Canali del K +

INTRODUZIONE

Canali del K ⁺

Ogni cellula è circondata da una membrana plasmatica che separa il citoplasma dall’ambiente extracellulare. La membrana plasmatica funge da barriera di permeabilità che consente alle cellule di mantenere una composizione citoplasmatica assai diversa da quella del liquido extracellulare ed inoltre permette loro di rispondere a stimoli chimici e fisici esterni. Il passaggio di ioni e molecole attraverso tale membrana a velocità controllata ha un ruolo fondamentale per la vita della cellula. Il movimento trans membrana dei tre maggiori cationi Na ⁺ , Ca ⁺ , K ⁺ e dell’anione Cl ^- , attraverso canali di membrana altamente selettivi, è un meccanismo utilizzato per eseguire o modulare le funzioni biologiche delle cellule viventi (Lawson, 1996).

I canali del K ⁺ appartengono ad una eterogenea e quasi ubiquitaria

famiglia di proteine di membrana, che permette selettivamente allo

ione K ⁺ di muoversi attraverso la membrana cellulare secondo il

gradiente elettrochimico, ad una velocità di 10 ⁶ -10 ⁸ ioni/s (Hille,

1992), partecipando alla regolazione di numerose funzioni cellulari

quali l’eccitabilità neuronale, il rilascio di neurotrasmettitori, la

secrezione ormonale, il tono della muscolatura liscia, l’attività

cardiaca (Kohler et al., 1996), la regolazione del volume cellulare e il trasporto elettrolitico epiteliale (Robertson e Steinberg, 1990).

In condizioni di riposo, in cellule sia eccitabili che non eccitabili, gli ioni K ⁺ sono distribuiti asimmetricamente sui due lati della membrana:

la concentrazione ionica intracellulare è circa 120-130mM, mentre quella extracellulare è circa 5mM; tale fattore risulta fondamentale nella generazione del potenziale di membrana (Quast, 1996).

Poiché il potenziale di equilibrio dello ione K ⁺ è pari a -90mV mentre il potenziale di riposo di una cellula è pari a -60mV, l’apertura del canale del potassio, e quindi il conseguente efflusso dello ione verso l’esterno della cellula, porta il potenziale della membrana verso valori più negativi, cioè la iperpolarizza (Lawson, 1996).

Questa iperpolarizzazione determina la chiusura dei canali del Ca ²⁺

VOCs, che sono canali selettivi per lo ione Ca ²⁺ regolati dal voltaggio

(VOCs = Voltage Operated Channel) e riduce la fuoriuscita dello ione

dai depositi intracellulari. Tutto ciò comporta una diminuzione della

concentrazione di Ca ²⁺ intracellulare libero che è il fattore

determinante per la contrazione della muscolatura liscia. Il calcio

infatti attiva una protein chinasi calcio-calmodulina dipendente, a cui

segue la fosforilazione della catena della miosina e l’interazione tra la

miosina fosforilata e l’actina che determina la contrazione (Ikebe et

al., 1988; Hai e Murphy, 1989; Means et al., 1991). In linea generale quindi l’attivazione di tali conduttanze al K ⁺ determina una stabilizzazione del potenziale di riposo della cellula ed una riduzione dell’efficacia degli “imput” eccitatori nelle cellule in cui sono espressi. Al contrario la chiusura dei canali del potassio causa la depolarizzazione della membrana, l’apertura dei canali del calcio voltaggio attivati e l’aumento della concentrazione citosolica di calcio, con una conseguente vasocostrizione (Sobey, 2001).

L’apertura di un canale del potassio ha come conseguenza la generazione di un flusso di ioni K ⁺ verso l’esterno della cellula (outward), ed è regolata da una grande quantità di stimoli tra i quali il cambiamento del voltaggio di membrana e la modifica dei livelli intracellulari di certi ioni, piccole molecole organiche e proteine (ATP, Ca ²⁺ ) (Ocana et al., 2004).

I canali al K ⁺ rappresentano un importante bersaglio per lo sviluppo di

terapie farmacologiche mirate a ridurre l’eccitabilità della membrana

plasmatica. L’attivazione dei canali al K ⁺ in numerosi tipi di cellule,

incluse quelle appartenenti alla muscolatura liscia ed i neuroni, porta

ad una iperpolarizzazione di membrana e ad una conseguente

attenuazione o ad una inibizione della generazione del potenziale

d’azione (Gribkoff et al., 2001; Shieh et al., 2000; Coghlan et al., 2001).

A livello della muscolatura liscia vascolare l’attività dei canali al K ⁺ è il principale fattore di regolazione del potenziale di membrana e quindi del tono vascolare. E’ stato messo in evidenza che la funzione di molti tipi di canali al K ⁺ è alterata nelle più importanti malattie cardiovascolari come l’ipertensione cronica, il diabete e l’aterosclerosi. La vasocostrizione e la mancata capacità di un’arteria di dilatarsi sono probabili conseguenze di un’alterata funzionalità dei canali al K ⁺ nei vasi sanguigni, e può essere dovuto ad un cambiamento nel numero, nella conduttanza e/o nella probabilità di apertura dei canali. In alcuni casi l’incremento della funzionalità dei canali può aiutare a compensare l’aumento del tono vascolare (Sobey, 2001).

