Capitolo 3
Risultati
La presente indagine parassitologica, in cui sono state considerate alcune specie animali ospitate presso lo Zoosafari di Fasano (Br) ed il Giardino Zoologico di Pistoia, ha evidenziato la presenza sia di endoparassiti che di funghi. Gli endoparassiti isolati comprendono protozoi appartenenti ai generi Eimeria e Cryptosporidium, nematodi (ascaridi, strongili gastro-intestinali, Strongyloides fülleborni, Trichuris sp.) e trematodi del genere Paramphistomum, mentre tra i funghi, sono stati evidenziati in particolare lieviti appartenenti alla specie Malassezia pachydermatis.
Tabella 3.1. Parassiti isolati dalle diverse specie animali esaminate
Specie Nome scientifico Protozoi Elminti Lieviti Orso dal
collare
Ursus thibetanus Cryptosporidium sp.
_ Malassezia pachydermatis
Orso polare Ursus maritimus _ _ _
Leone Panthera leo _ Toxascaris
leonina
_
Tigre Panthera tigris _ Toxocara
cati _ Zebra di Grent Equus burchielli boehmi _ Strongili gastro-intestinali _ Elefante africano Loxodonta africana _ _ _ Elefante asiatico
Elephas maximus _ Strongili
gastro-intestinali
Specie Nome scientifico Protozoi Elminti Lieviti Babbuino Papio Cynocephalus _ Trichuris trichiura, Strongyloides fülleborni _ Antilope alcina Taurotragus oryx _ _ _ Antilope cervicapra Antilope cervicapra _ Strongili gastro-intestinali _ Bisonte americano
Bison bison Cryptosporidium sp., Eimeria canadensis Strongili gastro-intestinali _ Bovino razza Highland
Bos taurus _ Strongili
gastro-intestinali
_
Bovino razza Watussi
Bos taurus Cryptosporidium sp.
Strongili gastro-intestinali Yak Bos grunniens
_ Strongili gastro-intestinali, Neoscaris vitulorum _
Daino Dama dama Eimeria parva, Eimeria arloingi Strongili gastro-intestinali _ Giraffa Giraffa camelopardalis _ _ _
Specie Nome scientifico Protozoi Elminti Lieviti Cammello bactriano Camelus bactrianus _ Strongili gastro- intestinali, Trichuris sp. _
Lama Lama glama _ _ _
3.1 Protozoi
Leishmania
La ricerca di anticorpi anti-Leishmania eseguita con il test rapido immunocromatografico (Leishmania Rapydtest®- RK39 Dipstick Test) nel siero di otto orsi dal collare dello Zoosafari di Fasano (Br), ha dato esito negativo per tutti gli esemplari esaminati.
Eimeria
Alcuni dei protozoi evidenziati appartengono al genere Eimeria. In particolare specie appartenenti a questo genere sono state isolate da alcuni campioni rappresentati da pool fecali di bisonte americano (Bison bison) e daino (Dama dama) ospitati presso lo Zoosafari di Fasano (Br). Le oocisti sono state messe in evidenza mediante flottazione mentre, per consentire la sporulazione delle oocisti isolate, necessaria per la loro identificazione a livello di specie, sono state fatte due tipi di coprocolture, una ha previsto l’utilizzo di acqua e ipoclorito di sodio al 2 % in parti uguali e l’altra di bicromato di potassio (K2Cr2O7) al 2.5 %. Nel caso del daino, però, non è
stato possibile identificare in maniera certa tutte le specie poiché il numero di oocisti isolate era troppo basso perché queste potessero essere evidenziate nelle coprocolture. Nel caso del bisonte, è stato osservato che entrambe le soluzioni utilizzate hanno permesso di ottenere la sporulazione delle oocisti. I tempi di sporulazione, però, variavano in base alla soluzione
utilizzata: con il bicromato di potassio questa è avvenuta mediamente in 4-5 giorni, mentre con l’acqua e l’ipoclorito di sodio sono stati necessari 2-3 giorni in più.
• Oocisti isolate dal bisonte americano
Tutti i pool fecali esaminati sono risultati positivi (prevalenza 100%) per la presenza di oocisti coccidiche. Alla flottazione, le oocisti riscontrate dai campioni fecali del bisonte americano sono risultate ovoidali, delle dimensioni medie di 27,83 µm x 17,71 µm ed al loro interno è presente uno sporonte del diametro di 15,26 µm. Dopo sporulazione, le oocisti risultano ovoidali, lunghe da 26,16 µm a 32,7 µm e larghe da 19,8 µm a 26,54 µm. Lo strato interno della parete oocistica è più scura di quella esterna ed al polo acuto essa diventa più sottile a formare un micropilo della lunghezza di 5,06 µm in media. All’interno dell’oocisti è risultato frequente il rilevamento di una sostanza amorfa in prossimità del micropilo. Le sporocisti sono ellissoidali e presentano un piccolo corpo di Stieda all’estremità acuta; esse sono lunghe da 15,26 µm a 17,71 µm e larghe da 6,25 µm a 8,72 µm. All’interno delle sporocisti sono presenti due sporozoiti allungati, contenenti ciascuno due corpi refrattili, ed un residuo sporocistico solitamente formato da granuli ammassati al centro della sporocisti.
Nel bisonte americano sono state riportate sei specie di Eimeria: E. bovis, E. canadensis, E. ellipsodalis, E. zurnii, E. auburnensis e E. brasilensis (Pellerdy, 1974; Ryff e Bergstrom, 1975; Penzhorn et al., 1994).
