CAPITOLO 3 – MATERIALI E METODI
3.1 CAMPIONI TISSUTALI E CELLULARI UTILIZZATI
Gli animali presenti nel nostro laboratorio sono gatti specific-pathogen free (SFP) di sesso femminile acquistati presso la IFFA Credo (L’Arbresle, Francia). In osservanza delle leggi della Comunità Europea, sono stabulati
in gabbie sistemate in ambienti appositi, nutriti con cibo
microbiologicamente controllato ed osservati, settimanalmente, per condizioni fisiche e chimico-cliniche.
Per questo lavoro, il DNA provirale dell’isolato M2 di FIV è stato estratto da cellule (linfociti della milza) e tessuti (midollo osseo, timo, milza, linfonodo sottomascellare e linfonodo mesenterico) prelevati da un gatto
deceduto per complicazioni insorte in seguito ad infezione cronica da FIV
M2 ed infettato da oltre 10 anni.
3.2 QUANTIFICAZIONE DEL CARICO PROVIRALE
3.2.1 Estrazione del DNA
Il DNA genomico è stato estratto dai linfociti della milza utilizzando il QIAamp Blood kit (QIAGEN) partendo da pellet cellulare risospeso in 200 µl di PBS e secondo le indicazioni fornite dal protocollo. I tessuti sono stati invece pesati, omogeneizzati e addizionati di 1 ml di TNE (NaCl 100mM;
Tris-HCl 10mM a pH=7.5; EDTA 1mM pH=8), 10 µl di proteinasi K (200 µg/ml) e 50 µl di SDS 1% (volumi per 0.12 g di tessuto).
I campioni sono stati quindi incubati a 55°C per 2-3 h, oppure a 37°C overnight, al fine di ottenere la completa digestione delle membrane cellulari e la distribuzione delle proteine. Dopodiché, il DNA è stato purificato mediante aggiunta di un uguale volume di fenolo a pH=8 e successiva centrifugazione a 3000 rpm per 10’; la fase surnatante, addizionata di una miscela fenolo:cloroformio 1:1, è stata sottoposta ad ulteriore centrifugazione, usando i precedenti parametri; al fine di ottenere soluzioni di DNA sufficientemente pure, ancora una volta, la fase surnatante è stata addizionata di una miscela alcool isoamilico:cloroformio 1:24 e poi centrifugata utilizzando i parametri sopra detti.
A questo punto, il DNA è stato precipitato mediante aggiunta di acetato di sodio 3M a pH=5.5 ed etanolo assoluto, raffreddato a -20°C, nelle proporzioni, rispettivamente, di 0.1 e 2 volumi per 1 volume della soluzione di DNA. Dopo incubazione a -20°C overnight oppure a -80°C per 30’, il DNA estratto è stato addizionato di 500 µl di etanolo al 70%, e centrifugato a 13000 rpm per 5’ a 4°C. Infine, il pellet è stato risospeso in 200 µl di acqua sterile.
L’integrità e la quantità del DNA estratto sono state valutate, rispettivamente, mediante analisi elettroforetica su gel di agarosio all’1% e lettura spettrofotometrica UV-Vis (Beckman D.U. 640, Fullerton, CA, USA).
3.2.2 Amplificabilità e positività per FIV M2 dei DNA estratti
Con lo scopo di valutarne la competenza per l’amplificazione, i DNA estratti sono stati sottoposti ad una reazione di PCR con primer specifici per un gene cellulare felino, il tumor necrosis factor alfa (α-TNF) (Cammarota et al., 1996).
La positività per FIV M2 di ciascun campione è stata invece valutata amplificando mediante nested-PCR il gene gag del virus codificante per la proteina p25.
Il primo stadio di amplificazione è stato condotto con i primer 295 senso (S) e 296 antisenso (AS) i quali danno origine ad un frammento di 674 bp (Tab. 3.1); questi sono stati dedotti dalla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2, ceppo prototipo di sottotipo B del quale si conosce l’intera sequenza del genoma (Acc.n. M59418; Miyazawa et al., 1991).