In particolare l’apertura dei canali al K ⁺ localizzati sulla membrana della cellula muscolare liscia vascolare determina la fuoriuscita di tale ione causando iperpolarizzazione di membrana, chiusura dei canali al Ca ²⁺ voltaggio dipendenti, diminuzione dell’ingresso di Ca ²⁺ nella cellula e vasodilatazione. Al contrario la chiusura dei canali al K ⁺ provoca depolarizzazione di membrana, apertura dei canali al Ca ²⁺

voltaggio dipendenti, aumento della concentrazione citosolica di Ca ²⁺

e vasocostrizione (Nelson and Quayle, 1995). Le risposte vasorilascianti, oltre che essere indotte dall’attivazione di canali del potassio attraverso il voltaggio e il Ca ²⁺ , possono essere indotte anche da agenti endogeni come le specie reattive dell’ossigeno (Sobey et al., 1998), ossido d’azoto (Bolotina et al., 1994; Da Silva-Santos e Assurey, 1999; Sobey e Faraci, 1999) e probabilmente da fattori iperpolarizzanti endotelio derivati (Feletou e Vanhoutte 1999). E’

stato dimostrato un coinvolgimento indiretto totale o parziale dei canali del potassio nella risposta a varie sostanze ad azione vasodilatatoria come per esempio calcitonina (Nelson et al., 1990), agonisti β 1 -adrenergici (Dumas et al., 1990), e adenosina (Merkel et al., 1992; Nakhostine e Lamontagne 1993).

Fig.1 - Eventi correlati all’attivazione e inattivazione dei canali al potassio a

Struttura generale dei canali al K ⁺

I canali del potassio, pur appartenendo ad una famiglia eterogenea di proteine di membrana, presentano una serie di caratteristiche strutturali comuni:

• una via di permeazione acquosa (poro) che permette agli ioni K ⁺ di fluire attraverso la membrana;

• un filtro di selettività che seleziona il K ⁺ come specie ionica permeante;

• meccanismi di “gating” che servono a far passare il canale dalla conformazione aperta a quella chiusa e viceversa (Hille, 1992).

Il passaggio degli ioni è reso possibile grazie alla subunità contenente il poro corrispondente alla subunità principale o subunità α. In alcuni casi insieme alla subunità α si trova associata una subunità ausiliaria detta subunità β che ha la funzione di modulare le caratteristiche di espressione e/o farmacologiche.

La subunità α rappresenta il principale sito di legame per gli apritori e

i bloccanti del canale al K ⁺ , sebbene esistano eccezioni in cui il sito di

legame dei ligandi risiede all’interno della subunità ausiliaria

(Papazian et al., 1987).

Classificazione dei canali al K ⁺

Alla eterogenicità delle funzioni dei canali del K ⁺ precedentemente esposte corrisponde una altrettanto vasta gamma di strutture molecolari che assolvano alla funzione di trasporto del K ⁺ . Sebbene le strutture molecolari che permettono il passaggio del K ⁺ siano generalmente più elementari rispetto a quelle dei canali del Na ⁺ e del Ca ²⁺ , l’assenza di ligandi ad elevata affinità (come la tetradotossina per i canali del Na ⁺ ) o di tessuti in cui l’espressione proteica fosse particolarmente elevata (come il muscolo scheletrico per i canali del Ca ²⁺ ) ne ha ritardato la caratterizzazione molecolare. I canali ionici possono essere classificati, in base alla loro selettività ionica, alla loro conduttanza, alle caratteristiche di apertura, alla cinetica o alla farmacologia che li caratterizza (Lawson, 1996). I canali del potassio sono generalmente classificati sfruttando i patterns biochimici, in base ai meccanismi di reazione (attivazione/inattivazione) o in base ai loro meccanismi di apertura (Calderone, 2002).

La nomenclatura standard che è stata adottata per i canali del potassio

negli ultimi anni è basata su relazioni filogenetiche, i canali che

presentavano almeno il 65% di omologia nella sequenza venivano

assegnati alla stessa sottofamiglia. Inoltre è stato utilizzato anche un

altro sistema di nomenclatura, il sistema KCN sviluppato dalla HUGO (Human Genome Organisation) (White et al., 1997).

Le recenti scoperte che hanno permesso di caratterizzare in modo

migliore i vari canali del potassio hanno messo in luce l’esigenza di un

nuovo tipo di classificazione che tenga in considerazione più

parametri.

Classificazione genetica dei canali al K ⁺

Negli ultimi anni la ricerca nel campo della biologia molecolare ha scoperto più di 200 geni (dei quali settanta umani) codificanti i canali al K ⁺ . Questa scoperta è stata utilizzata per classificare i canali in base a criteri genetici, mettendo in relazione la loro struttura o una specifica subunità al gene corrispondente (Kohler et al., 1996).

Gene Canale

KCNK1-KCNK9 (TWIK, TREK, TRAAK, TASK)

Canali two-pore o K IR

KCNA1-KCNA7 (Shaker, K v 1)

K v

KCNB1-KCNB2 (Shab, K v 2)

K v

KCNC1-KCNC4 (Shaw, K v 3)

K v

KCND1-KCND3 (Shal, K v 4)

K v

KCNJ8 Subunità K IR 6.1 dei canali K ATP KCNJ11 Subunità K IR 6.2 dei canali K ATP

ABCC8 Subunità SUR1 dei canali K ATP

ABCC9 Subunità SUR2 dei canali K ATP

KCNN1-KCNN4 SK Ca e IK Ca

KCNMA1 subunità α BK Ca

KCNMB1 subunità β BK Ca

Classificazione strutturale dei canali al K ⁺

Questa classificazione prende in considerazione il numero dei domini transmembrana e dei pori che formano i vari tipi di canale suddivisi in 3 famiglie principali:

a) canali contenenti 6 domini transmembrana ed un singolo poro;

b) canali contenenti 2 domini transmembrana e un singolo poro;

c) canali contenenti 4 domini transmembrana e 2 regioni poro.

