Lo studio svolto in questa tesi è stato finalizzato alla valutazione di nuove strutture a base di gelatina e nanotubi utili per applicazioni nell’Ingegneria dei Tessuti Cardiaci e in grado di aprire nuove opportunità di ricerca sia per lo sviluppo di modelli farmacologici sia per lo studio dei meccanismi fisiopatologici alla base delle malattie cardiovascolari.
L'ingegneria tissutale ricopre un ruolo fondamentale nella medicina rigenerativa; lo sviluppo di questa branca ingegneristica ha aperto la strada a nuove possibilità di cura e a una migliore qualità della vita dei pazienti (Eschenhagen T, et al 2005). Ad oggi, la perdita di funzione di un organo o di un tessuto rappresenta una problematica rilevante sia sotto il profilo clinico sia per i costi di gestione che ne derivano. Infatti nei pazienti affetti da patologie cardiovascolari, con compromessa funzionalità cardiaca, le terapie possono risultare inefficaci nell'offrire benefici e per ovviare a tale problematica è necessario ricorrere a trattamenti invasivi, dai supporti circolatori meccanici al trapianto d’organo. I trapianti sono infatti tra le terapie più sofisticate, onerose e complicate da differenti aspetti come la mancanza di un numero adeguato di donatori e la necessità che i soggetti trapiantati vengano sottoposti cronicamente a trattamenti immunosoppressivi che favoriscono lo sviluppo di dannosi effetti collaterali. A differenza, la terapia sostitutiva basata su organi artificiali o supporti circolatori meccanici è invece gravata dalla durata limitata dei dispositivi, nonché dal rischio di sviluppare infezioni (Finosh GT, et al 2012).
La cosiddetta “medicina rigenerativa” sembra essere una soluzione adeguata per ovviare a tutte queste problematiche e rappresenta un settore emergente capace di combinare aspetti della medicina, della biologia cellulare e molecolare, della scienza dei materiali e dell’ingegneria al fine di rigenerare, riparare o sostituire i tessuti danneggiati (Lange R, et al 1993).
Durante questo lavoro di Tesi sono stati sviluppati scaffold a base di gelatina (5%) con concentrazioni di CNT allo 0,3% e 0,9%. Per la costruzione di tali scaffold, è stata scelta la gelatina, essendo un biopolimero naturale dotato di buone proprietà meccaniche, non immunogeno. E’ caratterizzata da elevata biocompatibilità e bioriassorbibilità e la sua applicazione come rivestimento di polimeri sintetici ha dimostrato di promuovere l’adesione e l’integrazione cellulare alla superficie epicardica del cuore infartuato (Rose PJ, et al 1987). Per quanto concerne i nanotubi in carbonio, è stato dimostrato che sia i nanotubi a parete singola (SWNT) che a parete multipla (MWNT) sono dotati di proprietà fisiche peculiari per le quali i nanotubi di carbonio rientrano in numerose applicazioni mediche (Heister E, et al 2013). Nelle nostre applicazioni sono stati usati CNT a parete singola su cui seminare la linea cellulare H9c2, isolata da ventricoli di embrioni di ratto.
Prima di procedere con la messa a punto di scaffold a base di gelatina e nanotubi di carbonio, obiettivo preliminare fondamentale del lavoro di Tesi è stata la valutazione del cambiamento fenotipico della la linea
H9c2, dovuto a due diverse condizioni di coltura (Liu X, et al 2007; Comelli M, et al 2010; Garibaldi S, et al 2005).
La linea H9c2 presenta un fenotipo proliferativo di tipo mioblastico, capace di rimanere indifferenziata in condizioni di coltura caratterizzate da FBS al 10%. Un vantaggio di tali cellule è proprio la loro capacità di differenziare in cellule cardiache o scheletriche in base al mezzo di coltura utilizzato. Infatti, la caratterizzazione biologica, effettuata in questo studio, si è focalizzata sulla valutazione della modificazione fenotipica delle H9c2 dovuta a stimoli biochimici indotti sia da FBS a basse concentrazioni (1%) sia da acido retinoico. I risultati ottenuti hanno portato ad evidenziare quale potesse essere l’effetto del materiale sulle caratteristiche fenotipiche delle cellule. È noto che l’aggiunta di FBS all’1% o di acido retinoico stimoli le cellule a differenziare verso un fenotipo muscolo scheletrico (bassa concentrazione di FBS) o cardiaco (acido retinoico) e le analisi immunoistochimiche e di biologia molecolare effettuate hanno evidenziato il comportamento biologico delle H9c2 in risposta alle condizioni di coltura utilizzate. In particolare, la differenziazione delle H9c2 in fenotipo cardiaco in risposta all’ aggiunta di acido retinoico è stata confermata dai cambiamenti morfologico strutturali delle cellule stesse (Comelli M, et al 2010; Garibaldi S, et al 2005), così come emerso dall’analisi microscopica, dalle variazioni della proliferazione cellulare e dalle modificazioni trascrizionali di marker cardiaci specifici, quali il sistema dei PN e dell’ET, che sono risultati contro-regolati nelle H9c2 differenziate in cardiomiociti.
