5.1. Protocollo di invecchiamento dei fibroblasti embrionali di topo (MEF)
Provenienza: le cellule MEF wild type sono state isolate da embrioni di topo a 13,5 giorni di sviluppo. Gli embrioni sono stati frammentati e incubati con tripsina (0,25% in PBS pH=7,5M) a 37°C per 15-20minuti in agitazione. Le cellule sono state poi centrifugate per 10minuti a 290xg e il pellet è stato risospeso in mezzo di coltura DMEM-HG (Invitrogen) privo di siero completato con penicillina e streptomicina 50U/ml. Dopo un’ulteriore centrifugazione e tre lavaggi, la sospensione cellulare è stata distribuita in piastre p100 (diametro=100mm) contenenti DMEM-HG completo di antibiotici e siero (FBS Invitrogen) 10%. Una volta arrivate a confluenza, le cellule (a passaggio p1) sono state tripsinizzate e conservate in azoto liquido in fiale apposite alla densità di 1x106 cell/fiala.
Il protocollo di invecchiamento delle cellule MEF prevede di scongelare 1 o 2 milioni di cellule (a seconda delle necessità) e di coltivarle seguendo il protocollo 6T3. Questo prevede di propagare 6x105 cellule in piastre p100 e di tripsinizzarle ogni tre giorni per poi riseminarle alla stessa densità. Ad ogni tripsinizzazione le cellule acquisiscono un passaggio. Il terreno utilizzato è il DMEH-HG completo di antibiotici e FBS e le condizioni di incubazione sono a 37°C e 6% CO2. Le MEF sono state propagate fino al passaggio 6 perché il loro comportamento il coltura oltre tale passaggio non è stato ancora ben caratterizzato. Ad ogni passaggio sono state seminate:
− un numero variabile di p100 alla densità di 6x105
cellule/p100. Ciò costituisce il mantenimento. Il mantenimento deve essere tale da garantire 4x106 cellule ai passaggi 2 e 5 (o 6) se si intende fare il mirnoma
− 4x104
cellule in una piastrina p30 (diametro=30mm) per effettuare il saggio della β-galattosidasi
− 7x105
cellule in una piastra p60 (diametro=60mm) per effettuare il saggio di incorporazione della BrdU
Il numero di raddoppi cellulari è stato calcolato applicando la formula:
C.D. = ln(cellule raccolte/cellule seminate)/ln2
5.2. Saggio di incorporazione della Bromodesossiudirina (BrdU)
Questo saggio viene effettuato ad ogni passaggio su un campione di 7x105 cellule per determinare la frazione di queste che si trovano nella fase S del ciclo cellulare (replicazione del materiale genetico).
Si diluisce la soluzione madre di BrdU nel terreno di coltura della p60 in modo da raggiungere una concentrazione finale di 45µM e si fa avvenire la reazione di incorporazione per 1h a 37°C (la durata del pulse dipende dal tempo di replicazione delle cellule da trattare). Si staccano e si raccolgono le cellule, si lavano due volte in PBS- (privo di calcio e magnesio) e si fissa il pellet in metanolo freddo. Dopo la fissazione, segue un trattamento in PBS-/tween20 0,5% per rendere permeabile la membrana cellulare all’ingresso dell’HCl 3N aggiunto in seguito per 45minuti allo scopo di denaturare il DNA. Si neutralizza l’acido con tetraborato sodico (Na2B4O7) e si lava due volte con PBS-/tween20 0,5%. A questo punto si può aggiungere la soluzione di anticorpo primario anti-BrdU (Rabbit polyclonal ab38890 abcam): lo stock 1mg/ml va diluito 1:100 in PBS-/Sodium Azide 0,1%. Si incuba per 1ora a t.amb. o o.n. a +4°C in rotazione al buio. Si lava per due volte con PBS-/tween20 0,5% e si risospende il pellet nella soluzione di anticorpo secondario Anti-rabbit fluoresceinato Alexa Fluor 488 diluito 1:600 in PBS-. L’incubazione dura 40minuti a t.amb. al buio. Si lava per altre due volte con PBS-/tween20 0,5% e si trasferiscono le cellule in appositi tubi per l’analisi al citofluorimetro. Si trattano infine le cellule per 30minuti con Ioduro di Propidio 1mg/ml + RNAsi A 0,5 mg/ml al buio. Lo Ioduro di Propidio si lega al DNA in maniera stechiometrica permettendone quindi la quantizzazione. Si utilizza per individuare la frazione di cellule che si trovano nelle fasi G1e G2 del ciclo cellulare al momento del saggio.