Il saggio è stato allestito mescolando, in un volume finale di 50 µl, il tampone di reazione 10X (Tris-HCl 10mM, pH=0,9; KCl 50mM; Triton
X-100 0,1%), MgCl2 1,5mM; primer S e AS 0,4 µM, dNTPs 20 µM, 1 U di Taq
DNA polimerasi (Polymed) e 5 µl (=1 µg) di DNA. I campioni sono stati poi
denaturati a 94°C per 2’ e amplificati secondo il seguente programma: - fase di denaturazione a 94°C per 30”;
- fase di annealing a 52°C per 30”; - fase di estensione a 72°C per 50”.
Il ciclo di amplificazione è stato ripetuto 25 volte al fine di ottenere una quantità sufficiente della sequenza di interesse; infine, è stata eseguita un’ incubazione a 72°C per 5’. Il secondo stadio è stato invece allestito amplificando 3 µl del prodotto della prima reazione diluiti in 50 µl di una miscela del tutto identica a quella utilizzata nel primo stadio, ad eccezione
dei primer, che in questo caso sono 308 S e AS (Tab. 3.1), i quali amplificano un frammento di 346 bp. Il profilo di amplificazione ha seguito quello del primo stadio con la sola variazione della temperatura di annealing, portata a 46°C, e del tempo di estensione portato a 30”.
Per verificare l’assenza di contaminazioni sono stati inclusi, fin dalla prima reazione, controlli negativi nei quali sono stati aggiunti 5 µl di acqua al posto del DNA.
Il prodotto finale di PCR (346 bp) è stato poi evidenziato su gel di agarosio all’1% dopo corsa elettroforetica.
3.2.3 Valutazione del carico provirale
Il genoma provirale è stato quantificato mediante la metodica TaqMan-PCR (TM-TaqMan-PCR) ed utilizzando lo strumento ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Perkin-Elmer/Applied Biosystems).
La sequenza di DNA target amplificata è stata la regione p25 presente all’interno del gene gag utilizzando primer e probe indicati in tab. 3.2. Per quantificare il DNA provirale è stata costruita una curva standard di
riferimento utilizzando diluizioni seriali (102-107) del plasmide pGem-M2
(Promega) nel quale è stata clonata la porzione p25 di FIV M2 gag come descritto in un precedente lavoro (Cammarota et al., 1996).
Il saggio è stato allestito mescolando la Universal MasterMix 2X (Perkin- Elmer/Applied Biosystem), i due primer, M2 S 0.3 µM ed M2 AS 0.9 µM, il probe M2 0.1 µM e 5 µl del DNA campione da quantificare oppure 5 µl di ognuna delle diluizioni scalari degli standard.
La reazione è stata fatta avvenire in un volume di 25 µl e prevede due denaturazioni successive: una prima fase di denaturazione a 50°C per 2’,
temperatura alla quale è attiva la UNG ma non la Taq DNA polimerasi Gold; una seconda denaturazione a 95°C per 10’; a questa temperatura la UNG è inattivata, mentre viene attivata la DNA polimerasi. Dopodiché, inizia la reazione di amplificazione vera e propria che prevede 50 cicli a 95°C per 15’’ e 60°C per 1’.
Per assicurare una più corretta quantificazione, standard e campioni sono stati analizzati in triplicato e nella stessa seduta di amplificazione.
Quando le stesse diluizioni seriali (102-107) di pGem-M2 sono state
aggiunte ad 1 µg di DNA genomico estratto da cellule non infette e, successivamente, amplificate, il saggio ha potuto rilevare fino a 10 copie/µg di DNA genomico, valore a cui ci riferiamo come limite di sensibilità della metodica.
3.3 AMPLIFICAZIONE DEL GENOMA PROVIRALE DI FIV M2
3.3.1 Suddivisione del DNA provirale in frammenti parzialmente
sovrapposti
Al fine di amplificare l’intero genoma di FIV M2, lungo più di 9 Kb, sono stati disegnati opportuni primer con i quali ottenere 5 frammenti parzialmente sovrapposti del DNA provirale (Fig. 3.1):
- LTR5’: inizia dal primo nucleotide del genoma e termina all’interno di gag in posizione 1955 (le posizioni si riferiscono alla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2 di FIV);
- gag-pol: comprende tutto gag e parte di pol (1090-4261);
- pol-env: inizia dalla seconda metà di pol e termina nella regione leader di env (3991-6567);
- env: include tutto env (6197-8842 bp);
- LTR3’: è compresa tra le posizioni 8056 e 9471.
Tutti i primer utilizzati sono stati dedotti dalla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2 e poi controllati per la formazione di dimeri, eterodimeri e harpin intra- ed inter-primer con il programma OLIGO (versione 5.0).