Dal confronto morfometrico delle oocisti isolate in questo studio con le descrizioni delle oocisti delle specie riportate nel bisonte, è possibile affermare che la specie in causa è E. canadensis (Fig. 3.1.). Infatti, Eimeria canadensis è caratterizzata (Pellerdy, 1974) da oocisti solitamente ovoidali, anche se talvolta possono essere cilindriche, lunghe da 28 µm a 37 µm e larghe da 20 µm a 27 µm. Esse possiedono una doppia membrana incolore o lievemente gialla, più sottile a livello del micropilo.
La sporulazione avviene in media dopo 3-5 giorni di coltura.
Le oocisti mature non presentano residuo oocistico o granuli polari, talvolta è possibile osservare schegge o una sostanza amorfa all’estremità micropilare. Le sporocisti sono ellissoidali ed allungate, sono lunghe da 15 µm a 22 µm e larghe da 6 µm a 9 µm e presentano un piccolo corpo di Stieda. Il residuo sporocistico è composto da pochi granuli diffusi o ammassati in un corpo compatto. Gli sporozoiti includono 2 o 3 globuli chiari.
Fig. 3.1. oocisti di Eimeria canadensis
• Oocisti isolate dal daino
Tutti i pool fecali esaminati (prevalenza 100%) sono risultati positivi per la presenza di oocisti coccidiche. Le oocisti riscontrate nei campioni fecali di daino sono di due tipi: la prima ovoidale, delle dimensioni medie di 25,3 µm x 20,4 µm, con micropilo e capsula polare di 4 µm; la seconda tonda, con un diametro medio di 20,24 µm, senza micropilo e capsula polare. In seguito all’allestimento di coprocolture effettuato per permettere la sporulazione sono state osservate, dopo 5 giorni di coltura, oocisti (Fig. 3.2.) ellissoidali, delle dimensioni medie di 26,16 µm x 21,8 µm, con micropilo e capsula polare ampia 4 µm, senza residuo oocistico. Le sporocisti sono ovoidali, delle dimensioni di 13,08 µm x 6,54 µm, con residuo sporocistico centrale e un granulo polare alle estremità più ampia degli sporozoiti.
Nel daino sono state riportate sei specie di Eimeria: E. arloingi, E. crandallis, E. faurei, E. parva, E. ninakohlyakimovae ed E. intricata (Pellerdy, 1974). Sulla base della morfologia riscontrata per i due diversi tipi di oocisti isolate prima della sporulazione, è possibile sostenere che quelle ovoidali probabilmente appartengono alla specie E. arloingi o E. crandallis, mentre quelle tonde sicuramente alla specie E. parva. E. arloingi presenta infatti oocisti ellissoidali o ovoidali, delle dimensioni di 17-42 µm x 13-27 µm, con micropilo di 2-3 µm e capsula polare incolore di 4-9 µm, non presenta residuo oocistico ma solitamente sono presenti granuli polari. Le sporocisti sono ovoidali allungate e mozze ad una estremità, hanno il residuo sporocistico e misurano 11-17 µm x 6-10 µm. Gli sporozoiti contengono 2 corpi refrattili alle estremità di cui uno di dimensioni maggiori e più evidente (Pellerdy, 1974). E. crandallis ha una oociste ellissoidale talvolta subsferica, delle dimensioni di 23 µm x 17-22 µm, con micropilo di 0,2-2 µm e capsula polare di 1-6 µm, che può essere assente, non presenta residuo oocistico ma solitamente sono presenti granuli polari. Le sporocisti sono ampiamente ovoidali e misurano 8-11 µm x 5-8 µm, con un residuo sporocistico dato da pochi granuli e gli sporozoiti comprendono uno o due globuli chiari (Pellerdy, 1974). Le caratteristiche morfo-metriche delle oocisti sporulate (Fig. 3.2.) osservate corrispondono a quelle della specie E. arloingi (Pellerdy, 1974).
E. parva ha oocisti sferiche o subsferiche, delle dimensioni di 12-23 µm x 10-19 µm, non presenta né capsula polare né micropilo (Pellerdy, 1974). Dal momento che E. parva è l’unica specie del daino che presenta queste caratteristiche morfometriche, in questo caso l’identificazione a livello di specie è stata possibile anche senza l’esame delle oocisti sporulate.
Tabella 3.2. Specie risultate positive per la presenza di Eimeria spp. e relativa prevalenza. Specie Zoo di provenienza N° campioni esaminati N° campioni positivi Prevalenza % Bisonte americano (Bison bison) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 Daino (Dama dama) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 Cryptosporidium
Protozoi appartenenti al genere Cryptosporidium sono stati isolati tramite l’osservazione al microscopio ottico di strisci fecali colorati con Ziehl-Neelsen modificata di animali ospitati presso lo Zoosafari di Fasano (Br). Le specie di appartenenza di questi animali sono:
• Orso dal collare (Ursus thibetanus) • Babbuino (Papio cynocephalus) • Bisonte americano (Bison bison) • Bovino razza Watussi (Bos taurus)
Per la specie orso dal collare, gli strisci fecali per la ricerca di oocisti di Cryptosporidium sp. sono stati allestiti a partire da campioni appartenenti a cinque individui ed a tre gruppi di animali. Per ogni gruppo erano
disponibili 4 pool fecali per ognuno dei quali è stato allestito uno striscio fecale. Gli strisci fecali di pool sono risultati tutti negativi mentre solo due strisci fecali singoli sono risultati positivi.
