CAPITOLO 4 RISULTATI

CAPITOLO 4

RISULTATI

4.1 Animali utilizzati per l’allestimento del saggio

Per la fase di allestimento dl saggio abbiamo deciso di utilizzare 4 animali. Tre di essi (BR, BS e CG) sono gatti che si trovano allo stadio cronico di infezione con il ceppo Petaluma di FIV; per consentire l’allestimento essi sono stati sottoposti a tre inoculi di DNA codificante per l’antigene Env. Il quarto animale (BO) è un gatto sano che non è stato sottoposto ad alcun trattamento e che, quindi, è stato utilizzato come controllo negativo.

4.2 Generazione e trasformazione delle linee di fibroblasti

felini

Per l’allestimento del saggio di citotossicità è stato necessario disporre di cellule autologhe da utilizzare come target di lisi. A questo scopo sono stati scelti i fibroblasti, a causa della facilità di prelievo e del mantenimento in coltura.

I fibroblasti sono stati ottenuti mediante una biopsia cutanea dalla coscia degli animali anestetizzati; i frammenti di pelle così ottenuti sono stati incubati in una soluzione di PBS e tripsina all’1%, come descritto nella sezione “Materiali e Metodi”, in modo da favorire il distacco di singole cellule, le quali sono state messe in coltura. I fibroblasti sono stati mantenuti in incubatore e coltivati in terreno MEM-α. Dopo circa 10 giorni è stato possibile osservare nelle piastre piccoli gruppi di cellule che hanno continuato ad espandersi fino a raggiungere la confluenza dopo circa 20 giorni dal loro prelievo; durante questo periodo i fibroblasti non sono stati tripsinizzati ma è stato solo sostituito il terreno di crescita ogni 3 giorni circa. La tripsinizzazione è avvenuta al raggiungimento della confluenza.

Dal momento che la generazione delle colture di fibroblasti primari autologhi richiede circa 20 giorni si è reso necessario poter congelare le cellule ottenute affinché potessero essere conservate. Per fare in modo che i fibroblasti non perdessero vitalità durante il congelamento abbiamo deciso di trasformare le colture primarie.

La trasformazione è stata effettuata trasfettando le colture primarie con un plasmide, il pACTSV2, contenente il genoma del virus SV40; questo è leggermente modificato in quanto è stata rimossa una porzione dell’estremità carbossi-terminale dell’antigene T. Questa delezione riguarda la sequenza di riconoscimento dell’origine di replicazione virale di SV40 da parte dell’antigene T, per cui il pACTSV2 non è in grado di dar luogo ad una infezione produttiva. L’avvenuta trasformazione dei fibroblasti primari è stata valutata comparando la loro crescita con quella di fibroblasti di controllo non trasfettatti (Figura 4.1). Le cellule trasfettate presentano una velocità di crescita nettamente maggiore rispetto a quelle di controllo ed è stato possibile osservare la presenza di foci di replicazione che indicano la perdita dell’inibizione da contatto; infine la loro vitalità si mantiene pressoché inalterata

osservazione, i fibroblasti primari coltivati in parallelo hanno raggiunto la senescenza e non è stato possibile espanderli ulteriormente.

Figura 4.1: Fibroblasti primari trasformati (a destra) e di controllo (a sinistra)

4.3 Valutazione dell’efficienza di trasduzione

Per poter effettuare il saggio è stato necessario disporre di cellule target che esprimessero l’antigene di interesse Env ed un gene reporter, la GFP. Per questo i fibroblasti trasformati sono stati trasdotti con un vettore bicistronico FIV-derivato (precedentemente prodotto e caratterizzato nel nostro laboratorio) esprimente questi due geni. Le particelle virali contenenti il DNA vettore sono state ottenute, in accordo con la strategia dello split component system; mediante cotrasfezione sulla linea cellulare 293T di tre costrutti separati: il costrutto di packaging, veicolante le proteine strutturali ed enzimatiche, il

vettore vero e proprio. Le particelle virali sono state pseudotipizzate con la glicoproteina G del virus della stomatite vescicolare, in modo da allargare il loro tropismo d’ospite.

