria ad inibire il 50% della massima contrazione ottenuta con KCl 25mM. Il valore di pIC50, riportato come media + l’errore standard per n
misurazioni, è stato calcolato solo per i composti che hanno mostrato un valore di efficacia ≥ 50%.
I valori riguardanti l’efficacia e la potenza dei potenziali BK-openers studiati sono stati ottenuti con analisi computerizzata mediante il programma Graph Pad Prism versione 4.
Nel confronto delle curve concentrazione-risposta eventuali differenze statisticamente significative sono state valutate mediante test statistici, in particolare sono stati utilizzati il metodo Analysis of Variance (ANOVA) ed il test t di Student. Un livello di probabilità di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Colture cellulari
Sono state usate cellule di muscolatura liscia vascolare di aorta umana (HASMC). Queste cellule sono state coltivate in Medium 231 (Cascade Biologics) addizionato con un fattore di crescita per le cellule muscolari lisce, SMGS (Cascade Biologics). Raggiunta la confluenza le cellule sono state piastrate in una piastra nera necessaria per le letture spettrofotometriche in fluorescenza precedentemente trattata con Gelatina all’1% per favorire l’adesione cellulare; 24 ore dopo la piastratura le cellule sono state incubate con una sonda fluorescente il bis(1,3-acido dibarbiturico)-trimetin oxanolo (DiBAC4(3)) in grado di distribuirsi differentemente ai due lati della
membrana. Tale sonda appartiene infatti alla “famiglia” dei
Bis-oxonoli anionici i quali diffondono nelle cellule distribuendosi in
modo nernstiano secondo il gradiente elettrico transmembranale e si legano a membrane o proteine intracellulari esibendo un’incrementata fluorescenza. Un effetto depolarizzante, ad opera per esempio di un bloccante dei canali del potassio, determina un maggiore influsso della sonda anionica all’interno della cellula provocando quindi un aumento di fluorescenza. Viceversa, l’iperpolarizzazione viene registrata come una diminuzione in termini di fluorescenza. L’incubazione con il
effettuate 3 letture spettrofotometriche alla lunghezza d’onda della fluoresceina: 488nm/520nm; quindi alle cellule vengono aggiunte le sostanze da testare e le sostanze di riferimento e si continuano le letture spettrofotometriche alla medesima lunghezza d’onda per un periodo di 25 minuti.
Analisi dei dati (culture cellulari)
I diversi valori di potenziale di membrana sono stati espressi come variazione di fluorescenza relativa, calcolata con la seguente formula: Frel = (Ft-F0)/F0 dove F0 = fluorescenza basale prima dell’aggiunta del
farmaco e Ft = fluorescenza ai tempi t dopo l’aggiunta del farmaco.
Sostanza in esame fornita dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa (Prof. Oreste Livi)