I campioni fecali di orso dal collare nei quali sono state evidenziate oocisti di Cryptosporidium sp. appartengono a un maschio di 9 anni ed una femmina di 2 anni. Le oocisti evidenziate negli strisci fecali sono ovalari ed il loro diametro misura in media circa 5,2 µm (Fig. 3.3.). Cryptosporidium parvum è stato evidenziato in un esemplare di orso americano (Ursus americanus), tramite un test che prevede l’utilizzo di un siero anti-C. parvum di coniglio (Duncan et al., 1999). Le oocisti di questa specie sono ovoidali o sferoidali, delle dimensioni di 4,85 µm x 4,39 µm (Xiao et al., 2004) anche se Upton e Current (1985) riportano misure maggiori (lunghezza da 4,5 µm a 5,4 µm, larghezza da 4,2 µm a 5,0 µm). È possibile sostenere, in base alla morfologia delle oocisti osservate nel corso di questo studio e alla bibliografia consultata, che esse probabilmente appartengono alla specie C. parvum.
Tabella 3.3. Orsi dal collare (Ursus thibetanus) esaminati per la ricerca di
Cryptosporidium
N° microcip Sesso Età Risultato
985120005910977 M 9 anni positivo
_* F 8 anni negativo
_* M 2 anni negativo
985120005913245 F 2 anni positivo
985120006220287 M 2 anni negativo
* Il numero di microcip non è riportato poiché i due soggetti non sono stati anestetizzati.
Fig. 3.3 oocisti di Cryptosporidium sp. isolata dall’orso dal collare
Nello striscio fecale di babbuino sono state osservate oocisti sferiche del diametro in media di 4 µm (Fig. 3.4.). Studi precedenti hanno dimostrato che i babbuini possono essere infettati da questo protozoo (Muriuki et al, 1997; 1998; Legesse e Erko, 2004). Indagini svolte con metodiche diagnostiche molecolari hanno dimostrato che le scimmie possono essere infettate da varie specie di Cryptosporidium (Xiao et al., 2004). C. hominis, C. parvum e C. muris sono le specie isolate in questi mammiferi ma, mentre le prime due specie presentano oocisti morfometricamente molto simili tra loro e a quelle osservate nel corso di questo studio nel babbuino, le oocisti di C. muris sono molto diverse, essendo molto più grandi (in media 7 µm x 5 µm) (Xiao et al., 2004). È possibile affermare che le oocisti osservate non appartengono alla specie C. muris, mentre non è possibile stabilire se queste appartengono alla specie C. hominis o alla specie C. parvum.
Fig. 3.4. oocisti di Cryptosporidium sp. isolate nel babbuinino (Papio Cynocephalus)
Nello striscio fecale di bisonte americano sono state evidenziate oocisti di Cryptosporidium sp. sferiche del diametro in media di 6 µm (Fig. 3.5), mentre nello striscio fecale di bovino Watussi sono state evidenziate oocisti sferiche del diametro in media di 5 µm (Fig. 3.6.). C. parvum e C. andersoni sono le specie che infettano solitamente i bovini (Xiao et al., 2004; Thompson et al., 2007), anche se C. muris (Nakai et al. 2004), C. hominis e C. felis (Xiao et al. 2004) sono stati isolati da bovini domestici. C. andersoni ha oocisti ellissoidali che misurano 6,0-8,1 µm x 5,0-6,5 µm, mentre le oocisti di C. muris misurano mediamente 7 µm x 5 µm (Xiao et al., 2004), quindi grazie alle caratteristiche morfometriche delle oocisti isolate nel bovino Watussi è possibile affermare che non appartengono a queste due specie, mentre potrebbero appartenere alla specie C. parvum, C. hominis o C. felis. Le oocisti osservate nel bisonte americano potrebbero invece appartenere alla specie Cryptosporidiom andersoni per le dimensioni maggiori osservate, anche se il bisonte americano non rientra tra le specie animali dalle quali è stato isolato questa specie. Infatti C. andersoni è stato isolato nei bovini da reddito, nel cammello bactriano e nella pecora (Xiao et al., 2004). Indagini svolte con metodiche diagnostiche molecolari hanno svelato la presenza di oocisti di Cryptosporidium appartenenti al genotipo topo nelle feci di bisonte americano (Alves et al., 2005).
In generale studi molecolari svolti su ruminanti risultati positivi alla Criptosporidiosi presso lo zoo di Lisbona, hanno dimostrato che la specie infettante era per tutti C. parvum (Alves et al.,2001, 2003, 2005).