3.3.2 Amplificazione dei frammenti gag-pol, pol-env ed env
Per aumentare la specificità e la sensibilità della reazione di amplificazione, ciascuno dei tre frammenti è stato amplificato mediante nested-PCR usando i primer indicati in tab. 3.3. Tutte le reazioni di amplificazione sono state allestite come descritto in § 3.2.2 ma utilizzando la DNA polimerasi proof-reading PfuUltra (Stratagene) al fine di evitare l’inserimento di mutazioni durante il processo di PCR.
I profili di amplificazione dei frammenti gag-pol, pol-env ed env utilizzati nelle reazioni di nested-PCR (stadi I e II) sono mostrati in tab. 3.4.
Per verificare l’assenza di contaminazioni, sono stati inclusi, fin dal primo stadio, controlli negativi costituiti da acqua al posto del DNA.
Ciascun frammento è stato amplificato un minimo di due volte in reazioni separate con lo scopo di verificare l’eventuale inserimento di mutazioni, come descritto in § 3.3.5.
I prodotti finali di amplificazione sono stati poi controllati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
3.3.3 Amplificazione delle LTR
Date le difficoltà incontrate per amplificare i frammenti gag-pol, pol-env ed env da tutti i campioni di partenza, come discusso in § 4.3.1, per amplificare le LTR, oltre a questi tessuti linfoidi dell’animale, sono state utilizzate anche cellule della linea linfoblastoide T felina MBM infettate con l’isolato M2 di FIV.
Per l’analisi quantitativa, 5x106 cellule MBM sono state prelevate dalla
coltura, pellettate e quindi risospese in 200 µl di PBS. L’estrazione del DNA genomico e la quantificazione del DNA provirale sono state effettuate come descritto in precedenza (§ 3.2).
Per amplificare le LTR sono state utilizzate due diverse metodiche, la Vectorette-PCR e la Nested-PCR.
Nel primo caso, il DNA cellulare è stato parzialmente digerito con l’enzima Sau3AI (MBI Fermentas) e le double vectorettes Vect34 e Vect22 (Tab. 3.5) sono state utilizzate per costruire la library vectorette secondo il protocollo descritto in precedenti studi (Arnold and Hodgson, 1991; Ko et al., 2003; Riley et al., 1990). Al fine di rilevare la LTR5’ e la LTR3’, i frammenti di DNA genomico così ottenuti sono stati amplificati,
rispettivamente, con i primer vectorette primer (VP)
(5’-GACGAATTCAACTAGTACTCGAGAGC-3’)/LTR5-VP AS (2020-1998,
posizione su FIV TM2) e VP/LTR3-VP S (7951-7971).
L’amplificazione, dopo denaturazione a 94°C per 2’, ha previsto 35 cicli costituiti da una fase di 30” a 94°C, una seconda fase di 30” a 60°C e una terza fase di 3’ a 72°C. A questi cicli è seguita un’incubazione a 72°C per 15’.
Gli amplificati ottenuti sono stati poi evidenziati su gel di agarosio all’1% dopo corsa elettroforetica.
Alternativamente, mediante il programma CLUSTAL X (versione 1.8) è stato effettuato un allineamento di tutte le sequenze nucleotidiche LTR di ceppi FIV di sottotipo A, B e C disponibili in banca dati.
Sulla base del fatto che LTR di ceppi FIV di uno stesso sottotipo sono altamente conservate, i primer necessari per l’amplificazione sono stati dedotti dalla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2 (Tab. 3.6).
Come i frammenti gag-pol, pol-env ed env, anche le LTR sono state amplificate mediante nested-PCR utilizzando la DNA polimerasi proof-reading PfuUltra (Stratagene) almeno due volte in reazioni separate.
I profili di amplificazione usati nei due stadi della nested-PCR sono indicati in tab. 3.7.
I prodotti finali di amplificazione sono stati poi controllati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
3.3.4 Digestione enzimatica degli amplificati LTR, gag-pol,
pol-env ed pol-env
Al fine di verificare, prima del clonaggio, che gli amplificati ottenuti fossero realmente il ceppo FIV M2 e non altri ceppi FIV quali Petaluma (ceppo prototipo di sottotipo A ampiamente utilizzato nel laboratorio da cui potrebbe derivare una contaminazione) o frammenti di genoma cellulare, è stata effettuata una digestione degli amplificati con specifici enzimi di restrizione; questi sono stati scelti in riferimento alle mappe degli isolati TM2 e Petaluma in modo da ottenere due distinti pattern di restrizione (Tab. 3.8).