A questo punto si possono analizzare le due fluorescenze al citofluorimetro.
5.3. Analisi al citofluorimetro (FACS)
All’interno del FACS, la soluzione cellulare marcata viene aspirata attraverso un sistema campionatore. Le cellule vengono poi trasportate una alla volta, ben separate ed allineate, attraverso fasci laser che eccitano la fluoresceina associata all’anticorpo secondario e lo Ioduro di Propidio. Le lunghezze d’onda di emissione (nel verde per la fluoresceina e nel rosso per il Propidio) vengono raccolte da due fotomoltiplicatori che convertono gli impulsi elettrici negli impulsi di fluorescenza corrispondenti secondo una scala arbitraria (http://www.geocities.com/p.cappella/FACS.htm). Dall’analisi al computer dei dati grezzi mediante il programma WinMDI 2,9 (http://facs.scripps.edu/software.html) si sono ottenuti tre tipi di grafici (Fig.5.1):
− uno scatter-plot nel quale è riportata la granulosità cellulare sull’asse delle ascisse (SSC=side scatter) in funzione della dimensione delle cellule sull’asse delle ordinate (FSC=forward scatter). Si crea un gate all’interno dello scatter-plot in modo da escludere dall’analisi successiva gli agglomerati e i detriti cellulari
− un istogramma nel quale è riportata la fluorescenza dello Ioduro di Propidio (FL3) in ascisse in funzione del numero di eventi. I due picchi corrispondono alla frazione di cellule presenti in
fase G1 e G2 al momento del saggio e sono stati fatti corrispondere alle misure arbitrarie di fluorescenza 200 e 400. Tra i due picchi abbiamo la frazione di cellule in fase S
− un dot-plot o grafico del ciclo cellulare. Esso riporta in ascisse la fluorescenza dello Ioduro di Propidio (FL3) e in ordinata la fluorescenza della fluoresceina. In altre parole, riporta la quantità di DNA in funzione della BrdU incorporata. Mediante tre gates si circoscrivono le sottopopolazioni in fase G1, S e G2 e, dall’analisi statistica dei valori corrispondenti, si ricavano le percentuali del numero di cellule presenti in ogni fase del ciclo al momento del saggio.
5.4. Trasfezioni
Il protocollo di trasfezione è stato applicato a cellule MEF al passaggio 2. Le cellule sono state seminate alla densità di 1,5x105 in piastrine p30. Dopo 24h, sono state trasfettate in adesione con il trasfettante Gene Silencer (Genlantis, Gene Therapy Systems) come da protocollo della ditta produttrice. La quantità di microRNA maturo trasfettata è 80nM. Il controllo è costituito da cellule MEF trasfettate con miRNA-GFP. La reazione si fa avvenire in terreno Optimem (Invitrogen) in quanto questo non contiene il siero che interferisce con l’efficienza della reazione. Dopo 6h è necessario sostituire il terreno con DMEM-HG completo per garantire la vitalità cellulare. Questo protocollo garantisce un’efficienza di trasfezione maggiore del 90%.
A 48h o 96h dalla trasfezione, a seconda degli esperimenti in programma, si può procedere in più modi:
Fig.5.1. Grafici derivanti dall’analisi al FACS. In alto a sinistra: scatter-plot. R1
comprende le cellule che partecipano all’analisi. In alto a destra: dot-plot. R2, R3 e R4 sono i gates che comprendono le cellule in fase G1, G2 e S. In basso a sinistra: istogramma.
− raccogliere le cellule in pellets da 5x105
da cui estrarre poi l’RNA per qPCR. I pellets si conservano a –80°C
− tripsinizzarle e contarle per valutare gli effetti sulla proliferazione
− tripsinizzarle e riseminarle in piastrine p30 alla densità richiesta per il saggio della β-galattosidasi
5.5. Saggio della ββββ-galattosidasi
È un saggio istochimico a pH=6M che si effettua per individuare specificamente le cellule senescenti che sono le uniche ad esprimere l’enzima β-galattosidasi. Si somministra alle cellule un analogo del galattosio, la X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) il quale, in seguito a reazione enzimatica, colorerà le cellule di blu (Fig.5.2).