Fig. 3.5. oocisti di Cryptosporidium isolata nel bisonte americano (Bison bison)
Fig. 3.6. oocisti isolate nel bovino razza Watussi (Bos taurus)
Tabella 3.4. Specie animali positive per Cryptosporidium sp. e caratteristiche morfometriche delle oocisti osservate
Specie positive per
Cryptosporidium sp. Zoo di provenienza Aspetto morfologico morfologico oocisti Dimensioni oocisti
Orso dal collare (Ursus thibetanus) Zoosafari di Fasano(Br) oocisti ovalari 5,2 µm Babbuino (Papio cynocephalus) Zoosafari di Fasano(Br) oocisti sferiche 4 µm Bisonte americano (Bison bison) Zoosafari di Fasano(Br) oocisti sferiche 6 µm
Bovino razza Watussi (Bos taurus)
Zoosafari di Fasano(Br)
Balantidium coli
Alla flottazione del materiale fecale di uno dei quattro pool (prevalenza 25%) di babbuino dello Zoosafari di Fasano (Br) sono state isolate cisti protozoarie (Fig. 3.7.) sferiche, trasparenti, con diametro di 82,8 µm in media, all’interno delle quali è possibile osservare una massa scura. In questa specie, indagini precedenti hanno svelato la presenza di protozoi quali Entamoeba histolytica (Müller-Graf et al., 1996; Munene et al, 1998; Muriuki et al., 1998; Murray et al., 2000; Legesse e Erko, 2004), Entamoeba coli (Müller-Graf et al., 1996; Munene et al, 1998; Muriuki et al., 1998; Legesse e Erko, 2004), Blastocystis hominis (Legesse e Erko, 2004), Iodamoeba bütschlii, Chilomastix mesnili (Müller-Graf et al., 1996) e Balantidium coli (Myers e Kuntz, 1965; Munene et al, 1998; Muriuki et al., 1998). Le cisti osservate (Fig. 3.7) sono morfologicamente molto simili alle cisti di Balantidium coli anche se le dimensioni non corrispondono in quanto le cisti di tali protozoi misurano 45-65 µm (Yazar et al., 2004).
Fig. 3.7. Cisti isolata dal babbuino (Paoio cynocephalus)
3.2 Nematodi
Ascaridi
Nel corso di questo studio uova di ascaridi sono state evidenziate all’osservazione microscopica di materiale fecale di pool di animali ospitati sia presso lo Zoosafari di Fasano (Br), sia presso il Giardino Zoologico di Pistoia. Gli animali appartengono alle specie tigre, leone e yak. Le uova
Zoosafari di Fasano (Br) sono subsferiche con una spessa parete finemente granulosa, contengono una scura massa embrionale non differenziata che occupa tutto il lume ed in media misurano 74,52 (71,76-77,28) µm x 63,43 (60,62-66,24) µm (Fig.3.8.).
Fig. 3.8. Uovo di Toxocara cati
Le uova isolate dai 4 pool fecali di leone (prevalenza 100%) del Giardino Zoologico di Pistoia sono diverse dalle precedenti, infatti appaiono ovali, con una spessa parete liscia, contengono una massa embrionale non differenziata che non occupa tutto il lume, composta da uno o due globuli chiari e misurano in media 67,21 (65,4-69,02) µm x (80,44) 78,48-82,4 µm (Fig. 3.9.).
Le uova osservate in due pool fecali di yak (prevalenza 50%) dello Zoosafari di Fasano (Br) sono subsferiche con una spessa parete granulosa, contengono una scura massa embrionale non differenziata che occupa tutto il lume ed in media misurano 81 µm x 85 µm. Dalla bibliografia consultata è emerso che le specie di ascaridi che parassitano leone e tigre sono Toxocara cati e Toxascaris leonina (Sprent, 1956; Prescott, 1981; Bjork et al., 2000; González et al., 2007). Recentemente Toxocara cati è stato isolato in esemplari appartenenti alla sottospecie tigre siberiana (Panthera tigris altaica) allo stato libero in Thailandia (Patton e Rabinowitz, 1994) e nell’est della Russia (Gonzalez et al. 2007). Mentre alcuni studi sul trattamento dei parassiti intestinali di leoni e tigri ospitati nei circhi hanno dimostrato la presenza di Toxascaris leonina in queste specie (Prescott, 1981).
In base alla morfologia ed alle dimensioni delle uova isolate nei campioni fecali di tigre, è possibile affermare che la specie in causa sia Toxocara cati (Fig 3.8.), mentre le uova isolate nei campioni fecali di leone appartengono alla specie Toxascaris leonina (Fig. 3.9.). Le uova di Toxocara cati sono infatti ovoidali o subsferiche, delle dimensioni di 65 µm x 75 µm con spessa parete finemente granulosa e contengono una massa embrionale non differenziata e scura che occupa quasi tutto lo spazio disponibile (Parsons, 1987; Gonzalez et al, 2007). Le uova di Toxascaris leonina sono invece sferiche o ovali, misurano 60-75 µm x 75-85 µm, la parete è spessa con superficie liscia, internamente la massa embrionale non differenziata è chiara e composta da 1 o 2 globuli sferici che occupano solo una parte dello spazio disponibile (Parsons, 1987; Gonzalez et al, 2007). In base alla bibliografia consultata (RangaRao et al, 1993) e alle caratteristiche morfometriche delle uova isolate nei campioni fecali di yak è possibile affermare che queste appartengono alla specie Neoascaris vitulorum. Il parassita è stato descritto nello yak da Roy et al. nel 1986 (RangaRao et al,
1993). Le uova dei parassiti appartenenti a questa specie hanno guscio spesso e granuloso, la massa embrionale non è segmentata e misurano in media 70-95 µm x 60-70 µm (Casarosa, 1985).
Tabella 3.5. Prevalenza degli Ascaridi isolati dalle diverse specie animali
Specie Zoo di appartenenza N° campioni esaminati N° campioni positivi Prevalenza % Specie isolata Dimensioni medie uova (µm) Tigre (Panthera tigris) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 Toxocara cati 74,52 x 63,43 Leone (Panthera leo) Giardino Zoologico di Pistoia 4 4 100 Toxascaris leonina 67,21 x 80,44 Yak (Bos grunniens) Zoosafari di Fasano (Br) 4 2 50 Neoascaris vitulorum 81 x 85 Strongili gastro-intesinali
Uova di strongili gastro-intestinali sono state isolate alla flottazione da campioni fecali di pool di animali dello Zoosafari di Fasano (Br). In nessuno dei casi positivi sono state allestite coprocolture per l’identificazione di specie, ma è stata consultata la bibliografia per verificare se questi parassiti sono stati isolati in passato nelle specie da noi trovate positive e quali generi e specie infestano solitamente queste specie animali.