Questi risultati hanno fornito la base per la scelta, come mezzo di coltura ottimale per la crescita delle cellule H9c2 sui CNT, di FBS10%, così come
riportato in letteratura, al fine di evitare gli effetti confondenti dovuti alla maturazione fenotipica cardiaca veloce promossa dall’acido retinoico. Nella seconda fase dello studio, è stato valutato l’effetto dello scaffold, costituito da una soluzione di gelatina e CNT, con genipina come cross-linker, sul fenotipo cellulare. In questo lavoro di Tesi, sono stati utilizzati CNT per ottenere uno scaffold conduttivo, capace quindi di stimolare elettricamente il tipo cellulare con cui vengono seminati. La caratterizzazione elettrica effettuata ha dimostrato come scaffold prodotti con concentrazioni di nanotubi allo 0,3 e 0,9% in gelatina al 5%, possano essere validi supporti per la loro successiva caratterizzazione biologica. È oramai evidente che la dispersione casuale dei nanotubi ha una forte influenza sulla conduttività del materiale e l’obiettivo di numerose ricerche è direzionato all’allineamento del maggior numero possibile di CNT allo scopo di rendere più efficiente la conduzione con minore dispersione (Martinelli V, et al 2013). La dielettroforesi si è dimostrata, in un recente studio (Shekhar S, et al 2011) una tecnica decisamente efficiente,andando ad impattare anche sulle proprietà meccaniche del materiale, infatti è stato mostrato che all’aumentare del tempo di applicazione della dielettroforesi, aumenta la velocità di risposta del sistema. E’ stato inoltre riportato che nel caso di dielettroforesi applicata durante la polimerizzazione, la modifica dell’orientazione media dei nanotubi all’interno di scaffold risultava più evidente.
L’analisi delle curve di crescita ha mostrato nei primi 7 giorni di coltura una diminuzione della vitalità cellulare, probabilmente dovuto al tempo necessario alla cellula di adattarsi al materiale. Inoltre, dalla valutazione dei biomarcatori specifici cardiaci, non è stata osservata una variazione significativa né in CNT0,3% né CNT0,9% rispetto ai controlli. Una possibile
spiegazione potrebbe essere correlata ai ridotti tempi di coltura, incapaci di stimolare il cambiamento del pattern di espressione genica caratteristico di un fenotipo cardiaco più maturo, sottolineato anche dalla diminuita espressione della CX-43, coinvolta nella formazione delle gap-junction (Liu X, et al 2007; Martinelli V, et al 2013). Inoltre, l’applicazione di tecniche di immunoistochimica effettuata sui CNT0,3% e CNT0,9% non
hanno fornito indicazioni sul tipo di differenziamento, a causa del forte background fluorescente del materiale, dovuto alla presenza di genipina come cross-linker.
Nonostante siano necessari ulteriori studi, i nostri preliminari risultati mostrano anche come lo scaffold possa essere capace di condurre elettricità e quindi potenzialmente capace di stimolare un tipo cellulare ad esso sensibile; infatti le sue proprietà intrinseche viscoelastiche e meccaniche, potrebbero favorire l’induzione del programma di maturazione dell’espressione genica nelle H9c2 verso un fenotipo cardiaco maturo. Questi dati supportati dai risultati ottenuti dall’analisi molecolare mostrano, da un lato, l’assenza di uno stimolo differenziativo da contatto da parte del materiale nei primi 7 giorni di coltura ma,
dall’altro lato, forniscono un riferimento importante di quale sia il loro destino nel momento in cui sarà possibile applicare lo stimolo elettrico. Questo lavoro di Tesi rappresenta quindi un primo passo nello sviluppo di scaffold conduttivi per applicazioni nell’Ingegneria dei Tessuti Cardiaci. Ulteriori analisi sulle qualità del biomateriale, unite a più elaborate strategie di coltura cellulare e all’apporto della stimolazione elettrica permetteranno di ottenere più approfondite informazioni sulle modifiche fenotipiche indotte nelle cellule.