A circa 48 ore dalla trasfezione, il surnatante delle 293T, contenente le particelle virali prodotte, è stato raccolto, chiarificato e filtrato per eliminare eventuali detriti cellulari presenti. Le particelle vettore così prodotte sono state conservate a -80°C fino al momento dell’uso; 24 ore prima della trasduzione i fibroblasti trasformati sono stati contati e seminati ed il giorno successivo sono stati trasdotti. Per valutare l’efficienza della trasduzione, i fibroblasti sono stati analizzati al citofluorimetro andando a valutare la percentuale di cellule GFP-positive all’interno della popolazione a 3 e 7 giorni dalla trasduzione. Nella figura 4.2 è riportato un esempio rappresentativo dell’analisi al FACS dei fibroblasti trasformati e trasdotti.

Nell’immagine A è rappresentato il gate contenente la popolazione di fibroblasti vitali non trasdotti; le cellule al suo interno saranno utilizzate per le analisi successive. Nell’immagine B, invece, i fibroblasti non trasdotti contenuti nel gate sono stati analizzati in base alla fluorescenza; il numero in alto a destra rappresenta la percentuale di cellule fluorescenti contenute nel gate. Nella figura 4.2.C è rappresentata l’analisi effettuata sulle cellule trasdotte: è possibile osservare lo spostamento verso valori più elevati di fluorescenza delle cellule trasdotte (riportate in viola) rispetto a quelle buie (riportate in verde). Infine, nell’immagine D è rappresentata la sovrapposizione (overlay) dei risultati ottenuti dal campione non trasdotto e da quello trasdotto: essa mostra chiaramente lo spostamento di una parte della popolazione dei fibroblasti verso valori più elevati di fluorescenza che non si verifica nel controllo negativo.

A B

C D

0,6%

64%

Figura 4.2: Esempio rappresentativo dell’analisi al FACS di popolazioni di fibroblasti trasdotti e non. A: gate di fibroblasti vitali. B: controllo negativo. C: fibroblasti trasdotti. D: istogramma di fibroblasti sia trasdotti (in viola) che non

trasdotti (in verde)

Il vettore si è dimostrato quindi efficace nel trasdurre i fibroblasti trasformati.

Per verificare che l’integrazione del vettore all’interno del genoma delle cellule sia stabile, le cellule trasdotte sono state propagate per circa 30 giorni,

durante i quali sono stati monitorati i livelli di fluorescenza espressa dai fibroblasti. I dati, riportati nel grafico 4.2, indicano che la trasduzione è stabile e l’espressione del transgene è a lungo termine.

0 10 20 30 40 50 60 3gg 7gg 15gg 21gg

giorni post trasduzione

% fl u o re sc e n za

Grafico 4.2: Andamento della percentuale di fluorescenza a vari tempi dalla trasduzione

Per consentire l’allestimento del saggio, è necessario poter conservare tramite congelamento le linee cellulari autologhe ed è fondamentale che esse mantengano la capacità di esprimere i geni eterologhi anche in seguito a questo processo. Per questo la stabilità della trasduzione è stata valutata anche dopo congelamento e scongelamento (Grafico 4.3). Come si vede dai dati riportati nel grafico, i livelli di espressione del gene reporter si mantengono stabili anche dopo congelamento.

Per cui questi risultati ci consentono di conservare le linee cellulari in azoto liquido senza alterarne la capacità replicativa e i livelli di espressione dell’antigene e del gene reporter.

Pecentuali di fluorescenza dopo congelamento

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% BR BS CG BO % flu o res ce n za

Grafico 4.3: Stabilità della trasduzione in seguito a congelamento

4.4 Valutazione dell’espressione di Env

La capacità dei fibroblasti trasdotti di esprimere la glicoproteina Env è stata valutata tramite western blot utilizzando l’ anticorpo monoclonale αenv

71.2. L’analisi è stata effettuata sia sui fibroblasti trasdotti che sui non trasdotti, utilizzati come controllo negativo; il controllo positivo è rappresentato da cellule

della linea linfocitaria felina FL4, cronicamente infette con il ceppo Petaluma di FIV. La figura 4.1 mostra un esempio rappresentativo delle prove effettuate.

Come si vede, la glicoproteina Env viene espressa soltanto dai fibroblasti trasdotti e dalle cellule FL4, mentre la sua presenza non è rintracciabile nelle cellule non trasdotte.

1 2 3 4 5 6 M FL4

Figura 4.1: western blot effettuato con l’anticorpo monoclonale αenv 71.2.