Gli animali positivi agli strongili gastro-intestinali appartengono alle specie: zebra di Grent, bisonte americano, cammello bactriano, yak, daino, antilope cervicapra, bovini razza Highland e Watussi, elefante asiatico. Zebra di Grent
I quattro pool fecali di zebra sono risultati positivi agli strongili gastro-intestinali. Le uova osservate hanno parete sottile, sono trasparenti e ovali, misurano mediamente 99,36 µm (104,88 µm-93,84 µm) x 49,68 µm e presentano al loro interno a volte larve al primo stadio (Fig.3.10.) ed a volte numerosi blastomeri.
Fig. 3.10. Uovo di strongilo gastro-intestinale
con larva isolate nella zebra di Grent (Equus burchelli boehmi)
A causa della elevata densità riscontrata nel corso dell’osservazione microscopica del materiale fecale alla flottazione, è stata eseguita anche una analisi quantitativa di due dei quattro pool in esame utilizzando il vetrino McMaster. La densità è risultata essere pari a 100 UPG per entrambi i pool. Studi precedenti hanno dimostrato che esistono differenze tra le specie di strongili gastro-intestinali che solitamente parassitano la zebra e quelle degli equidi domestici; inoltre, il numero di specie che la zebra ha in comune con gli asini è maggiore di quelle in comune con i cavalli (Matthee et al., 2004). Ciononostante, nella zebra sono stati isolati strongili gastro-intestinali appartenenti agli stessi generi degli equini domestici come Triodontophorus (Scialdo e Krecek, 1983; Krecek et al., 1994), Cyathostomum, Cylicocyclus, Cylicostephanus (Scialdo e Krecek,
1983; Krecek et al., 1994; Matthee et al., 2004) e Cylicodontophorus (Scialdo e Krecek, 1983).
Bisonte Americano
La flottazione eseguita su 4 pool fecali è risultata positiva per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali solo per due di questi (prevalenza 50%). Sono state osservate uova ovali, con parete sottile, trasparenti e con all’interno si osservano agglomerati di blastomeri (Fig. 3.11.) delle dimensioni in media di 101,5 µm (97,2 µm-105,3 µm) x 58,72 µm (56,7 µm-60,75 µm). Indagini precedenti hanno svelato che il bisonte americano può essere parassitato da strongili gastro-intestinali appartenenti ai generi Chabertia, Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Skrjabinagia, Oesophagostomum, Nematodirus e Trichostrongylus (Tessaro, 1989).
Fig. 3.11. Uovo di strongilo gastro-intestinale isolato nel bisonte americano (Bison bison)
Cammello bactriano
I quattro pool fecali in esame sono risultati positivi per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali (prevalenza 100%). Le uova osservate sono delle dimensioni medie di 77,28 µm (88,32-66,24 µm) x 49,68 µm (60,72-38,64 µm). I cammelli possono essere parassitati da strongili appartenenti ai generi Camelostrongylus, Trichostrongylus, Haemoncus, Nematodirus, Chabertia e Oesophagostomum (Scaramella et al., 1989; Miller, 2003).
Yak
Due dei quattro pool fecali (prevalenza 50%) in esame è risultato positivo alla flottazione per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali. Le uova osservate hanno dimensioni medie di 78,97 µm (76,95 µm-81 µm) x 36,45 µm. I generi che parassitano lo yak riportati in bibliografia sono Cooperia, Haemonchus, Mecistocirrus, Trichostrongylus, Ostertagia, Chabertia, Bunostomum (Wu, 1965; RangaRao et al., 1994) e Nematodirus (RangaRao et al 1994; Hogg, 2004).
Daino
I quattro pool fecali (prevalenza 100%) in esame sono risultati positivi alla flottazione per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali. Le uova evidenziate mediamente misurano 81 µm x 42,52 µm (40,5 µm-45,55 µm). Nel daino sono stati osservati strongili appartenenti ai generi Apteragia, Trichostrongylus, Ostertagia, Skrjabinagia, Spiculopteragia, Rinadia, Nematodirus e Oesophagostomum (Ambrosi, 1995).
Antilope cervicapra
Alla flottazione sono state isolate uova delle dimensioni medie di 89 µm x 44,5 µm nei quattro pool fecali esaminati (prevalenza 100%). In questa specie sono state evidenziate inoltre uova appartenenti ai generi Nematodirus (Fig.3.12.) e Marshallagia (Fig. 3.13.) distinguibili dalle altre perché di dimensioni maggiori, 200 µm x 99 µm e 178,2 µm x 89,1 µm rispettivamente, con all’interno uno scarso numero di blastomeri molto grandi e ben evidenti. È stato possibile inoltre distinguere le uova delle due specie tra loro anche se molto simili, poiché le uova appartenenti al genere Nematodirus (Fig.3.12) sono solitamente più larghe ed ovalari rispetto a quelle di Marshallagia che hanno una forma ellissoidale e più allungata (Fig. 3.13.).
