Parte sperimentale

Parte

Cap. 4

PRESENTAZIONE DELLA CASISTICA CLINICA

4.1 Scopo della tesi

La valutazione clinica e morfologica della fattrice è importante, non solo per l’ottenimento di una gravidanza, ma anche per far sì che l’embrione trovi le migliori condizioni di crescita, in modo da ottenere puledri sani e vitali (Squires et al. 1999; Allen 2002). E’ comunemente accettato che la biopsia uterina sia uno strumento diagnostico efficace che ci permette di valutare lo stato di salute dell’organo e che, nel caso l’esame rilevi alterazioni uterine, le percentuali di gravidanza scendano drasticamente (Kenney e Doig 1986).

Nella clinica ginecologica della donna è ormai entrato nella routine l’utilizzo dell’ecodoppler come metodo valutativo delle potenzialità riproduttive.

Inoltre, anche in campo veterinario ci sono stati studi mostranti che, in corso di patologie uterine, la perfusione dell’organo è minore (Stolla et al. 1997; Uta Blaich et al. 1999).

Scopo del presente lavoro è quello di confrontare le normali metodiche di valutazione (come l’esame clinico o la biopsia endometriale) delle potenzialità riproduttive della cavalla con la valutazione flussimetrica dell’arteria uterina. In particolare, attraverso il confronto dei dati ottenuti, si è voluto vedere se, l’ecodoppler dell’arteria uterina, può essere considerato un valido strumento per la valutazione e successiva scelta di cavalle riceventi di embrioni nei programmi di embryo transfer.

4.2 Materiali e Metodi

Il presente studio è stato svolto presso il Dipartimento di Clinica Veterinaria dell’Università di Pisa, nel corso delle stagioni riproduttive del 2004, 2005 e 2006.

Venti cavalle, trottatrici, purosangue inglese e maremmane; nullipare o multipare, d’età compresa tra i 2 e i 17 anni, sono state esaminate per essere incluse in un programma di Embryo Transfer come riceventi di embrioni.

Le fattrici sono state sottoposte ad esame clinico generale e particolare dell’apparato riproduttore. I soggetti di età > 15 anni, con anamnesi riproduttiva d’infertilità, aborto, sono stati sottoposti ad esame bioptico endometriale, classificato secondo quanto proposto da Kenney e Doig (1986).

Gli animali risultati inadeguati secondo questi parametri sono stati rifiutati come riceventi di embrioni.

Tutte le cavalle, riceventi e scartate, sono state monitorate quotidianamente tramite palpazione transrettale ed esame ecografico durante la piena fase estrale, fino al momento dell’ovulazione (Toshiba JustVision 200, equipaggiato con una sonda semiconvex PVF-78F, a frequenza variabile, da 5 a 8 Mhz; Figura 4.1 e 4.2).

Quando le cavalle presentarono un follicolo >30 mm, utero da calore e positività allo stallone erano considerate in piena fase estrale e quindi sottoposte ad esame flussimetrico dell’arteria uterina tramite Doppler pulsato. (Toshiba Core Vision Pro, modello SSA-350A munito della sonda sopra menzionata; Figura 4.3).

Figura 4.3: ecografo Toshiba Core Vision Pro, modello SSA-350A.

Gli indici flussimetrici valutati con il sistema automatico “auto-trace” disponibile nella macchina, sono PSV, EDV e TAMV, dai quali si ricava RI (indice di resistenza) e PI (indice di pulsatilità) dell’arteria uterina e il flusso è stato campionato (a sinistra o a destra) indipendentemente dal follicolo preovulatorio. Questa scelta è stata effettuata sulla base di quanto osservato da lavori precedenti (Stolla et al., 1997; Blaich et al., 1999; Bollwein et al., 1998 e 2002), i quali non

hanno riportato differenze flussimetriche tra l’arteria uterina omolaterale al follicolo e la controlaterale.