4.5 Saggio CTL

Le linee di fibroblasti autologhi trasformati e trasdotti sono state utilizzate per l’allestimento di un saggio per la valutazione della risposta immunitaria cellulo-mediata. Esso prevede una fase di ristimolazione dei PBMC prelevati dagli animali tramite una loro incubazione per 5 giorni con fibroblasti autologhi

E

E

n

n

v

v

esprimenti Env; essa è stata effettuata con lo scopo di consentire l’espansione selettiva dei cloni istruiti al riconoscimento della glicoproteina presenti all’interno della popolazione di linfociti. Al termine dell’incubazione i PBMC ristimolati sono stati raccolti e contati e quindi nuovamente seminati su colture fresche di fibroblasti trasdotti. L’attività citotossica dei linfociti T è stata valutata misurando la diminuzione del numero di cellule GFP-positive presenti nella popolazione di fibroblasti.

Il saggio è stato effettuato a 2 settimane dal terzo inoculo di vettore; le prove eseguite sono state le seguenti:

• fibroblasti autologhi non incubati con i PBMC (controllo negativo);

• PBMC ristimolati su fibroblasti autologhi trasdotti e incubati in un rapporto

effector-target cells (E:T) di 10:1 con fibroblasti autologhi esprimenti Env; • PBMC ristimolati su fibroblasti autologhi non trasdotti (mock

ristimolazione) e incubati in rapporto E:T 10:1 con fibroblasti autologhi esprimenti Env;

• PBMC ristimolati su fibroblasti eterologhi trasdotti e incubati in rapporto E:T 10:1 con fibroblasti eterologhi trasdotti;

• PBMC mock ristimolati su fibroblasti eterologhi trasdotti e incubati in rapporto E:T 10:1 con fibroblasti eterologhi trasdotti.

Ogni prova è stata eseguita in triplicato; i risultati rappresentano una media dei valori ottenuti e sono riassunti nel grafico 4.4 sottoforma di diminuzione percentuale di fluorescenza rispetto al controllo negativo.

Diminuzione fluorescenza (+2 settimane) 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% BR CG BS BO dimin u zi o n

e % 10a1 autol ristim

10a1 autol mock stim 10a1 eterol ristim 10a1 eterol mock stim

Grafico 4.4: Analisi della diminuzione percentuale di fluorescenza delle varie popolazioni di fibroblasti, ciascuna rispetto al proprio controllo negativo, dopo

incubazione con i PBMC

Per quanto riguarda i tre animali vaccinati, i dati indicano una diminuzione della fluorescenza esclusivamente nella prova effettuata ristimolando i PBMC su fibroblasti autologhi trasdotti e quindi esprimenti l’antigene di interesse Env, mentre nelle altre prove effettuate non si evidenzia una significativa diminuzione di fluorescenza. Questi risultati non si riscontrano invece nel gatto di controllo, in cui la fluorescenza si mantiene a livelli pressoché simili in tutte le prove effettuate.

Questi dati sono stati utilizzati per calcolare la percentuale di lisi ottenuta nelle varie prove effettuate. Essa è stata quantificata calcolando la diminuzione della fluorescenza ottenuta nella prova effettuata con i PBMC ristimolati su fibroblasti autologhi trasdotti rispetto alla prova effettuata con PBMC mock ristimolati su fibroblasti autologhi. La formula utilizzata è la seguente:

% fluorescenza (PBMC mock stimol) - % fluorescenza (PBMC ristim) _{X 100}

In questo modo è stato possibile eliminare il contributo di una eventuale lisi aspecifica prodottasi durante il saggio. In accordo con i protocolli utilizzati per saggi di questo tipo, sono state ritenute specifiche lisi superiori al 10%.

I risultati sono riportati nel grafico 4.5.

Lisi specifica 2 settimane

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% BR CG BS BO % l isi

Grafico 4.5: Percentuali di lisi ottenute durante il saggio

Il grafico mostra la presenza di una lisi specifica per tutti e tre gli animali vaccinati, indicando quindi la presenza di una risposta CTL Env-specifica. Questa non è rintracciabile, invece, nel gatto di controllo, per il quale i valori di lisi sono al di sotto della soglia di significatività.

Il saggio è stato ripetuto a 18 settimane dal terzo inoculo di DNA (grafico 4.6).

Diminuzione fluorescenza (+18 settimane) 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% BR BS CG BO dimin u zi o n e % ristimolati 10:1 mock ristimolati 10:1 ristimolati 100:1 mock ristimolati 100:1

Grafico 4.6: Analisi della percentuale di fluorescenza, a 18 settimane dal terzo inoculo, delle varie popolazioni di fibroblasti dopo incubazione con i PBMC

Durante questo saggio non sono state ripetuti gli incroci eterologhi, dal momento che essi avevano dato esito negativo nell’esperimento precedente. E’ stata, invece, valutata l’esistenza di un effetto dose-risposta includendo anche prove con un E:T di 100:1.