A causa della elevata densità riscontrata nel corso dell’osservazione microscopica in due dei quattro campioni è stata eseguita anche una analisi quantitativa di questi utilizzando il vetrino McMaster. Il test è stato
eseguito su entrambi i pool, la densità è risultata essere pari a 700 UPG nel primo pool, di cui 100 appartenenti al genere Marshallagia e 2000 UPG nel secondo pool nessuna delle quali appartenente ai generi Nematodirus e Marshallagia. Gli strongili-gastrointestinali che parassitano questa specie animale appartengono ai generi Trichostrongylus, Ostertagia, Cooperia, Haemoncus, Bunostomum, Oesophagostomum (Singh e Pande, 1963), Camelostrongylus e Nematodirus (Thornton et al., 1973). L’unica specie riportata in bibliografia appartenente al genere Nematodirus isolata in passato nell’antilope cervicapra è N. spathiger (Thornton et al., 1973). Questo parassita presenta uova con 2-8 nuclei di segmentazione lunghe 181-230 µm x 91- 107 µm (Ambrosi, 1995). In base alle caratteristiche morfometriche delle uova osservate (Fig 3.12) nel corso di questo studio è possibile pensare che appartengono a questa specie. Al contrario la presenza di Marshallagia sp. in questa specie non è riportata in bibliografia. I parassiti del genere Marshallagia vivono nell’abomaso dei piccoli ruminanti delle aree tropicali e subtropicali, le uova misurano 160-200 µm x 75-100 µm (Urquhart et al.,1998).
Fig. 3.13. Uovo di Marshallagia sp. (indicato dalla freccia) con uova di altri strongili gastro-intestinali
Bovini razza Highland e Watussi
Per entrambe queste razze bovine, i quattro pool fecali in esame (prevalenza 100%) sono risultati positivi alla flottazione per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali.
Sono state isolate uova delle dimensioni medie di 85,56 µm x 44,16 µm. I pool in esame erano due per ogni razza. Le strongilosi gastro-intestinali bovine sono date da vermi appartenenti ai generi Ostertagia, Haemonchus, Mecistocirrus, Trichostrongylus, Cooperia, Nematodirus, Oesophagostomum e Bunostomum (Casarosa, 1985; Ambrosi, 1995; Urquhart et al., 1998).
Elefante asiatico
Due pool fecali in esame (prevalenza 50%) è risultato positivo alla flottazione per la presenza di uova di strongili gastro-intestinali. Sono state evidenziate uova delle dimensioni di 77,28 µm x 33,12 µm e 66,24 µm x 44,16 µm. Nell’elefante asiatico sono stati isolati in passato nematodi dei generi Murshidia, Quilonia, Amira, Decrusia, Equinurbia, Choniangium e Bathmostomum appartenenti all’ordine Strongyloidea (Vidya e Sukumar, 2002). Haemonchus, Oesophagostomum, Cooperia e Nematodirus sono invece i generi di appartenenza degli strongili gastro-intestinali isolati nell’elefante africano nel corso di indagini passate (Crockett e Dipeolu; 1984). L’elefante asiatico e africano sono infatti parassitati da differenti generi e specie di strongili gastrointestinali (Miller, 2003).
Tabella 3.6. Specie animali risultate positive per gli strongili gastrointestinali e relativa prevalenza. Specie animale Zoo di appartenenza Numero campioni in esame Numero campioni positivi Prevalenza % Dimensioni medie delle uova osservate Zebra di Grent (Equus burchielli boehmi) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 99,36 µm x 49,68 µm Bisonte americano (Bison bison) Zoosafari di Fasano (Br) 4 2 50 101,5 µm x 58,72 µm Cammello bactriano (Camelus bactrianus) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 77,28 µm x 49,68 µm Yak (Bos grunniens) Zoosafari di Fasano (Br) 4 2 50 78,97 µm x 36,45 µm Daino (Dama dama) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 81 µm x 42,52 µm Antilope cervicapra (Antilope cervicapra) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 89 µm x 44,5 µm; Nematodirus sp.: 200 µm x 99 µm; Marshallagia sp.: 178,2 µm x 89,1 µm
Specie Zoo di appartenenza Numero di campioni in esame Numero campioni positivi Prevalenza % Dimensioni medie delle uova osservate Bovino razza Highland (Bos taurus) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 85,56 µm x 44,16 µm Bovino razza Watussi (Bos taurus) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 85,56 µm x 44,16 µm Elefante asiatico (Elephas maximus) Zoosafari di Fasano (Br) 4 2 50 71,76 µm x 38,14 µm
Nessuna delle uova osservate nei campioni dei ruminanti apparteneva al genere Nematodirus e Marshallagia, ad eccezione di quelle osservate in due dei quattro campioni fecali di antilope cervicapra, nei quali è stato possibile identificare i generi di appartenenza grazie alle particolari caratteristiche morfometriche delle uova di questi parassiti (Fig.3.12. e Fig. 3.13.).