L’identificazione dell’arteria uterina è stata effettuata come descritto da Bollwein et al. nel 1998. Si evidenzia l’aorta collocando la sonda dorso-ventralmente rispetto all’apice uterino e la si segue caudalmente. A livello della sua diramazione, proseguendo lungo il corpo dell’ileo, si evidenzia l’arteria iliaca esterna. A circa 2-6 mm dall’origine dell’iliaca esterna, con l’aiuto del color Doppler, può essere visualizzata l’arteria uterina.

Procedendo lungo il suo decorso, abbiamo cercato di avvicinarci il più possibile all’utero, per risentire meno delle eventuali turbolenze derivanti dalla vicinanza con l’aorta. A questo punto, utilizzando una finestra esploratrice di 2 mm, abbiamo attivato il Doppler pulsato, in modo da poter campionare il flusso quando si rendeva visibile un’onda chiara e regolare (Figura 4.4).

Su cinque/20 soggetti non è stato possibile effettuare l’esame flussimetrico, in quanto difficili da contenere adeguatamente così da poter eseguire in modo corretto l’analisi dell’arteria uterina.

Analisi statistica:

Le differenze tra RI e PI sono state analizzate tra: cavalle che hanno tra i 2 e i 8 anni (n = 7) e cavalle che hanno tra i 9 e i 17 anni (n = 8); cavalle primipare (n = 8) e cavalle multipare (n = 7); cavalle con biopsia uterina di grado 1 (n = 4) e cavalle con biopsia uterina di grado 2 o superiore (n = 4); cavalle scelte come riceventi di embrioni (n = 10) e cavalle scartate come riceventi di embrioni (n = 5).

Di ogni gruppo è stata valutata la distribuzione tramite Kolmogorov-Smirnov test, le differenze tra gruppi sono state analizzate tramite Student T Test o Wilcoxon test a seconda del tipo di distribuzione delle popolazioni (normale o non).

4.3 Risultati

Delle 15 cavalle esaminate, 10 sono risultate sane sia all’esame obbiettivo generale che particolare riproduttivo (visita clinica, ecografia dell’apparato riproduttore); quattro di queste, avendo anamnesi riproduttiva muta, sono state sottoposte a biopsia endometriale, risultando di grado 1. Tutti questi soggetti sono stati inclusi nel programma di ET come riceventi.

Nove/10 hanno ricevuto effettivamente un embrione e 8/10 sono risultate gravide dopo trasferimento e hanno portato a termine la gravidanza. Tutti gli embrioni trasferiti erano stati classificati di grado 1 e di buone dimensioni come osservato da Carnevale et al. (2000). Delle 5 cavalle scartate, 4 sono state sottoposte a biopsia uterina: 2 in quanto cavalle anziane (entrambe di 17 anni) risultando di categoria 2b; 2 in quanto aventi una storia di infertilità, risultando di categoria 2a e 3. La quinta cavalla è stata scartata, risultando affetta da pneumovagina, causata da una cattiva conformazione del perineo, seguita da endometrite acuta. Una cavalla tra queste scartate ha ricevuto comunque un embrione che non ha dato luogo a gravidanza. La classificazione delle biopsie applicata è stata quella proposta da Kenney e Doig nel 1986.

Giovani vs Adulte

La media della RI delle cavalle giovani (< 9 anni) e stata 0,74±0,13, mentre la media della PI 1,74±0,58. Le cavalle sopra gli otto anni, hanno avuto una RI e PI di 0,90±0,15 e 2.55±0,84 rispettivamente. Le due popolazioni sono risultate distribuite normalmente ed in seguito al test T di Student la pulsatilità e resistenza (Grafico 4.1 e 4.2) delle

cavalle di età compresa tra i 2 e gli 8 anni è risultata significativamente inferiore rispetto ai soggetti dell’altro gruppo (P=0,052).

1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Fino_a_otto_anni Oltre_gli_otto_anni

Grafico 4.1: Box and Whisker plot della RI per gruppi di età. 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Fino_a_otto_anni Oltre_gli_otto_anni

Grafico 4.2: Box and Whisker plot della della PI per gruppi di età.