La sequenza tripeptidica Gly-Tyr(Phe)-Gly presente nella subunità α è comune al poro di tutti i tipi di canale e costituisce la sequenza principale per determinare la selettività verso lo ione K ⁺ (Papazian et al., 1987).

a) Canali ad un poro e 6 domini transmembrana

Fanno parte di questa famiglia i canali al K ⁺ voltaggio-dipendenti e

Ca ²⁺ -dipendenti. Sono proteine oligomeriche costituite da 4 subunità

α, ognuna contenente 6 segmenti transmembrana (S1-S6). Il segmento

transmembrana S4 contiene residui carichi positivamente e

rappresenta una componente del sensore di voltaggio. La sequenza

tripeptidica Gly-Tyr(Phe)-Gly è situata all’interno dei segmenti S5 e

S6; quattro di questi segmenti, ognuno derivante da una subunità α,

vanno a formare il poro di conduzione del K ⁺ .

Fig.2 - Canale ad un poro e sei domini transmembrana

b) Canali ad un poro e 2 domini transmembrana

I canali Kir (inward rectifiers) appartengono ad una famiglia costituita da 4 subunità, ognuna delle quali contiene 2 domini transmembrana M1 e M2 e una regione poro compresa tra i due segmenti. Questi canali conducono la corrente di ioni K ⁺ preferenzialmente in entrata (Coghlan et al., 2001). La rettificazione verso l’interno è dovuta al blocco del flusso verso l’esterno esercitato dagli ioni Mg ²⁺ e da alcune poliammine (spermina e spermidina) (Ficker et al., 1994). Sebbene questi canali siano organizzati come omotetrameri, sono state descritte disposizioni ottameriche in seguito alla combinazione con subunità ausiliarie (Aguilar-Bryan et al., 1998).

S1 S2 S3 S4

+

S5 S6

+

H

N

p

Spazio extracellulare

Spazio intracellulare Membrana

COO

Fig.3 - Canale ad un poro e due domini transmembrana

c) Canali con 2 regioni poro e 4 domini transmembrana I canali twin-pore, codificati dai geni TWIK, TREK, TRAAK e TASK, sono dei deboli inward rectifier con 4 domini transmembrana (M1-M4) e 2 regioni poro. I residui Gly-Tyr(Phe)-Gly, appartenenti alla sequenza selettiva per il K ⁺ , sono presenti nella prima regione poro, mentre sono rimpiazzati da Gly-Phe-Gly oppure Gly-Leu-Gly nella seconda regione poro. I membri di questa famiglia mancano del segmento transmembrana S4, dove risiede il sensore del voltaggio, caratteristico dei canali voltaggio-dipendenti (Coghlan et al., 2001).

M1 M2

+

H

N COO

Membrana P

Spazio extracellulare

Spazio intracellulare

Fig.4 - Canale con due regioni poro e quattro domini transmembrana

Classificazione funzionale dei canali al K ⁺

E’ comunque ancora largamente utilizzata una classificazione funzionale basata sui meccanismi di attivazione/inattivazione dei canali al K ⁺ (sensibilità al voltaggio; attivazione indotta dal Ca ²⁺ ; inattivazione ATP-mediata; etc.) (Kohler et al., 1996) e che li suddivide in 3 classi principali:

• Canali del K ⁺ voltaggio-dipendenti (K V ),

• Canali del K ⁺ ATP-dipendenti (K ATP ),

• Canali del K ⁺ Ca ²⁺ -dipendenti (K Ca ).

+

H

N COO

Spazio intracellulare Spazio intracellulare

+

H

N COO

Spazio extracellulare

P P

M1 M2 M3 M4

Spazio extracellulare

Membrana

Canali al K ⁺ voltaggio-dipendenti

I canali al K ⁺ voltaggio-dipendenti sono responsabili delle proprietà elettriche delle cellule in quanto capaci di controllare la fase di caduta del potenziale d’azione nelle cellule eccitabili, come i miociti cardiaci e le cellule nervose. Nelle cellule non eccitabili invece possono contribuire alla regolazione del volume cellulare, alla secrezione ormonale e all’attivazione di fattori di crescita (Coghlan et al., 2001).

La differenza di potenziale ai lati della membrana determina l’apertura o la chiusura dei canali voltaggio-dipendenti, a cui fa seguito una modifica del voltaggio della membrana stessa. I canali sono quindi un mezzo mediante il quale la membrana opera su se stessa un controllo a feed-back, proprietà molto importante ai fini della generazione di impulsi elettrici (Coghlan et al., 2001).

Il principio che sta alla base della regolazione dell’apertura dei canali è semplice: quando un canale voltaggio-dipendente si apre, gli amminoacidi carichi, chiamati “charges gating” (presenti nel segmento trans membrana S6), si muovono attraverso il campo elettrico della membrana, accoppiando il lavoro elettrico al processo di apertura.