Si seminano le cellule in piastrine p30 alla densità di 4x104 cell/p30. Dopo 24h, si aspira il mezzo, si lava due volte con PBS e si aggiungono 1,5ml/p30 di soluzione di fissaggio: glutaraldeide 0,2% (stock 25%), formaldeide 2% (stock 37%), PBS a volume. Si lascia agire per 7minuti e, dopo tre lavaggi, si aggiungono 1,5ml/p30 di soluzione di colorazione: sodio citrato a ph=6M, ferrocianide 100X (stock 500mM), ferricianide 100X (stock 500mM), X-gal 20X (stock20mg/ml). La composizione del sodio citrato è: acido citrico 0,4M, sodio fosfato 0,4M, NaCl 1,5M, MgCl2 20mM (stock 1M), PBS a volume. Si parafilmano le piastrine e si incubano a 37°C in assenza di CO2 che, altrimenti, modificherebbe il pH interferendo con la reazione. Dopo al massimo 48h si può procedere al conteggio delle cellule colorate. Dopo un lavaggio, si sostituisce la soluzione di colorazione con PBS. Per conservare le piastrine, invece, si sostituisce il PBS con glicerolo 70% e si mettono a +4°C.
Il conteggio si effettua al microscopio ottico normale. Si contano, per ogni piastrina, le cellule colorate di blu presenti in ciascun campo per 24 campi (sufficienti a ricoprire la maggiorparte della
Fig.5.2. Saggio della ββββ-galattosidasi su cellule MEF senescenti. È evidente la
colorazione blu del citoplasma dovuta alla formazione del precipitato.
piastrina). Successivamente si fa la media dei 24 valori ottenuti. Il risultato si può lasciare come tale o convertirlo in percentuale.
5.6. Estrazione dell’RNA totale
Per la quantizzazione dei trascritti di p19ARF, p21 e PAI-1 è stato utilizzato il kit a colonnine RNeasy Extraction Kit (Qiagen) secondo le indicazioni della ditta produttrice. Esso, infatti, permette di estrarre solo i messaggeri di geni codificanti per proteine; è contro-indicato per l’estrazione dei microRNA. Per utilizzare questo kit sono sufficienti pellets da 5x105 cellule.
Per la quantizzazione dei microRNA è stato utilizzato il reagente TRIZOL (Invitrogen) in quanto permette di estrarre l’RNA totale preservando la frazione dei piccoli RNA.
Aiutandosi con una siringa da insulina, si omogenizza un pellet da minimo 2x106 cellule risospendendolo in 1ml di TRIZOL (una soluzione di fenolo e guanidina isotiocianato, entrambi agenti denaturanti delle proteine). Dopo incubazione di 5minuti per permettere la dissociazione dei
complessi riboproteici, si aggiungono 200µl di cloroformio:alcol isoamilico = 24:1, dopodichè si agitano vigorosamente le eppendorf per 15secondi e in seguito si incubano a t. amb. per 3minuti. La successiva centrifugazione (1200 rcf a 4°C) ha permesso la separazione tra la fase inferiore fenolo-cloroformica di colore rosa, il pellet centrale contenente proteine e la fase superiore acquosa. L’RNA contenuto in questa fase è stato trasferito in un nuovo tubo e fatto precipitare mescolandovi alcol isopropilico. Dopo una centrifugata a 4°C per 10minuti, il pellet è stato lavato, senza dissolverlo, con etanolo 75%, e una volta essiccato, è stato risospeso in 20µl di acqua RNAsi free (trattata con DEPC, dietilpirocarbonato).
Dopo l’estrazione, la quantificazione dell’RNA estratto è avvenuta dapprima leggendo l’assorbanza a 260nm di una diluizione 1:500 e poi facendone correre 1µg su gel di agarosio all’1,5%. Con la lettura dell’assorbanza si deriva la concentrazione (una unità di assorbanza corrisponde a 40µg/ml di RNA); inoltre il valore del rapporto A260/A280, che deve essere compreso tra 1,8 e 2, indica se c’è contaminazione da proteine. La corsa, oltre ad essere un controllo della concentrazione misurata
dallo spettrofotometro, verifica la qualità dell’RNA: se non è degradato si vedono due bande, una corrispondente all’RNA 28S, l’altra corrispondente al 18S (Fig.5.3).
5.7. Trattamento con DNAsi (Invitrogen)
Questo trattamento è necessario per purificare l’RNA estratto da eventuali e frequenti contaminazioni da DNA genomico. La presenza di quest’ultimo è da scongiurare se si vuole retrotrascrivere l’RNA per poi amplificarlo mediante PCR quantitativa.