Primipare vs Multipare

Per le 8 cavalle primipare è stato ottenuto un valore di RI medio di 0,80±0,16 e una PI media di 1,87±0,56, mentre per le 7 fattrici multipare la RI media era 0,86±0,18 e la PI media 2,51±0,97 (Grafici 4.3 e 4.4). 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Multipare Primipare

Grafico 4.3: Box and Whisker plot della RI dei gruppi primipare vs mutipare.

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Nullipare Pluripare

Grafico 4.4: Box and Whisker plot della PI dei gruppi primipare vs mutipare.

Le due popolazioni sono risultate normalmente distribuite ed in seguito al test T di Student non si sono osservate differenze statisticamente significative tra i gruppi. Solo per la PI le cavalle multipare hanno mostrato una tendenza ad avere valori maggiori rispetto alle primipare (P=0,14) (Grafico 4.4).

Cavalle con biopsia normale vs Cavalle con patologie uterine

Le cavalle con biopsia di grado 2a, 2b o 3 avevano un valore medio di RI e PI di 0,98±0,03 e di 2,86±1,00 rispettivamente. Invece le cavalle con biopsia di categoria 1 avevano una RI media di 0,89±0,09 e una PI media di 1,96±0,39. 1,00 0,95 0,90 0,85 0,80 0,75 Normale Patologica

Grafico 4.5: Box and Whisker plot della RI dei gruppi biopsia normale vs patologica.

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Normale Patologica

Grafico 4.6: Box and Whisker plot della PI dei gruppi biopsia normale vs patologica.

Dato l’esiguo numero di casi, è stato necessario usare un test non parametrico (Wilcoxon test). La resistenza del flusso sanguigno delle cavalle con patologie all’utero è stata tendenzialmente maggiore della resistenza uterina delle cavalle sane (P=0,11) (Grafico 4.5).

Invece il valore di PI è risultato significativamente maggiore nelle cavalle con patologie uterine rilevate dalla biopsia (P=0,057) (Grafico 4.6).

Scelte vs Scartate

Le cavalle scelte come riceventi hanno avuto una media dei valori di RI e PI rispettivamente di 0,76±0,16 e di 1,81±0,53. Invece le cavalle scartate, avevano la RI di 0,96±0,04 e la PI di 2,88±0,87.

Anche in questo caso le differenze tra i due gruppi sono state statisticamente significative. Le cavalle scelte come riceventi di embrioni hanno minori resistenze uterine al flusso ematico in quanto è risultata minore sia la RI (P=0,017) sia la PI (P=0,01) (grafico 4.7 e 4.8). 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 Scelte Scartate

Grafico 4.7: Box and Whisker plot della RI dei gruppi scelte vs scartate.

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Scelte Scartate

Grafico 4.8: Box and Whisker plot della PI dei gruppi scelte vs scartate.

Infine, le cavalle trasferite con successo sono risultate avere una RI media di 0,80±0,17 e una PI media di 2,0±0,6. Invece le cavalle che avevano riassorbito gli embrioni sono risultate avere una RI media di 0,91±0,07 e una PI media di 2,11±0,40.