La “charges gating”, ovvero la carica che si muove all’interno della

membrana, è stata misurata ed è risultata essere equivalente a quella

posseduta da circa 14 elettroni. La maggior parte di questa carica è attribuibile a quattro residui di Arginina presenti in ogni subunità del canale, ciascuna Arginina ha una carica simile a quella di un elettrone.

Attualmente sono state individuate 9 famiglie di canali voltaggio- dipendenti (K V 1-K V 9), grazie a studi effettuati su geni omologhi del mutante di “Drosophila”: Shaker, Shal, Shab, Shaw (Chandy e Gutman, 1995). Tali geni espressi negli oociti di Xenopus, mostrano diverse velocità di attivazione/inattivazione. In particolare Shaker e Shal vengono inattivati rapidamente, mentre Shab e Shaw erano riconducibili ai canali “delayed rectifier”. I geni Shaker, Shab, Shaw, Shal sono presenti anche nei mammiferi dove prendono il nome di K V 1, K V 2, K V 3, K V 4. La nomenclatura utilizzata è quella di Chandy secondo la quale la lettera K sta per geni dei canali al potassio, V per voltaggio dipendenza, il primo numero corrisponde alla sottofamiglia e il secondo al numero del gene.

Dal punto di vista funzionale i canali al K ⁺ voltaggio-dipendenti si dividono in:

• canali K ^A , o “transient”: sono canali che si aprono rapidamente

in risposta alla depolarizzazione e si inattivano rapidamente se

viene mantenuta la depolarizzazione. Hanno una conduttanza di

15-20 pS e sono coinvolti nella generazione degli impulsi nelle cellule pace-maker.

• canali K ^V o “delayed rectifier”: rispondono alla depolarizzazione più lentamente rispetto ai precedenti, alcuni inoltre non si attivano del tutto. Hanno una conduttanza di 10- 65 pS e hanno un ruolo fondamentale nella ripolarizzazione della membrana cellulare (Hille, 1992). Recentemente è stato identificato un canale K V 1.3 sensibile alla margatossina nei mitocondri dei linfociti T. E’ stato dimostrato che questo canale è presente sia nelle membrane plasmatiche che in quelle mitocondriali e si ritiene che a livello mitocondriale possa rappresentare un importante fattore di trasduzione di segnali apoptotici (Szabo et al., 2005).

• canali K ^IR o “inward rectifier”: diversamente dai precedenti, permettono al K ⁺ di fluire sia verso l’esterno che verso l’interno della cellula. Hanno un conduttanza di 5-30 pS e determinano la nascita del potenziale d’azione in numerose cellule, tra le quali i miociti cardiaci.

Nonostante l’alta variabilità genetica e funzionale tutti i canali K V

presentano le stesse caratteristiche strutturali: sono proteine

oligomeriche formate da quattro subunità.

Ogni subunità è costituita da 6 domini transmembrana (denominati S 1 - S 6 ) e una regione poro localizzata nel linker tra i segmenti S 5 -S 6

(chiamata regione P). Alla formazione del poro concorrono anche il linker S 4 -S 5 (Slesinger et al., 1993), non che la regione distale di S 6 e la porzione prossimale dell’estremità C-Terminale (Lopez et al., 1994;

Taglialatela et al., 1994), inoltre la subunità presenta le estremità ammino- e carbossiterminale situate sul lato citoplasmatico della membrana.

L’analisi strutturale di un canale del potassio caratterizzato sembra confermare tali conclusioni (Doyle et al., 1998).

La regione responsabile del processo di attivazione voltaggio- dipendente è localizzata nel segmento transmembrana S 4 (Papazian et al., 1991) che è carico positivamente per una massiccia presenza di arginina e il conferimento delle proprietà di rapida inattivazione è attribuibile dall’estremità N-terminale di ciascuna subunità (Hoshi et al., 1990). Tale tipo di inattivazione, volta al mantenimento di uno stato depolarizzato, viene pertanto definita “N-type”, per distinguerla da quella indipendente dalla regione N-terminale, definita pertanto

“C-type” (Choi et al., 1991), che presenta proprietà funzionali

caratteristiche.

In prossimità dell’estremità N-terminale della proteina troviamo un dominio citoplasmatico chiamato T 1 che è coinvolto nell’assemblamento delle subunità del canale, nella modulazione della sensibilità del canale al voltaggio e nell’interazione con le subunità ausiliarie.

Queste subunità accessorie sono state caratterizzate per e loro influenze sul processo di inattivazione rapida e sull’espressione di membrana (Shi et al., 1996). L’esistenza di tali subunità, insieme alla possibilità, finemente regolata da specifici determinanti molecolari, di formare canali eteromultimerici mediante l’assemblaggio di subunità codificate da geni distinti simultaneamente espressi nella stessa cellula (Covarrubias et al., 1991; Chen et al., 1996), aumenta ulteriormente la varietà del corredo di correnti del K ⁺ di cui ciascun tipo cellulare può dotarsi.

Nell’ambito dei canali di tipo K V sono stati più recentemente

caratterizzate nuove famiglie geniche, tra le quali EAG (“ether-a-

gogo”), ERG (“ether-a-gogo related gene”), e KCNQ1-5, che

svolgono un ruolo fondamentale sia a livello del SNC che a livello

cardiaco (in particolare ERG e KCNQ1 rappresentano le basi

molecolari delle correnti di ripolarizzazione cardiache denominate

rispettivamente I Kr ed I Ks ), come confermato dell’espressione clinica

di patologie umane su base congenita o acquisita che coinvolgono specificamente la funzione di tali canali (Lehmann-Horn et al., 1999).