I prodotti ottenuti dalle digestioni sono stati controllati mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
3.3.5 Sequenziamento degli amplificati LTR, gag-pol, pol-env ed
env
Come detto in precedenza, per testare l’eventuale inserimento di mutazioni durante il processo di PCR, i frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR sono stati amplificati un minimo di due volte in reazioni separate; dopodiché, tutti gli amplificati ottenuti sono stati interamente sequenziati usando primer dedotti dalla sequenza nucleotitdica del ceppo TM2 e poi controllati per dimeri e hairpin (Tab. 3.9 e 3.10).
Mediante programma CLUSTAL X (versione 1.8) le relative sequenze nucleotidiche sono state poi allineate e comparate e, se discordanti, l’intero processo di amplificazione e sequenziamento è stato ripetuto una terza volta.
Inoltre, con lo scopo di verificare che gli amplificati ottenuti fossero realmente il ceppo M2 di FIV (ovvero per confermare i risultati ottenuti mediante digestione enzimatica), le sequenze nucleotidiche degli amplificati gag-pol, pol-env, env e LTR sono state allineate con i relativi frammenti degli isolati Petaluma e TM2 di FIV.
Le reazioni di sequenza sono state allestite utilizzando o primer
fluorescinati (Thermo SequenaseTM Primer Cycle Sequencing Kit,
Amersham Biosciences) o nucleotidi marcati (Thermo SequenaseTM Cy5.5
Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Amersham Biosciences) secondo le indicazioni fornite dal protocollo e successivamente analizzate con il sequenziatore automatico ALFexpress II (Amersham Pharmacia).
3.4 SUBCLONAGGIO DEGLI AMPLIFICATI GAG-POL, POL-ENV, ENV E LTR NEL VETTORE pCRII-TOPO
Una volta verificata l’attendibilità di tutti gli amplificati, questi sono stati clonati nel vettore pCRII-TOPO (Invitrogen) sfruttando l’appaiamento T-A alle estremità di vettore ed amplificato (Fig. 3.2).
La reazione di clonaggio è stata eseguita secondo le indicazioni fornite dal protocollo.
3.4.1 Propagazione dei plasmidi pCRII-TOPO
I prodotti di ciascuna ligazione sono stati usati per trasformare cellule competenti INV-αF’ (Invitrogen). Al termine, la sospensione di cellule trasformate è stata dispersa su piastre Petri contenenti LB agar (triptone 1%, estratto di lievito 0.5%, NaCl 1%, agar batteriologico 1.5%) addizionato di kanamicina (50 µg/ml) e precedentemente cosparse con X-Gal (20 µg/µl).
Dopo un’incubazione overnight a 37°C, è stato effettuato uno screening delle colonie bianche ottenute mediante PCR con i primer M13 S e AS presenti sul vettore ai due lati dell’inserto.
L’amplificazione, dopo denaturazione a 94°C per 10’, ha previsto 25 cicli costituiti da una fase di 30” a 94°C, una seconda fase di 30” a 50°C e una terza fase a 72°C per un tempo dipendente dalla lunghezza del frammento d’interesse clonato nel vettore (Tab. 3.3 e 3.6). A questi cicli è seguita un’incubazione a 72°C per 15’.
I prodotti di amplificazione sono stati evidenziati su gel di agarosio all’1% dopo corsa elettroforetica.