4.4 Discussione e conclusioni

Nella normale selezione delle riceventi di ET, i più importanti parametri sono l’età, lo stato riproduttivo e l’assenza di patologie uterine (Squires et al., 1999). Questo lavoro rappresenta il primo confronto tra le metodiche di selezione tradizionali e la flussimetria dell’arteria uterina. Squires e collaboratori (1999) consigliavano di utilizzare cavalle che non superassero i 10 anni di età, supponendo che le condizioni dell’apparato riproduttore fossero migliori rispetto a soggetti più anziani. Wilsher e Allen (2003) hanno successivamente dimostrato questa ipotesi; da loro studio è risultato che cavalle più anziane e che hanno partorito più volte avevano una superficie microcotiledonare minore probabilmente in virtù di processi degenerativi dell’endometrio. Differentemente, in un ampio studio clinico, Carnevale et al. (2000) hanno dimostrato come l’età non sia significativamente discriminante nei tassi di gravidanza dopo trasferimento. Dal confronto tra PI e RI dell’arteria uterina di cavalle giovani e cavalle adulte è emersa una differenza significativa tra le resistenze (P=0,052); le cavalle giovani sono risultate avere una miglior perfusione ematica, in linea con quanto notato da altri autori (Bollwein et al., 1998) che confrontarono 4 cavalle giovani (di età compresa tra 6 e 10 anni) con 2 cavalle anziane (di 12 e 13 anni).

Sempre Wilsher e Allen (2003) trovarono che le cavalle primipare mostravano una densità della superficie microcotiledonare inferiore, nonostante le condizioni “virginali” dell’endometrio, rispetto alle multipare. Nel loro studio ottennero aumenti significativi sia nella densità della superficie microcotiledonare sia nel peso dei puledri alla nascita, al secondo parto rispetto al primo.

Nel presente studio, il confronto delle cavalle primipare con le multipare, non ha evidenziato alcuna differenza significativa dei valori flussimetrici (PI e RI) dell’arteria uterina. Questo è in disaccordo con quanto visto da Bollwein et al. nel 1998. Il motivo di questa differenza può essere ricercata nella composizione stessa dei gruppi. Infatti nello studio del 1998 il gruppo delle nullipare era costituito da cavalle di età ≤ 10 anni e il gruppo delle multipare cavalle di età > 11 anni. Invece i nostri gruppi erano più eterogenei (Tabella 4.1).

P/M Cavalla Età (anni) Media RI Media PI

V1 9 Z1 8 U1 6 C2 5 P1 2 A2 3 Z2 9

P

M

Tabella 4.1: Suddivisione delle cavalle in primipare (=P) e multipare (=M).

Nel gruppo delle multipare erano presenti due cavalle di giovane età ed in ottime condizioni fisiche, mentre nel gruppo delle primipare erano presenti tre cavalle che precedentemente erano state inserite nel gruppo delle cavalle giovani, inoltre la cavalla E1 presentava uno score uterino patologico. Solo la PI è risultata essere tendenzialmente differente nei due gruppi (P=0,14).

Altro parametro importante per la selezione delle cavalle riceventi è lo stato di salute dell’endometrio, la biopsia uterina è un valido e sicuro

strumento diagnostico per determinarlo (Van Camp, 1988; Doig et al., 1993). Ci permette inoltre di valutare lo stato ghiandolare uterino e varie alterazioni come la fibrosi, l’infiammazione e la linfangiectasia (LeBlanc et al., 2005). Inoltre il grado di fibrosi dell’endometrio è direttamente correlato con le percentuali di gravidanza (Kenney e Doig, 1986).

Dal presente studio, in accordo con precedenti lavori (Stolla et al., 1997; Uta Blaich et al., 1999), è emerso che le cavalle con patologie uterine verificabili tramite la biopsia, hanno una maggiore resistenza d’organo al flusso ematico. Però, mentre per la PI la differenza tra i due gruppi è più marcata (P=0,057), per quanto riguarda la RI la differenza è solamente tendenziale (P=0,11). Una/4 cavalle con biopsia uterina normale ha mostrato una resistenza pari a 1. Questo, visto l’esiguo numero di soggetti esaminati (n = 4) potrebbe aver influito in modo significativo sui risultati. La così alta resistenza potrebbe essere l’effetto di un errato campionamento dell’arteria uterina o potrebbe essere dovuta al momento fisiologico in cui si trovava la fattrice stessa. Infatti è stata esaminata nella fase periovulatoria, periodo in cui fisiologicamente si hanno le maggiori resistenze uterine al flusso sanguigno (Bollwein et al., 1998; Uta Blaich et al.,1999; Bollwein et al., 2002). Confrontando le medie da noi ottenute, per le cavalle con o senza patologie uterine, con quelle ottenute da Bollwein e collaboratori nel 1997, i valori di RI sono risultati più elevati. Comunque, Bollwein et al. (1997), utilizzarono la vecchia classificazione di Kenney (1977) analizzando separatamente le cavalle con biopsia di categoria 1, 2 e 3. Inoltre hanno eseguito l’ecodoppler, in più giorni consecutivi, durante la fase luteale, mentre nel presente lavoro durante la fase estrale.