Strongyloides fülleborni
Nei quattro pool fecali di babbuino dello Zoosafari di Fasano (Br) in esame (prevalenza 100%) sono state osservate alla flottazione uova ovali, trasparenti, di dimensioni medie di circa 42,9 µm x 27,7 µm, contenenti larve (Fig. 3.14.). In base alla morfologia e alle dimensioni delle uova è possibile affermare che appartengono a parassiti del genere Strongyloides. Le larve sono state osservate al microscopio stereoscopico in seguito all’allestimento di un apparato di Baermann, isolate e misurate al
microscopio ottico a forte ingrandimento. Le larve (Fig. 315.) presentano una coda appuntita, misurano in media 412,16 µm x 18,34 µm. L’esofago rabditoide misura in media 67,19 µm x 11,99 µm ed il bulbo ha un diametro medio di 16,35 µm. Nel babbuino sono state isolate due specie appartenenti al genere Strongyloides: S. füelleborni (Premvati, 1958; Myers e Kuntz, 1965; Munene et al., 1998; Muriuki et al., 1998; Murrey et al., 2000) e S. stercoralis (Myers e Kuntz, 1965). Di queste due specie, però, solo S. füelleborni prevede nel proprio ciclo biologico l’eliminazione di uova con le feci degli animali parassitati, mentre nel caso di S. stercoralis si riscontra la presenza di larve (De Carneri, 1992). Pertanto, considerata anche la corrispondenza morfometrica delle uova (Fig. 3.14.) (Pampiglione e Ricciardi, 1971) e delle larve rabditoidi isolate (Fig. 3.15.) (Premvati, 1958), la specie in causa è stata identificata con S. füelleborni.
Fig. 3.15.Larva al primo stadio di Strongyloides fülleborni
Trichuris
All’analisi per flottazione dei quattro pool fecali di babbuino dello Zoosafari di Fasano (Br), in tutti i campioni (prevalenza 100%) sono state osservate uova brune, a forma di limone, bottonute ai due poli, delle dimensioni medie di 56,68 µm x 23,98 µm (Fig. 3.16.). Uova con la stessa morfologia sono state evidenziate al microscopio ottico in tutti i quattro pool fecali (prevalenza 100%) di cammello del Giardino Zoologico di Pistoia; in questo caso le uova hanno dimensioni medie di 75,9 µm x 32,89 µm (Fig. 3.17.). Per la morfologia osservata è possibile affermare che queste uova appartengono in entrambi i casi al genere Trichuris. Secondo indagini precedenti l’unica specie che interessa il babbuino è T. trichiura (Myers and Kuntz, 1965; Munene et al., 1998). Questa specie può essere identificata anche solo in base alla morfologia delle uova e delle loro dimensioni, che corrispondono a 50-55 µm x 20-25 µm (Munene et al., 1998). Considerata la corrispondenza morfometrica delle uova la specie in causa è stata identificata con T. trichiura. Al contrario, nel cammello sono state isolate due specie, T. globulosa e T. raoi (Scaramella et al., 1989). Le uova di queste due specie hanno dimensioni molto simili (Casarosa, 1985), pertanto non è stato possibile identificare la specie di appartenenza delle uova isolate nel corso di questa indagine nel cammello bactriano.
Tabella 3.7. Specie animali e zoo di provenienza, risultati positivi per la presenza di uova di Trichuris spp. E relativa prevalenza.
Specie Zoo di provenienza Numero campioni in esame Nimero campioni positivi Prevalenza % Dimensioni medie delle uova osservate (µm) Babbuino (Papio cynocephalus) Zoosafari di Fasano (Br) 4 4 100 56,68 x 23,98 Cammello bactriano (Camelus bactrianus) Giardino Zoologico di Pistoia 4 4 100 75,9 x 32,89
Fig. 3.16. Uovo di Trichuris trichiura
Fig. 3.17. Uovo di Trichuris sp. isolato nel cammello bactriano (Camelus bactrianus)
Dirofilaria
All’osservazione microscopica dei campioni ematici appartenente a otto esemplari di orso dal collare dello Zoosafari di Fasano (Br) non è stata svelata la presenza di microfilarie.
I test ELISA (Canine Heartworm, Antigen Test Kit, Dirochek®) per la ricerca di antigeni di Dirofilaria immitis nel siero di otto esemplari di orso dal collare sono risultati anche essi tutti negativi.
3.3 Trematodi
Nel corso di questa ricerca, alla osservazione microscopica di campioni fecali di pool di bisonte americano dello Zoosafari di Fasano (Br) sottoposti a sedimentazione è stata osservata la presenza di uova di Paramphistomum sp. in uno dei campioni esaminati (prevalenza 25%). L’uovo è ovale, opercolato ad una estremità, delle dimensioni di 132,48 µm x 77,28 µm. Le cellule embrionali sono ben visibili all’interno e il colore è grigio (Fig. 3.18.).
Le distomatosi del bisonte sono sostenute da Paramphistomum microbothrioides (Herd e Hull, 1981; Tessaro, 1989; Knap et al. 1993), Fasciola hepatica e Fascioloides magna (Tessaro, 1989; Knap et al. 1993). Le uova di Paramphistomum si distinguono da quelle di Fasciola e Fasciolides perché ovali, hanno un opercolo evidente al polo più stretto, il nucleo germinativo è ben visibile e sono trasparenti con un colore tendente al grigio, mentre le uova di Fasciola e Fasciolides sono ellittiche, con un opercolo poco evidente e di colore giallo (Ambrosi, 1995; Urquhart et al., 1998). In particolare, le uova di P. microbothrioides hanno dimensioni medie di 130 µm x 69 µm (Herd e Hull, 1981). È possibile quindi affermare, in base alle caratteristiche morfometriche delle uova osservate nel corso di questo studio e alla bibliografia consultata (Herd e Hull, 1981;
Tessaro, 1989; Knap et al. 1993), che si tratti del genere Paramphistomum e, probabilmente, alla specie P. microbothrioides in quanto essa è l’unica specie appartenente al genere Paramphistomum che parassita il bisonte americano riportata in bibliografia.