I dati ottenuti indicano nei 3 gatti vaccinati una diminuzione di fluorescenza nelle prove effettuate con i PBMC ristimolati su fibroblasti esprimenti Env; tale diminuzione è accentuata se il rapporto E:T utilizzato è di 100:1. L’animale di controllo non mostra diminuzioni significative della fluorescenza in nessuna delle prove effettuate.

Le percentuali di lisi, riportate nel grafico 4.7, indicano che utilizzando un rapporto E:T di 10:1 nessun gatto esibisce una risposta CTL significativa. Effettuando il saggio con un rapporto di 100:1, invece, i livelli di lisi raggiunti nei tre animali vaccinati sono notevolmente più elevati e superano in tutti e tre la soglia di significatività. Nel gatto di controllo l’aumentato rapporto E:T

non comporta, invece, un incremento della lisi, la quale si mantiene intorno a valori simili a quelli raggiunti con il rapporto 10:1 e comunque al di sotto della significatività.

Lisi specifica 18 settimane

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% BR BS CG BO % l is i ristimolati 10:1 ristimolati 100:1

Grafico 4.7: Percentuali di lisi ottenute a 18 settimane dal terzo inoculo e con due diversi rapporti E:T

Con i dati ottenuti da queste due prove è stato possibile ricavare un grafico che riassume le variazioni della risposta CTL, registrata con un rapporto E:T di 10:1, nell’arco di tempo esaminato (grafico 4.8). Come si vede, la risposta CTL tende a diminuire a distanza di tempo dagli inoculi; a 18 settimane 2 gatti su 3 mostrano livelli al di sotto della soglia di significatività.

Risposta CTL Env-specifica 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 2 settimane 18 settimane % lisi BR BS CG BO

Grafico 4.8: Variazione dell’intensità della risposta CTL durante il periodo esaminato

Per confrontare l’efficacia della ristimolazione effettuata con i fibroblasti trasdotti, abbiamo deciso di ripetere il saggio ristimolando i linfociti con un metodo classico, ovvero utilizzando dei peptidi sintetici.

Il saggio è stato, quindi, ripetuto a 20 settimane dal terzo inoculo stimolando i PBMC con peptidi disegnati in modo da coprire l’intera sequenza codificante della proteina Env. Le cellule sono state incubate con un pool di circa 60 peptidi (concentrazione finale di 5µg/ml) diluiti in PBS per 5 giorni, quindi sono state raccolte e nuovamente incubate con i fibroblasti trasdotti per effettuare il saggio; come controllo una parte dei linfociti è stata incubata con un ugual volume del solo PBS. Il saggio è stato effettuato con due diversi rapporti E:T, 10:1 e 50:1. I risultati sono espressi nel grafico 4.9.

Diminuzione % fluorescenza -5% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% BR BS CG BO

PBMC ristim 10:1 PBMC ristim 50:1 PBMC non ristim 10:1 PBMC non ristim 50:1

Grafico 4.9: Diminuzione percentuale della fluorescenza registrata dopo ristimolazione con i peptidi Env

Come si vede dal grafico, il gatto BR non mostra alcuna diminuzione di fluorescenza, in alcuna delle prove effettuate; BS non mostra variazioni di fluorescenza quando è utilizzato il rapporto 10:1 mentre invece con il rapporto 50:1 mostra una bassa diminuzione. Il terzo animale vaccinato, invece, mostra diminuzioni di fluorescenza con entrambi i rapporti E:T. Il gatto di controllo esibisce basse variazioni che si mantengono costanti in tutte le prove effettuate.

Le percentuali di lisi calcolate per questo esperimento sono riportate nel grafico 4.10.

Percentuali di lisi (20 settimane) 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% BR BS CG BO % l is i PBMC ristim 10:1 PBMC ristim 50:1

Grafico 4.10: Lisi ottenute dopo ristimolazione con i peptidi

Dal grafico è possibile osservare che sia il gatto BR che il gatto di controllo non mostrano la presenza di alcuna lisi. Il gatto BS mostra una bassa percentuale di lisi solamente utilizzando il rapporto E:T 50:1, ma non si tratta di una lisi specifica. Il terzo animale vaccinato invece mostra la presenza di lisi con entrambi i rapporti utilizzati, ma solo con il rapporto 50:1 tale lisi è anche specifica e quindi indice della presenza di una risposta CTL diretta contro l’antigene.