Lo studio dei canali del potassio voltaggio dipendenti si basa su tecniche genetiche, che vedono l’utilizzo di oociti di Xenopus e mutanti di Drosophila, e su l’utilizzo di bloccanti dei canali del potassio tra i quali il principale è la Caribdotossina, un peptide estratto dal veleno dello scorpione Leiurus quinquestriatus, che è in grado di bloccare il canale con affinità dell’ordine nanomolare.

Altre molecole in grado di bloccare i canali sono la 4-amino piridina e il tetraetilammonio (TEA), che però non mostrano selettività per un tipo particolare di canale e sono in grado di bloccare sia i K V che i K Ca .

I canali voltaggio-dipendenti K V , appartenenti alla muscolatura liscia vascolare, sono attivati da una depolarizzazione di membrana, approssimativamente tra -35 e -50mV, per questo motivo si pensa che abbiano la funzione di contrastare sia il processo di depolarizzazione che la vasocostrizione (Nelson and Quayle, 1995).

La 4-amminopiridina è largamente utilizzata come bloccante farmacologico dei canali K V . Essa causa una depolarizzazione arteriosa e una conseguente vasocostrizione (Quan e Sobey, 2000).

cAMP (Zhao et al., 1998) e NO/cGMP (Zhao et al., 1997) possono

attivare questi canali in alcuni vasi sanguigni, mentre la protein- chinasi C può provocare una loro inibizione (Aiello et al., 1996).

Sebbene i canali K ⁺ voltaggio-dipendenti siano stati i primi ad essere clonati e siano serviti a spiegare la relazione struttura-attività dei canali al K ⁺ , molti modulatori organici, compresi il tetraetilammonio e la 4-amminopiridina, hanno una debole attività e non sono selettivi.

Le tossine peptidiche, che si legano con alta specificità per bloccare il

poro del canale o per alterarne le modalità di apertura, si sono rivelate

fondamentali per analizzare la struttura e la funzione dei canali stessi

(Fletcher et al., 1999). Tra queste sostanze troviamo il veleno delle

anemoni di mare e la Caribdotossina, un peptide di 37 amminoacidi

isolato dal veleno dello scorpione Leiurus quinquestriatus hebraeus,

che riesce a bloccare alcuni canali K V a concentrazioni nanomolari.

Canali del K ⁺ ATP-dipendenti

I canali K ATP sono stati descritti la prima volta nei cardiomiociti e successivamente sono stati trovati in molti altri tessuti come le cellule endocrine, il tessuto pancreatico, le cellule muscolari scheletriche e lisce ed i neuroni. La loro attività è regolata dalle variazioni intracellulari nucleotidiche, principalmente ATP che ne inibisce la funzione e Mg-ADP che invece la stimola, in modo da correlare l’eccitabilità elettrica con lo stato metabolico della cellula (Mannhold, 2004). Quando la fosforilazione cellulare è elevata dominano gli effetti inibitori ed i canali rimangono chiusi, ma appena il metabolismo diminuisce si ha una stimolazione e una conseguente apertura dei canali (Nichols, 2006). L’attività dei canali K ATP può essere modulata anche dai fosfolipidi di membrana, in particolare dal fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP 2 ) che va ad antagonizzare l’inibizione dovuta all’ ATP (Shyng e Nichols, 1998).

Struttura dei canali K ATP

I canali K ATP sono costituiti da una combinazione unica di 2 diverse

proteine: K IR 6, appartenente alla famiglia dei canali “inward rectifier”,

e SUR, recettore per le sulfaniluree e appartenente alla famiglia delle

ABC-Protein (ATP-binding cassette). L’inibizione da parte dell’ATP

è dovuta all’interazione con la subunità K IR 6, mentre l’attivazione da parte del Mg-nucleotide è dovuta all’interazione con la subunità SUR.

Nel genoma dei vertebrati esistono 2 geni K IR 6 (KCNJ8,K IR 6.1 e KCNJ11,K IR 6.2) e 2 geni SUR (ABCC.8,SUR1 e ABCC.9,SUR2) e dalla loro combinazione si ottengono tutte le varianti dei canali K ATP

(Yamada et al., 1997). Esperimenti biofisici e biochimici hanno permesso di stabilire che 4 subunità K IR 6 vanno a formare il poro del canale ed ogni subunità K IR 6 è associata ad una subunità SUR, costituendo un canale ottamerico (Shyng e Nichols, 1997; Clement et al., 1997).

La subunità K IR consiste di 2 segmenti transmembrana, M1 e M2, una regione poro extracellulare e 2 regioni ammino e carbossi-terminali intracellulari. Questa subunità è responsabile della permeazione ionica e rappresenta il sito primario per l’inibizione dei canali K ATP dovuta all’ATP (Aguilar-Bryan et al., 1998; Ashcroft, 2000). I canali contenenti la subunità K IR 6.1 hanno una conduttanza del singolo canale intorno a 35 pS, mentre quelli contenenti K IR 6.2 intorno a 70 pS (Teramoto, 2006).

La subunità SUR presenta due isoforme, SUR1e SUR2, le quali sono

codificate da 2 geni contenenti rispettivamente 39 e 38 esoni. Lo

splicing alternativo dell’esone 38 genera 2 varianti di splicing SUR2A

e SUR2B (Aguilar-Bryan et al., 1998; Ashcroft, 2000). I 42 residui aminoacidici collocati all’estremità carbossi-terminale della subunità SUR2B differiscono da quelli della SUR2A, ma presentano un’elevata omologia con i residui della SUR1 (Isamoto et al., 1996).