Il mix di reazione è composto da: 1µg di RNA, 1µl di DNAsi I reaction buffer (o 2µl del buffer 5X del miScript Reverse Transcription Kit della Quiagen se si intende retrotrascrivere i microRNA), 1µl di DNAsi I Amp Grade 1U/µl, H20 RNAsi-free fino a 10µl. La reazione dura 15minuti a t.amb. dopodiché si inattiva l’enzima aggiungendo 1µl di EDTA 25mM. Si scalda il tutto per 10minuti a 65°C dopodiché il campione è pronto per essere retrotrascritto.
Dopo il trattamento con DNAsi si effettua una PCR di controllo per verificare la purezza del campione e si fanno correre gli amplificati su gel di agarosio al 2% (Fig.5.4). Il marcatore di peso molecolare è il 100bp.
5.8. Retrotrascrizione a cDNA
Per retrotrascrivere i trascritti codificanti per le proteine (p19ARF, p21 e PAI-1) si segue il seguente protocollo (reagenti della Invitrogen): a 1µl di RNA trattato con DNAsi si aggiungono 1µl di random primers e 1µl di dNTPs. Si incuba a 65°C per 5minuti, si raffredda subito in ghiaccio e si centrifuga per qualche secondo. Si aggiungono al mix di reazione: 4µl di 5X first strand buffer, 2µl di DTT, 1µl di RNAsi OUT. Segue una fase di pre-incubazione a 25°C per 2minuti nel termociclizzatore dopodiché si aggiunge 1µl di trascrittasi inversa SuperScriptII. Infine, nel termociclizzatore, si esegue un ciclo a tre step: 25°C per 4minuti per consentire l’annealing dei
Fig.5.3. Corsa elettroforetica di controllo dell’RNA estratto. La presenza delle due
bande corrispondenti agli RNA ribosomali 18S e 28S indica che l’RNA estratto non si è degradato.
Fig.5.4. Corsa elettroforetica di controllo del trattamento con DNAsi. Prima
lane:100bp; seconda lane: controllo negativo (H2O); ultima lane: controllo
random primers, 42°C per 50minuti per far avvenire la retrotrascrizione, 70°C per 15minuti necessari per bloccare la reazione.
Per retrotrascrivere i microRNA si utilizza un kit apposito, il miScript Reverse Transcription Kit (Quiagen), seguendo le indicazioni della ditta produttrice. Questo kit permette di aggiungere una coda di poli-A ai microRNA che ne sono naturalmente sprovvisti. La poliadenilazione avviene ad opera di una poli(A) polimerasi. Una trascrittasi inversa, poi, converte tutti gli RNA del campione, inclusi i microRNA, in cDNA usando una sequenza oligo-dT e random primers. Nella PCR quantitativa, i microRNA potranno essere amplificati usando un primer universale complementare alla coda poli(T) e un primer specifico la cui sequenza sarà quella del miRNA stesso.
Dopo la retrotrascrizione, per verificare l’effettiva riuscita della reazione, si effettua una PCR di controllo e si fanno correre gli amplificati su gel di agarosio al 2% (Fig.5.5). Il marcatore di peso molecolare è il 100bp.
I cDNA possono essere conservati a +4°C.
5.9. PCR quantitativa
Questa tecnica è stata utilizzata per quantizzare i trascritti di p19ARF, p21 e PAI-1 (ai vari passaggi e nelle MEF trasfettate) e i livelli dei microRNA 21, 28 e 290 (nelle MEF trasfettate) in seguito a loro retrotrascrizione a cDNA.
La PCR quantitativa, o real-time PCR, permette appunto di quantificare un templato in maniera più sensibile, specifica e riproducibile rispetto ad altri tipi di PCR. La quantizzazione avviene mediante il monitoraggio di una fluorescenza emessa durante la reazione. Questa fluorescenza è direttamente proporzionale ai livelli di amplificato per ogni ciclo. Un parametro molto importante per la quantizzazione è il CT (Threshold Cycle). Esso corrisponde al numero di cicli al quale la fluorescenza emessa supera un livello basale stabilito dall’operatore. Guardando la curva di amplificazione (Fig.5.6), il CT si trova all’inizio della fase lineare-logaritmica cioè nel punto in cui la curva si flette. Maggiore è la quantità iniziale di campione da amplificare, prima avverrà la flessione della curva e minore sarà il CT. Valori di CT maggiori di 40 indicano assenza di
Fig.5.5. Corsa elettroforetica di controllo della retrotrascrizione. Prima lane:100bp; seconda lane: controllo negativo (H2O); ultima lane: controllo
amplificazione e non possono essere inclusi nell’analisi (http://www.dorak.info/genetics/realtime.html).