L’accettazione o meno di una cavalla come ricevente di embrioni non è comunque determinata da un solo fattore, ma dalla loro totalità (Squires, 1999; Carnevale et al., 2000; Panzani et al., 2006). Abbiamo ritenuto importante confrontare i consueti metodi di scelta delle riceventi con la flussimetria dell’arteria uterina. La selezione è stata effettuata in base ai criteri proposti da Squires et al. (1999) e Allen (2002); inoltre è stata valutata la corretta conformazione vulvare (Pascoe, 1979; Blanchard et al., 2003) e l’assenza di fluido uterino come proposto da Brinsko et al. (2003).

L’analisi statistica ha evidenziato differenze significative tra il gruppo delle cavalle scelte e il gruppo delle cavalle scartate, sia per la Resistenza che per la Pulsatilità (Tabella 4.2).

Scelte (n=10) Scartate (n=5) Test T di

Student

PI media 1.81±0,53 2,88±0.87 P=0,01

RI media 0,76±0,16 0,96±0.04 P=0,017

Tabella 4.2: Tabella riassuntiva del confronto statistico delle cavalle scelte o scartate come riceventi di embrioni.

Il fatto che 8 delle 9 cavalle valutate come buone riceventi, sia con i normali metodi di valutazione, sia tramite flussimetria dell’arteria uterina, ricevettero l’embrione e rimasero gravide, dà un’indicazione positiva sulle potenzialità di questa seconda tecnica. Purtroppo, il fatto di non aver trasferito embrioni nelle cavalle scartate, ci ha impedito di effettuare un confronto statistico che permettesse di dare indicazioni cliniche (analisi ROC).

Dalla nostra esperienza abbiamo inoltre constatato che in alcuni casi il campionamento dell’arteria uterina nella cavalla è molto difficile se non

impossibile, soprattutto se l’animale non collabora. In letteratura non sono presenti studi che associano sedazione e doppler dell’arteria uterina nella cavalla. Abbiamo escluso la sedazione perché si temevano effetti della molecola sulla circolazione uterina.

Conclusioni

La flussimetria dell’arteria uterina della cavalla è stata capace di indicare gli animali riproduttivamente sani. Come era prevedibile, l’età e uno stato di fibrosi endometriale, hanno avuto un’influenza negativa sulle resistenze d’organo, cosa che non è risultata altrettanto chiara per le cavalle multipare rispetto alle nullipare.

Per rendere maggiormente attendibile la flussimetria dell’arteria uterina, si potrebbero esaminare le cavalle tutte lo stesso giorno del ciclo estrale. Comunemente la visita delle riceventi di embrioni viene eseguita il 5° giorno del diestro (Squires et al., 1999; Pacini et al., 2003). Anche l’esame doppler potrebbe essere eseguito nello stesso momento, in quanto è stato visto in altri lavori che al quinto giorno, fisiologicamente, si hanno le minori resistenze d’organo. In questo modo, nel caso ci siano più riceventi a disposizione per il successivo trasferimento, si potrà scegliere quella più idonea, anche dal punto di vista flussimetrico.

I presenti risultati, comunque, incoraggiano l’applicazione della tecnica doppler nei centri di embryo transfer per lo screening iniziale delle potenziali riceventi di embrioni e per la loro valutazione pre-trasferimento, sebbene ulteriori studi sono comunque necessari per valutarne la sensibilità e la specificità prima di poterlo proporre.