Come le altre componenti della sottofamiglia C delle ABC-protein, le subunità SUR1 e SUR2 contengono ciascuna i domini TMD1 e TMD2, costituiti da 6 eliche transmembrana e un dominio TMD0 all’

estremità N-terminale costituito da 5 eliche transmembrana. Queste subunità comprendono anche un sito di legame nucleotidico NBF1 tra i domini TMD1 e TMD2 e un secondo sito NBF2 dopo TMD2. La subunità SUR conferisce sensibilità verso la maggior parte degli apritori dei canali al potassio e verso le sulfaniluree.

La co-espressione delle subunità SURs con le subunità K IR 6.1 o

K IR 6.2 porta a canali K ATP con diverse caratteristiche biofisiche e

farmacologiche. I canali K ATP delle cellule β-pancreatiche sono

composti da K IR 6.2 e SUR1; tale combinazione è la più diffusa anche

nei neuroni. A livello cardiaco si pensa che i canali siano costituiti da

K IR 6.2 e SUR2A, mentre SUR2B in associazione con K IR 6.1 o K IR 6.2

va a costituire i canali K ATP delle cellule muscolari lisce (Aguilar-

Bryan et al., 1998; Ashcroft, 2000).

Fig.5a - Struttura canale K ATP

Fig.5b - Disposizione delle subunità del canale K ATP

Numerosi ligandi endogeni agiscono sull’attività dei canali K ATP : ATP (in presenza o in assenza di Mg ²⁺ ) ha un azione inibitoria, mentre PIP 2

stimolatoria, grazie ad una diretta interazione con la subunità K IR 6.2.

Le sulfaniluree inibiscono i canali mentre gli apritori dei canali del K ⁺ li attivano tramite interazione con la subunità SUR. Inoltre, in presenza di Mg ²⁺ , ATP e ADP possono aprire il canale attraverso l’interazione con i siti NBF appartenenti alla subunità SUR.

L’inibizione da parte dell’ ATP, dovuta al legame con K IR 6.2 e l’attivazione da parte di Mg ²⁺ -nucleotide è quasi sicuramente il meccanismo principale di regolazione del canale (Nichols, 2006).

I canali K ATP dei diversi distretti tissutali non esibiscono la stessa

sensibilità nei confronti di molecole modulatrici; il loro sito di legame

si trova sulla subunità accessoria SUR, che ha la funzione di recettore

per la maggior parte degli attivatori e dei bloccanti dei canali (Ashcroft e Gribble, 2000).

Sono stati identificati numerosi composti di sintesi in grado di attivare i canali K ATP (KCO s ) e appartengono a diverse classi strutturali:

benzopirani (levocromakalim), cianoguanidine (pinacidil), benzotiadiazine (diazossido), piridil-nitrati (nicorandil), tioformammidi (aprikalim), e pirimidine solfato (minoxidil solfato). Il diazossido si differenzia dagli altri apritori dei canali in quanto è l’unico composto che si lega con affinità analoga alle due isoforme SUR1 e SUR2B; inoltre provoca rilasciamento della muscolatura liscia vascolare e inibisce la secrezione insulinica con la stessa potenza (Mannhold, 2004). Queste sue caratteristiche ne limitano l’uso in terapia per i prevedibili effetti collaterali dovuti alla mancanza di selettività tissutale, ma allo stesso tempo lo rendono uno strumento importante per la sintesi di nuovi composti selettivi verso i canali K ATP

di un determinato tessuto.

A livello della muscolatura liscia vascolare i canali del potassio ATP-

dipendenti sono inibiti dall’ATP intracellulare e per questo hanno una

probabilità di aprirsi molto bassa nella maggior parte delle cellule in

condizioni normali. La glibenclamide, che è largamente utilizzata

come inibitore selettivo dei canali K ATP , generalmente non ha effetto

sul potenziale di membrana delle cellule né sul tono vascolare.

Sostanze che possono indurre un rilasciamento vascolare glibenclamide-sensibile, grazie all’attivazione diretta dei canali K ATP , includono cromakalim, levocromakalim, aprikalim, nicorandil e pinacidil. Questo fenomeno stabilisce che i canali K ATP sono presenti nella muscolatura liscia e possono essere attivati per influenzare il potenziale di membrana e il tono vascolare (Quayle et al., 1997;

Faraci e Heistad, 1998).

Sempre a livello della muscolatura liscia numerose molecole endogene come CGRP (calcitonin gene-related peptide) e adenosina attivano i canali K ATP promuovendo un’iperpolarizzazione di membrana e un vasorilasciamento. Al contrario noradrenalina, 5HT, neuropeptide Y, etc. e vasocostrittori come angiotensina II, endotelina-1, etc. inibiscono i canali provocando una depolarizzazione e una vasocostrizione (Quayle et al., 1997).

Per questo motivo la modulazione dei canali K ATP consente una fine

regolazione della contrattilità della muscolatura liscia (Teramoto,

2006).