Per monitorare l’amplificazione dei cDNA, sono stati utilizzati due sistemi di fluorescenza: − sonde TaqMan di idrolisi per l’analisi di p19ARF
e p21 (kit LyghtCycler 480 Probes Master della Roche). Sono oligonucleotidi lunghi 20-30bp che si legano specificamente a una sequenza compresa tra i due primers. Al 5’ è legato un fluoroforo e al 3’ è legato un quencer che assorbe la fluorescenza del fluoroforo quando la sonda è integra (principio FRET = Förster or fluorescence resonance energy transfer). Durante la replicazione del templato, l’attività 5’esonucleasica della polimerasi degrada la sonda separando il quencer dal fluoroforo che è libero di emettere. Poiché la degradazione della sonda avviene solo se questa si è legata alla sua sequenza target, si ha la certezza che la fluorescenza registrata deriva da un’amplificazione specifica.
− Syber Green per l’analisi di PAI-1 (kit LyghtCycler 480 SYBR Green I Master della Roche) e dei microRNA (miScript SYBR Green PCR Kit della Qiagen). È una molecola fluorescente che si lega al DNA a doppio filamento in maniera sequenza-aspecifica. La sua forma non legata emette una debole fluorescenza mentre la sua forma legata emette un segnale molto forte la cui intensità è direttamente proporzionale al cDNA presente. Poiché con questo metodo non si ha una corrispondenza univoca fluorescenza-target, è necessario analizzare l’amplificato mediante le curve di melting (Fig.5.7). Per l’amplificazione mediante Syber Green è sufficiente una coppia di primers. Nel caso dei microRNA, avremo un primer universale complementare alla coda poli(T) e un primer specifico la cui sequenza sarà quella del miRNA stesso.
Fig.5.6. Curve di amplificazione della qPCR.
È riportato il numero di cicli in funzione della fluorescenza. Per ogni curva,CT corrisponde al
primo flesso.
Fig.5.7. Curve di melting della qPCR.
La presenza di un solo picco indica amplificazione specifica. Più picchi indicherebbero la presenza di prodotti aspecifici.
Il software utilizzato per l'analisi dei dati è il LightCycler 480 Software release 1.2.0.0625. Per normalizzare i dati è stato applicato il metodo della curva standard. Un metodo alternativo è quello dei ∆∆CT (ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, http://www3.appliedbiosystems.com/). Per realizzare le curve standard, sono state utilizzate sette diluizioni seriali di un cDNA 50ng/µl di MEF a passaggi precoci non trasfettate: 10ng/µl, 5ng/µl, 2ng/µl, 1ng/µl, 0,2ng/µl, 0,1ng/µl, 0,05ng/µl. I dati sono stati normalizzati rispetto all’espressione dei controlli interni GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) per p19ARF, p21 e PAI-1 e U6 (short nuclear RNA facente parte dello spliceosoma) per i microRNA.
Nella Fig.5.8 sono elencate le sequenze dei primers e delle sonde oltre alle concentrazioni dei cDNA delle MEF utilizzate per ogni esperimento.