Fig. 3.18. Uovo di Paramphistomum microbothrioides
Tabella 3.8. Specie animali e rispettivi endoparassiti isolati nello Zoosafari di Fasano (Br).
specie Protozoi Elminti
Ursus thibetanus (Orso) Cryptosporidium sp. _ Panthera tigris (Tigre) _ Toxocara cati Equus burchielli bohemi (Zebra di Grent) _ Strongili gastro-intestinali Loxodonta africana (Elefante africano) _ _ Elephas maximus (Elefante asiatico) _ Strongili gastro-intestinali Papio Cynocephalus (Babbuino)
Cryptosporidium sp. Trichuris trichiura Strongyloides fülleborni Taurotragus oryx (Antilope alcina) _ _ Antilope cervicapra (Antilope cervicapra) _ Strongili gastro-intestinali
Specie Protozoi Elminti Bison bison (Bisonte americano) Cryptosporidium sp. Eimeria canadensis Strongili gastro-intestinali, Paramphistomum microbothrioides. Bos taurus (Bovino Razza Highland) _ Strongili gastro-intestinali Bos taurus (Bovino razza Watussi) _ Strongili gastro-intestinali Dama dama (Daino)
Eimeria parva, Eimeria arloingi Strongili gastro-intestinali Giraffa camelopardalis (Giraffa) _ _ Bos grunniens (Yak) _ Strongili gastro-intestinali, Neoascaris vitulorum Camelus bactrianus (Cammello) _ Strongili gastro-intestinali Lama glama (Lama) _ _
Tabella 3.9. Specie animali e rispettivi endoparassiti isolati nel Giardino Zoologico di Pistoia
Specie protozoi elminti
Ursus maritimus (Orso polare) _ _ Panthera leo (Leone) _ Toxascaris leonina Panthera tigris (Tigre) _ _
Equus burchielli boehmi
(Zebra di Grent) _ _ Elephas maximus (Elefante asiatico) _ _ Giraffa camelopardalis (Giraffa) _ _
Bos grunniens (Yak) _ _
Camelus bactrianus
(Cammello bactriano) _ Trichuris sp.
3.4 Lieviti
L’esame colturale del cerume auricolare, raccolto da sei degli otto orsi anestetizzati presso lo Zoosafari di Fasano (Br), ha svelato la presenza di Malassezia pachydermatis. Il lievito è stato identificato sulla base dei caratteri morfologici macro (Fig. 3.19.) delle colonie e della capacità di svilupparsi anche in assenza di lipidi (crescita in Sabouraud destrosio agar, Biolife®). Le colonie di questo lievito appaiono molli, lisce e bianche (Fig. 3.19.). L’osservazione microscopica degli strisci colorati del materiale ceruminoso di ciascun tampone ha permesso di quantificare la presenza del lievito sulla base del numero cellule morfologicamente riferibili a Malassezia in cinque campi microscopici casuali ad un ingrandimento di 100x. Le cellule sono risultate ovali o cilindriche delle dimensioni di 2,4-2,6 µm x 4,2-5,1 µm.
Tabella 3.10. Isolamento di Malassezia pachydermatis in coltura ed all’osservazione microscopica del cerume auricolare di sei esemplari di orso dal collare (Ursus
thibetanus) dello Zoosafari di Fasano (Br).
N. orso Esame citologico N cellule lettura 100X Esame colturale UFC Identificazione 1 985120005910977 4 64 M. pachydermatis 2 985120005918824 16 64 M. pachydermatis 3 985100006643305 3 300 M. pachydermatis 4 985120005935697 21 36 M. pachydermatis 5 985120005837759 9 100 M. pachydermatis 6 985120006909207 3 5 M. pachydermatis
3.5 Dermatofiti
Le colture in Mycobios Selective Agar (Biolife®), del materiale cutaneo prelevato con spazzole da sei degli otto orsi tibetani anestetizzati appartenenti allo Zoosafari di Fasano (Br), non hanno consentito l’isolamento dermatofiti negli esemplari esaminati.
Tuttavia, nelle colture è stata osservata crescita di colonie fungine in tutti i sei esemplari esaminati. Le colonie sviluppatesi nel terreno di coltura sono state contate ed i risultati sono stati espressi come numero di colonie spazzola (unità formanti colonia –UFC). Le colonie morfologicamente differenti sono state isolate e ricoltivate in Sabouraud destrosio agar (Biolife®), per sottoporle a successiva identificazione. L’identificazione delle colonie cresciute è stata quindi effettuata sulla base delle
caratteristiche macro e microscopiche degli isolati seguendo le chiavi fornite da de Hoogs (2000).
Tabella 3.11. Funghi isolati da peli di orso dal collare (Ursus thibetanus) dello Zoosafari di Fasano (Br)
N° orso UFC N° Colonie con caratteri
macroscopici diversi identificazione Aspergillus spp Aspergillus spp Aspergillus spp 1 985120005910977 8 4 Penicillium spp Aspergillus spp Aspergillus spp 2 985120005918824 50 3 Penicillium spp Aspergillus spp 3 985100006643305 24 2 Penicillium spp. Aspergillus spp Alternaria spp 4 985120005935697 82 3 Penicillium spp Aspergillus spp 5 985120005837759 24 2 Alternaria spp Aspergillus spp Penicillium spp 6 985120006909207 18 3 Penicillum spp
