Università degli Studi di Pisa
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Scienze Biologiche
Anno Accademico 2007-2008
Tesi di Laurea
Studio delle differenze molecolari
tra ERK1 ed ERK2.
Candidato: Luca Baccigalupo
Relatori: Mario Costa
Giuseppe Bardi
Appendice.
Riassunto……….pag. 5 Abstract………...pag. 7 1. Introduzione………pag. 8 1.1. Famiglia delle MAPK………..pag. 9 1.1.1. Meccanismi di attivazione………..……...pag. 10 1.1.2. Substrati e funzione……..………..…..pag. 11 1.2. ERK1 ed ERK2………pag. 14
1.3. Sistemi di regolazione post-trascrizionali………...……...pag. 17 1.4. Sistemi di regolazione traduzionali poliadenilazione dipendenti……….pag. 19 1.5. Microscopia………….………..pag. 22 1.5.1. Il fenomeno della fluorescenza..………..……….…pag. 22 1.5.2. Microscopia confocale……..………...…..pag. 26 1.5.3. Acquisizione dell’immagine………..………..…..pag. 30 1.5.4. Misrazione della fluorescenza delle proteine ( FRAP )……..………....pag. 31 1.6. GFP……….…...pag. 36 1.7. FGF e recettori ………pag. 49
2. Metodi e materiali………...pag. 40 2.1. Plasmide………pag. 40 2.2. Amplificazione del costrutto………...pag. 41 2.3. Colture cellulari………...pag. 41 2.4. Trasfezione….………..pag. 42 2.5. Microscopia confocale………...pag. 44 2.5.1. Esperimenti di FRAP: trasporto nucleo/citoplasma……….………..……..pag. 46
2.6. Saggio di poliadenilazione RACE-PAT………....pag. 47 2.7. Saggio di ploadenilazione LM-PAT...………..pag. 49 2.8. Southern blot………..pag. 51 2.9. Ibridazione su filtro………...pag. 52 2.10. Autoradiografia………..……….pag. 52 2.11. Appendice soluzioni………..………..pag. 54
3. Risultati………...pag. 58 3.1. Cloni di ERK1 con l’n-terminale deleto e cloni di ERK2 con l’n-terminale di
ERK1 aggiunto……….pag. 58 3.2. Confronto della traslocazione nucleare tra ERK1-GFP ed ERK2-GFP………....pag. 62 3.3. ERK1-GFP ed ERK2-GFP si muovono attraverso la membrana nucleare con
cinetiche diverse………...pag. 65 3.4. Studio della regione 3’UTR di ERK1 ed ERK2 ………...pag. 68 3.5. Caratterizzazione della regione 3’UTR di ERK1 ed ERK2……….pag. 68 3.6. Saggio di RACE-PAT condotto su ERK2………..pag. 70
4. Conclusioni………..pag. 74 4.1. Comunicazione bidirezionale tra nucleo e citoplasma……….pag. 76 4.2. ERK1 ed ERK2 non sono intercambiabili: l’efetto dell’N-terminale sul
trafficking……….pag. 77 4.3. Coseguenze funzionali sulla velocità di trafficking………...pag. 79 4.4. Regolazione della trascrizione di ERK2………pag. 80