metodo primers 5’→3’ sonda 5’→3’ concentr. cDNA
p19ARF TQ F (catgggtcgcaggttcttg) R (gctcgctgtcctgggtctc) cactgtgaggattcagcgcgcg 6 ng/µl p21 TQ F (tccacagcgatatccagaca) R (ggacatcaccaggattggac) ggccctgg 6 ng/µl PAI-1 SG F (aggatcgaggtaaacgagagc) R (gcgggctgagatgacaaa) 1 ng/µl GAPDH TQ /SG F (gccttccgtgttcctaccc) R (tgcctgcttcaccaccttc) cctggagaaacctgccaagtatgatgacatc 1-6 ng/µl miR-21 SG F (tagcttatcagactgatgttga)
R (universal reverse primer) 2 ng/µl
miR-28 SG F (aaggagctcacagtctattgag)
R (universal reverse primer) 2 ng/µl
miR-290 SG F (actcaaactatgggggcacttt)
R (universal reverse primer) 2 ng/µl
miR-505 SG F (cgtcaacacttgctggttttct)
R (universal reverse primer) 2 ng/µl
U6 SG F (gctaatcttctctgtatcgttccaa)
R (universal reverse primer) 2 ng/µl
5.10. Mirnoma
Per confrontare i profili di espressione dei microRNA di MEF senescenti e in attiva proliferazione, è stato realizzato un microarray specifico per microRNA. Su un vetrino con depositate sulla
Fig.5.8. Caratteristiche degli esperimenti di qPCR. Le coppie di primers e le sonde sono state
selezionate dalla Universal ProbeLibrary (https://www.roche.applied-science.com/). La concentrazione utilizzata per PAI-1 è minore di quelle per p19ARF e p21 perché, in generale, è molto più espresso. TQ=TaqMan, SG=Syber Green
superficie sonde specifiche sono stati fatti ibridare in maniera competitiva gli RNA totali estratti dalle MEF proliferanti a passaggio 2 (il controllo) e senescenti al passaggio 5 (il trattato). I primi sono stati marcati con il fluorocromo Hy3TM che emette nel verde a 550nm e i secondi con il fluorocromo Hy5TM che emette nel rosso a 650nm. Sul vetrino, della ditta Exiqon (http://www.exiqon.com/) (Fig.5.9), sono depositate sonde a LNATM che comprendono sonde di controllo, sonde con mismatch e 2056 sonde specifiche per tutti i microRNA di tutti gli organismi registrati su miRBase versione 9,2 (http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/, (24), (25), (26)). LNATM (Locked Nucleic Acid) è un acido nucleico particolare in cui un ponte metilene lega l’ossigeno in posizione 2 del ribosio con il carbonio in posizione 4 (Fig.5.9). Questa struttura chiusa li rende altamente affini ai target, tanto che la temperatura di melting aumenta di 2-8 gradi, e quindi sono possibili condizioni di stringenza più elevata. Anche la ∆Tm aumenta e ciò permette di normalizzare la temperatura di ibridazione a 60°C, adattando la proporzione di nucleotidi LNA per ogni probe.
Per marcare gli RNA abbiamo utilizzato il miRCURYTM Array labelling kit (Exiqon), che marca direttamente i microRNA con un singolo fluoroforo all’estremità 3’ e non richiede un precedente passaggio di purificazione della frazione dei piccoli RNA. Questo kit prevede l’incubazione a 0°C per un’ora di 2,5µg di RNA totale estratto per ogni campione, insieme con l’enzima di marcatura, un controllo positivo, il tampone di marcatura e il fluorocromo corrispondente. La reazione è stata quindi bloccata alla temperatura di 65°C per 15 minuti. Successivamente, i due campioni sono stati uniti ed è stato aggiunto il buffer di ibridazione (contenuto nel miRCURYTM Array microarray slides kit, Exiqon) incubando a 95°C per 5 minuti. Dopo una centrifugazione per 2 minuti a 12x103rpm la mix è stata depositata sul vetrino e vi è stato appoggiato un coprioggetto (24x60mm). Per far avvenire l’ibridazione tra i microRNA e le sonde complementari spottate sull’array il vetrino è stato incubato a 60°C per 16 ore, in camera umidificata dal buffer salino fornito dal kit. Il giorno successivo sono stati eseguiti tre lavaggi successivi in tamponi a concentrazione salina decrescente, per eliminare l’RNA in eccesso non ibridato. Dopo i lavaggi il vetrino è stato asciugato centrifugandolo dentro un tubo Falcon a 1000rpm per 5 minuti, avendo cura di cura di non esporlo alla luce.