Dopodiché, le colonie risultate positive per amplificazione sono state inoculate in terreno LB liquido più kanamicina e lasciate crescere in agitazione a 37°C per 12-16 h. Quindi, 1.5 ml di crescita sono stati centrifugati a 12000 rpm per 5’ e dal pellet batterico è stato estratto il DNA plasmidico mediante lisi alcalina. In breve, il pellet è stato risospeso con 100 µl di Soluzione I fredda (50 mM glucosio, 25 mM TrisHCl pH=8, 10 mM EDTA pH=8) e poi addizionato di 200 µl di Soluzione II (NaOH 0.2 N, SDS 1%) e 150 µl di Soluzione III fredda (60 ml acetato di potassio 5 M, 11.5 ml acido acetico glaciale, 28.5 H2O). I campioni sono stati quindi incubati in ghiaccio per 5’, per favorire la lisi dei batteri, e poi centrifugati a 12000 rpm per 5’ a 4°C. Il DNA plasmidico è stato estratto dalla fase surnatante così ottenuta mediante aggiunta di un uguale volume di una miscela di fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1) e successiva centrifugazione a 12000 rpm per 5’ a 4°C. La fase surnatante è stata recuperata, addizionata di 0.7 volumi di isopropanolo per 1 volume di soluzione di DNA e centrifugata a 12000 rpm per 30’ a 4°C per precipitare il DNA. Il pellet è stato sottoposto ad un lavaggio con etanolo al 70% e ricentrifugato a 12000 rpm per 5’ a 4°C. Dopodichè, il DNA sotto forma di
pellet è stato risospeso in 25 µl di H2O sterile. Come ultimo passaggio, per
eliminare eventuali residui di RNA, è stata aggiunta RNasi (20 µg/ml) ed è stata effettuata un’incubazione a 37°C per 30’. La bontà e la quantità del DNA così estratto sono state valutate mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
Tutti i plasmidi estratti sono stati poi accuratamente controllati mediante digestione con l’enzima EcoRI (MBI Fermentas) che taglia sul pCRII-TOPO ai due lati dell’inserto ma non sul TM2.
Una volta sicuri del plasmide ottenuto, un’estrazione plasmidica è stata ripetuta in larga scala per assicurare una maggiore quantità di DNA da poter utilizzare nei successivi esperimenti. I plasmidi sono stati, pertanto, estratti con il Plasmid Midi Kit (Qiagen) seguendo le indicazioni del fornitore e partendo da 50 ml di crescita batterica.
Il DNA estratto è stato infine quantificato mediante lettura spettrofotometrica ed un’aliquota è stata corsa su gel di agarosio all’1% per verificarne l’integrità.
3.5 RICOSTITUZIONE DELL’INTERO GENOMA DI FIV M2 NEL VETTORE pUC19
3.5.1 Sequenziamento dei plasmidi pCRII-TOPO contenenti i frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR e costruzione delle mappe di restrizione
Tutti i cloni ottenuti (per ciascun frammento) sono stati interamente sequenziati come descritto in § 3.3.5; dopodiché, mediante programma BIOEDIT (versione 7.0.4.1), dalle sequenze nucleotidiche dei frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR sono state ricavate sia le relative sequenze aminoacidiche per individuare ulteriori codoni di stop, oltre a quelli normalmente presenti nella sequenza, sia le mappe di restrizione al fine di scegliere gli appropriati enzimi per la ligazione dei frammenti M2 (Fig. 3.3). Da sottolineare che è stato possibile individuare enzimi con siti di taglio
unici sui singoli frammenti (in particolare sulle regioni di sovrapposizione) ma non sempre sull’intero genoma di M2 condizionando l’ordine con il quale i singoli frammenti sono stati poi ligati (Tab. 3.11).
Poiché gli enzimi utilizzati per la ligazione non devono tagliare sul vettore scelto per la ricostruzione del DNA provirale di M2, dopo un’attenta analisi delle mappe di vari plasmidi, è stato selezionato il vettore pUC19 (Invitrogen).
3.5.2 Ricostruzione del DNA provirale dell’isolato M2 di FIV nel pUC19
Il DNA provirale del ceppo M2 è stato ricostruito ligando i vari frammenti in un determinato ordine come descritto in § 4.6.2.
L’inserto è stato purificato dai sali della digestione mediante estrazione da gel con il Jet quick Gel Extraction Spin Kit (Genomed), mentre il vettore è stato purificato mediante precipitazione con sodio acetato ed etanolo; in breve, il plasmide è stato addizionato di acetato di sodio 3M a pH=5.5 ed etanolo assoluto, raffreddato a –20°C, nelle proporzioni, rispettivamente, di 0.1 e 3 volumi per 1 volume di plasmide.
Dopo incubazione a –20°C overnight oppure a –80°C per 3 h, il DNA precipitato è stato centrifugato a 12000 rpm per 30’ a 4°C. Dopo aver eliminato il sovranatante, è stato effettuato un lavaggio con etanolo al 70% e successiva centrifugazione a 12000 rpm per 10’ a 4°C. Infine, il pellet formatosi è stato risospeso in 25 µl di acqua sterile.