Canali del K ⁺ Ca ²⁺ -dipendenti

I canali del K ⁺ Ca ²⁺ -dipendenti sono una famiglia eterogenea di canali del potassio che si attivano in seguito all’aumento della concentrazione libera di Ca ²⁺ nel citosol e, in alcuni casi, al cambiamento del voltaggio di membrana. Questi canali sono coinvolti nella neurosecrezione, nell’eccitabilità neuronale e nella genesi del potenziale d’azione ma soprattutto sono in grado di operare un potente controllo a feed-back del tono vascolare. Questo è reso possibile dal fatto che il calcio presente a livello citosolico (principale responsabile del tono vascolare) determina l’apertura dei canali K Ca e il conseguente efflusso di ioni K ⁺ verso l’esterno della cellula con una iperpolarizzazione della membrana con conseguente chiusura dei canali del Ca ²⁺ voltaggio-dipendenti e interruzione del flusso dello ione.

La famiglia dei canali K Ca viene suddivisa in tre sottofamiglie sulla base delle caratteristiche biofisiche e della conduttanza dei singoli canali:

• SK ^Ca : canali a bassa conduttanza (Small), 2-25pS

• IK ^Ca : canali a conduttanza intermedia (Intermediate), 25-100pS

• BK ^Ca o Maxi-K: canali ad alta conduttanza (Big), 100-300pS

(Wallner et al., 1999).

Canali SK Ca

Questi canali sono stati individuati in numerosi tipi di cellule che comprendono i neuroni simpatici, la muscolatura liscia intestinale e della vescica, gli epatociti e gli adipociti bruni (Galanakis et al., 1996). Sono attivati dalle variazioni di concentrazione dei livelli intracellulari di Ca ²⁺ , mentre risultano insensibili al voltaggio, e possiedono una conduttanza unitaria di circa 2-25pS. Nelle cellule eccitabili i canali SK Ca sono responsabili della lenta post- iperpolarizzazione che spesso segue i potenziali d’azione.

Sono stati identificati tre sottotipi di canali SK1, SK2 e SK3 che mostrano un elevato grado di omologia strutturale e sensibilità al Ca ²⁺

(Kholer et al., 1996). L’architettura della subunità α che costituisce questi canali è molto simile a quella dei canali del potassio voltaggio- dipendenti: possiede infatti sei domini transmembrana (S1-S6), una regione P e le estremità N- e C-terminali sul lato citoplasmatico della membrana. Il canale funzionale è formato da quattro subunità α (Vergara et al., 1998; Vogalis et al., 2003).

Tuttavia i canali SK, a differenza dei K V , presentano il quarto dominio transmembrana solo leggermente caricato e sono voltaggio insensibili.

Questi canali possiedono però un dominio C-terminale aggiuntivo

chiamato CaMBD, calmodulin binding domain, che permette al canale

di interagire con la calmodulina, mediatore ubiquitario dei processi Ca ²⁺ -dipendenti, ed essere così regolato dalla concentrazione di Ca ²⁺

(Roosild et al., 2004).

SK2 e SK3 sono apamina-sensibili; l’esistenza di canali SK apamina sensibili e insensibili ci suggerisce che lo sviluppo di agenti selettivi verso un sottotipo di canale è realizzabile.

La modulazione di SK1 e SK2 sembra essere importante nei disturbi che coinvolgono una perdita di elasticità sinaptica, ad esempio la perdita di memoria e dell’apprendimento dovuta all’età come nel morbo di Alzhaimer.

I canali SK Ca , in particolare SK2 e SK3, sono coinvolti anche nell’innervazione e nel controllo della motilità del tratto gastrointestinale e genitourinario, dove l’iperpolarizzazione e il rilasciamento sono mediati dalle correnti transitorie verso l’esterno dovute alla presenza di canali BK Ca e SK Ca (Herrera et al., 2000; Kong et al., 2000). Studi effettuati su SK3 evidenziano che questi canali possono rappresentare target terapeutici per la cura dell’apnea notturna e per regolare le contrazioni uterine durante il parto.

Si pensa che modulatori dei canali SK Ca possano essere utili nel

trattamento di malattie quali la distrofia muscolare miotonica, le

alterazioni della motilità intestinale, i disturbi della memoria,

l’epilessia, la narcolessia e le intossicazioni da alcool (Campos Rosa et al., 2000).

Si conoscono 3 classi di bloccanti dei canali SK Ca : tossine peptidiche naturali come l’apamina e la scillatossina; bloccanti derivati del bis- quinolinio; e bloccanti neuromuscolari come la tubocurarina.

(Coghlan et al., 2001).

Canali IK Ca

Nonostante non sia stata ancora ben descritta, la struttura dei canali IK Ca sembra avere alta omologia con quella dei canali SK Ca (Vergara et al., 1998; Vogalis et al., 2003).

Sono stati identificati due tipi di canali: i canali IK sensibili al voltaggio e i canali insensibili al voltaggio.

I canali insensibili al voltaggio sono stati individuati nei globuli rossi di varie specie animali. E’ stato attualmente identificato un solo gene che codifica per i canali IK, questo canale mostra un’attivazione calcio-dipendente calmodulina-mediata (Ishii et al., 1997; Joiner et al., 1997; Logdson et al., 1997).

Attraverso studi effettuati nei linfociti T è stato possibile identificare

un sito ad elevata affinità per la caribdotossina, che era inizialmente

associata con i canali al potassio voltaggio-dipendenti (Kv1.3)

(Deutsch et al., 1991). Studi ulteriori hanno reso possibile la dimostrazione che la caribdotossina possiede un’elevata affinità anche nei confronti dei canali IK dei linfociti T (Schlichter et al., 1993). Sia i canali IK che i Kv1.3 sono coinvolti nella regolazione e nella proliferazione dei timociti; particolarmente è stato dimostrato che i canali IK hanno un ruolo fondamentale nell’influsso di Ca ²⁺ nei timociti, necessario per la proliferazione cellulare.