La fase successiva è stata quella della scansione del vetrino. Questa operazione è stata effettuata mediante uno scanner Axon a due laser, provvisto del software GenePix Pro (http://www.axon.com/GN_GenePixSoftware.html), che permette di gestire l’acquisizione dell’immagine. La potenza dei fotomoltiplicatori relativi al canale rosso (Hy5 TM) e verde (Hy3 TM) è stata stabilita analizzando il segnale di 8 spot particolari dove si ibridano le molecole dei piccoli RNA U6 costitutivamente espressi, alle cui coordinate si risale conoscendo il lotto del vetrino. Quando questi spot appaiono gialli (il rapporto tra l’intensità della fluorescenza rossa e verde deve essere il più possibile vicino all’unità) si può eseguire la scansione completa del vetrino. Si ricava un file in formato .tif a 16 bit che è il risultato di due immagini sovrapposte, una relativa alla scansione della fluorescenza rossa, una a quella verde, per un totale di 75Mb d’informazione. Per analizzare l’immagine è necessario il .gal file che identifica ogni spot in termini di dimensioni, nome, coordinate. A questo punto il programma costruisce una griglia che va a circondare ogni blocco di spot con un riquadro e ogni spot con un cerchietto. Il software analizza poi l’immagine e confronta gli spot, cioè i segnali entro il cerchietto (foreground), con l’intorno dello spot (il background locale). Assegna quindi un “flag”, un voto, ad ogni spot: good, bad, absent. Alla fine
dell’analisi il software fornisce un file .gpr che contiene i dati relativi a ciascuno spot.
Segue, a questo punto, la normalizzazione dei dati. Questa fase serve per identificare e rimuovere variazioni nella fluorescenza non dovute a espressione differenziale. Per la normalizzazione è stato utilizzato CARMAweb (https://carmaweb.genome.tugraz.at/carma/,(61)). Una volta caricati i file in formato .gpr e .gal il programma ha eseguito la sottrazione del background e la normalizzazione di tipo print tip loess. Questa normalizzazione sottrae dai dati visualizzati su un grafico MA (logaritmo del rapporto in funzione dell’intensità media di fluorescenza) più curve di regressione loess (tipo di regressione non lineare), ciascuna corrispondente ai dati presenti in una certa regione print tip. L’espressione differenziale dei miRNA del controllo e del trattato si indica con M=log2R/V. Il rapporto delle intensità di fluorescenza rossa e verde per ogni spot è infatti indicativo dell’abbondanza relativa del corrispondente microRNA nei due campioni. Carmaweb, una volta analizzato i dati, fornisce un file di testo, in cui ogni spot è ricondotto a un dato miRNA e sono riportati per ognuno i valori di M e A (A=1/2log2(R*V)). Aprendo il file .txt con Excel sono state eseguite una serie di operazioni. Una volta ordinati in ordine alfabetico i miRNA, sono stati eliminati gli spot che non interessano (controlli positivi o negativi, miRNA non identificati nell’uomo, miRNA con mismatch), è stata calcolata la deviazione standard e la varianza per ogni spot avente 3 o più repliche, mentre sono stati scartati i miRNA con meno di 3 repliche. Dato il non elevato numero di repliche per spot, in questo caso non si può utilizzare la mediana. Per avere
un’idea della bontà della media è stato calcolato il rapporto tra la media e la deviazione standard delle quattro repliche dello spot, scartando gli spot in cui questo valore superava la soglia di 0,4. Sono stati infine elaborati i dati grezzi, eseguendo la distribuzione di frequenze della media di M. I miRNA che a noi interessano sono quelli che si trovano nelle code, che si discostano di almeno 2 deviazioni stadard dalla media. Per individuarli, si standardizza la distribuzione delle frequenze di M calcolando il valore di Z score come rapporto tra la differenza della media di M e la media di popolazione e la deviazione standard di popolazione. Esso indica di quante deviazioni standard una osservazione è sopra o sotto la media.
La ricerca dei target di ciascun microRNA è stata effettuata utilizzando l’algoritmo predittivo TargetScan (http://www.targetscan.org/). Esso si basa sulla perfetta complementarietà tra miRNA seed e seed match sui 3’-UTR di 5 genomi: uomo, topo, ratto, cane, pollo. Per ogni gene target, l’algoritmo riporta il numero dei siti conservati e poco conservati. Per ognuno di questi sono riportati i 7mer-m8 (perfetta complementarietà tra le posizioni 2 e 8 del miRNA maturo corrispondenti al seed più la posizione 8), i 7mer-1A (perfetta complementarietà del seed più la presenza di una A in posizione 1 del miRNA), gli 8mer (perfetta complementarietà tra le posizioni 2 e 8 del miRNA maturo corrispondenti al seed più la posizione 8 con una A in posizione 1 del miRNA). Inoltre, ad ogni target è associato un “context score” il cui valore tiene conto della presenza di nucleotidi AU vicino al sito target, della vicinanza a siti target di miRNA coespressi, della distanza di almeno 15 nt dal codone di stop, della posizione del sito target alle estremità del 3’ UTR, del contributo dell’appaiamento fuori dal seed.