La quantificazione dell’inserto, dopo estrazione da gel, e del vettore, dopo precipitazione, è stata effettuata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%.
Prima di clonare l’inserto nel vettore, questo è stato defosforilato aggiungendo 1U di enzima Shrimp Alkaline Phosfatase (SAP) (Promega) per ogni µg di DNA.
A questo punto, plasmide ed inserto così preparati sono stati ligati usando l’enzima T4 DNA Ligasi (MBI Fermentas) partendo da 100-200 ng di plasmide e utilizzando una quantità di inserto che può variare da un rapporto molare di 1:5 a uno di 1:30. Il tutto è stato incubato a 16°C overnight.
Per ligare i frammenti gag-pol e pol-env subclonati nel pCRII-TOPO, questi sono stati amplificati, rispettivamente, con i primer M21 S/GAG II AS e fPol-ORFA II S e AS (Tab. 3.3) usando i profili di PCR descritti in precedenza (Tab. 3.4, step II della nested-PCR) con la sola variazione dei cicli di amplificazione portati a 10.
Gli amplificati delle due PCR sono stati poi estratti da gel, mescolati e sottoposti ad una seconda amplificazione con i primer M21 S e fPol-ORFA II AS al fine di ottenere un unico amplificato gag-pol + pol-env.
L’amplificazione, dopo denaturazione a 94°C per 2’, ha previsto 15 cicli costituiti da una fase di 30’’ a 94°C, una seconda fase di 30” a 50°C e una terza fase di 6’ a 72°C. A questi cicli è seguita un’incubazione a 72°C per 20’.
Il prodotto della PCR è stato evidenziato su gel di agarosio all’1% dopo corsa elettroforetica e controllato mediante sequenziamento.
3.5.3 Propagazione dei plasmidi pUC19
I prodotti di ciascuna ligazione sono stati utilizzati per trasformare cellule E.coli competenti del ceppo JM109. Dopodichè, la soluzione di cellule trasformate è stata dispersa su piastre Petri contenenti LB agar addizionato di ampicillina (50 µg/ml). Dopo un’incubazione a 37°C overnight, è stato effettuato uno screening delle colonie mediante PCR,
usando i primer M13 S e AS presenti sul pUC19 ai lati dell’inserto o i primer mostrati nelle tabelle 3.3 e 3.6; i prodotti di PCR sono stati poi controllati su gel di agarosio all’1% dopo corsa elettroforetica.
Dalle colonie risultate positive per amplificazione, è stato estratto il DNA plasmidico utilizzando la metodologia descritta in precedenza (§ 3.4.1). Tutti i plasmidi estratti sono stati poi accuratamente controllati
mediante sequenziamento con specifici primer (Tab. 3.9 e 3.10).
Una volta sicuri del plasmide ottenuto, con lo scopo di disporre di una maggiore quantità di DNA da utilizzare nei successivi esperimenti, è stata ripetuta un’estrazione plasmidica in larga scala come descritto in § 3.4.1.
3.6 VERIFICA DELLA CAPACITA’ REPLICATIVA DEI CLONI
PRODOTTI CONTENENTI IL GENOMA DI FIV M2
RICOSTITUITO
Al fine di valutare la capacità replicativa dei cloni prodotti contenenti il genoma di FIV M2 ricostituito, questi sono stati trasfettati sulla linea cellulare di fibroblasti renali felini (CrFK) ed il virus rilasciato nel surnatante di coltura è stato raccolto ed utilizzato per infettare la linea di linfoblasti T MBM.
3.6.1 Linee cellulari utilizzate nei saggi di trasfezione ed
infezione
La linea cellulare di fibroblasti renali felini Crandell (CrFK) è stata mantenuta in terreno DMEM (Dulbecco‘s Modified Eagle’s Medium, Sigma) addizionato di siero fetale bovino (FBS; Sigma) al 10% inattivato a 56°C
per 35’, L-glutammina 2mM (Seromed), penicillina 1000U/ml (Eurobio), 100 µg/ml di streptomicina (Eurobio), 1% di aminoacidi non essenziali (Sigma). Ogni 3-4 giorni le cellule sono state esaminate al microscopio
ottico e, se confluenti, lavate con PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2
g/l, Na2HPO4 (H2O)12 2,89 g/l), tripsinizzate (Tripsina/EDTA, Eurobio) e
messe di nuovo in coltura in terreno fresco in diluizioni opportune nelle fiasche o nelle piastre da trasfezione.
Le MBM sono cellule T CD3+, CD4-, CD8- (Matteucci et al. 1995); esse
non rappresentano una linea stabilizzata in quanto richiedono come fattori di crescita interleuchina-2 (IL-2) e concavalina A (ConA) e crescono in sospensione. Le cellule sono state mantenute in terreno RPMI 1640 (Sigma) addizionato di FBS al 10% inattivato al calore, L-glutammina 2 mM, 1% di aminoacidi non essenziali, 5 µg/ml di ConA, 20 U/ml di IL-2 ricombinante umana (Roche Diagnostics). Due volte la settimana, le cellule sono state contate per valutarne la vitalità, previa colorazione con Trypan Blue che viene incorporato solo dalle cellule morte, e poi di nuovo seminate in diluizioni opportune nelle fiasche o nelle piastre per l’infezione.
Tutte le colture sono state mantenute a 37°C, in atmosfera umidificata,
con il 5% di CO2.
3.6.2 Co-colture CrFK e MBM
I cloni molecolari contenenti il genoma di FIV M2 ricostituito sono stati trasfettati su CrFK secondo il metodo della precipitazione del DNA con calcio fosfato. Il giorno prima della trasfezione le cellule sono state lavate,
contate, risospese in DMEM completo al 10% di FBS e seminate in piastre da 24 (5x10^4 cellule/pozzetto).
Dopo 6-8 h dalla trasfezione il terreno è stato rimosso, le cellule sono state lavate con PBS 1X per eliminare il DNA plasmidico non incorporato e quindi incubate in 1 ml di RPMI 1640 addizionato di FBS al 10%.
A 24 h dalla trasfezione, per valutare l’efficienza di infezione del virus prodotto, il surnatante della coltura è stato raccolto e chiarificato mediante centrifugazione a 1700 rpm per 10’ per eliminare eventuali cellule in sospensione; dopodichè alle cellule trasfettate sono stati aggiunti 500 µl di surnatante chiarificato contenente il virus, RPMI 1640 completo al 10% di FBS addizionato di ConA e IL-2 e cellule MBM (2X10^5 cellule/pozzetto). Sono stati seguiti due diversi protocolli di infezione delle MBM, effettuati in parallelo, consistenti nell’utilizzo o meno di un appropriato filtro per mantenere le due popolazioni cellulari separate. Come controllo positivo nei saggi di trasfezione ed infezione è stato utilizzato il clone molecolare KKS.
La produzione virale è stata monitorata esclusivamente mediante rilascio della proteina capsidica di FIV p25 nel surnatante a diversi giorni dall’infezione.
3.6.3 Infezione delle cellule MBM con il surnatante della co-coltura
Al fine di confermare la capacità replicativa dei cloni molecolari contenenti l’intero genoma di FIV M2 ricostituito, il surnatante della co-coltura è stato raccolto, chiarificato a 1700 rpm per 10’ e poi filtrato per eliminare eventuali cellule presenti in sospensione e quindi inoculato su colture fresche di MBM. In particolare, per l’infezione sono stati utilizzati
600 µl di surnatante raccolti a 7 giorni dalla co-coltura e trasferiti su piastre da 24 contenenti 5x10^5 cellule/pozzetto.
A 5 h dall’infezione, le cellule sono state centrifugate a 1400 rpm per 5’ per eliminare il virus non adsorbito e incubate in 1 ml di terreno fresco RPMI 1640 completo al 10% di FBS addizionato di ConA e IL-2. Le colture sono state propagate per 2 settimane.
Come controllo positivo nel saggio di infezione è stato utilizzato il clone molecolare KKS.
La produzione virale è stata monitorata esclusivamente misurando il rilascio di antigene p25 nel surnatante di coltura.
3.7 SEQUENZIAMENTO DEI CLONI MOLECOLARI CONTENENTI L’INTERO GENOMA DI FIV M2 RICOSTITUITO
Tutti i cloni molecolari contenenti l’intero DNA provirale di FIV M2 risultati replicazione competenti, sono stati interamente sequenziati come descritto in precedenza (§ 3.3.5) ed utilizzando i primer indicati in tab. 3.9 e 3.10.