Gli antagonisti dei canali IK hanno un potenziale terapeutico come

modulatori dei timociti e degli eritrociti. Bloccanti non selettivi come

il clotrimazolo hanno mostrato effetti antiproliferativi nei linfociti sia

in vivo che in vitro (Jensen et al., 1999). I bloccanti dei canali IK sono

meglio caratterizzati come modulatori degli eritrociti per il trattamento

dell’anemia. Si pensa infatti che inibiscano la disidratazione dei

globuli rossi e di conseguenza tali composti sono stati proposti in

terapia per la cura dell’anemia falciforme (Goodman et al., 1998). Il

clotrimazolo è un inibitore dei canali IK anche a livello dei globuli

rossi e per questo motivo è stato identificato come potenziale farmaco

per il trattamento dell’anemia falciforme (Brugnara et al.,1993).

Canali BK Ca

I canali BK Ca , chiamati anche Maxi-K, sono largamente espressi sia nelle cellule eccitabili che in quelle non eccitabili, dove sono coinvolti nel controllo di numerose funzioni cellulari. Nel sistema nervoso partecipano alla formazione dei potenziali d’azione e regolano sia l’eccitabilità neuronale che il rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre sono implicati nel controllo a feed-back del tono vascolare, nel controllo della secrezione neuroendocrina, nei meccanismi di trasduzione di alcuni segnali cellulari (Kaczorowski et al., 1996;

Nelson et al., 1995; Toro et al.,1998), nella regolazione della contrattilità muscolare e nella modulazione del tono bronco-tracheale, uterino e della muscolatura gastro-intestinale (Perez e Toro, 1994;

Kume et al., 1995; Vogalis 2000). Grazie all’elevata conduttanza

(100-250pS), l’attivazione di questi canali ha un forte effetto sul

potenziale di membrana. I canali BK si distinguono da tutti gli altri

canali al potassio per la loro elevata sensibilità sia alla concentrazione

intracellulare di Ca ²⁺ sia al voltaggio: infatti sia l’incremento della

concentrazione intracellulare di calcio, sia la depolarizzazione di

membrana promuovono l’attivazione dei canali. Le suddette

caratteristiche rendono questi canali dei regolatori ideali, a feed-back

negativo, in molti tipi di cellule (Ghatta et al., 2006), provocando un

efflusso di ioni K ⁺ che porta ad un’iperpolarizzazione di membrana, la quale si oppone all’entrata di ioni Ca ²⁺ (Hille, 1992).

A livello della muscolatura liscia vascolare il processo di contrazione è mediato da un incremento dei livelli intracellulari di Ca ²⁺ libero.

L’attivazione della protein chinasi, calcio-calmodulina dipendente, è il primo step degli eventi biochimici che portano alla contrazione della cellula muscolare, attraverso l’attivazione dell’ATPasi delle catene di miosina e l’interazione tra la miosina fosforilata e l’actina (Means et al., 1991). Una depolarizzazione di membrana delle cellule induce l’apertura dei canali al Ca ²⁺ voltaggio-dipendenti, seguita da un aumento della concentrazione intracellulare di Ca ²⁺ libero e la conseguente contrazione. L’incremento di Ca ²⁺ libero può essere visto come il meccanismo principale per agenti vasocostrittori, al contrario composti che ne riducono la concentrazione promuovono la vasodilatazione (Quast, 1996).

Studi sperimentali hanno evidenziato che i canali BK rappresentano nel sistema vascolare la più importante componente per la corrente di efflusso del K ⁺ (Volk et al., 1991).

Il voltaggio e i livelli di Ca ²⁺ non sono gli unici meccanismi coinvolti

nell’apertura dei canali BK: il cGMP attiva i canali BK appartenenti

alla muscolatura liscia vascolare, attraverso il coinvolgimento di una

protein chinasi cGMP dipendente (Taniguchi et al., 1993). La loro apertura può essere dovuta anche al GMP, alla fosforilazione mediata dal cAMP (Kume et al., 1989) e alle proteine G (Scornik et al., 1993).

L’attivazione dei canali BK nei distretti vascolari può essere indotta anche da numerosi fattori endogeni come le specie reattive dell’ossigeno (ROS) (Sobey et al., 1998), l’ossido nitrico (Sobey et al., 1999), gli acidi diidrossieicosatrienoici, metaboliti dell’acido arachidonico (Lu et al., 2001) e probabilmente il fattore iperpolarizzante derivato dall’endotelio EDHF (Feletou e Vanhoutte, 1999). L’attivazione inoltre può anche essere legata alla stimolazione dei recettori AT2 da parte dell’angiotensina II, un potente vasocostrittore che comunque possiede proprietà vasorilascianti AT2- mediate su alcuni distretti vascolari (Dimitropoulou et al., 2001).

Struttura dei canali BK Ca

Analogamente agli altri canali ionici, i canali BK sono costituiti da 2

distinte subunità: α e β, in un rapporto stechiometrico di 1:1. (Toro et

al., 1998). Ogni canale esiste come tetrametro, composto da 4 subunità

α da sole o in associazione alla subunità β (McManus et al., 1995). La

subunità α del canale BK è stata clonata per la prima volta dal locus

slowpoke di Drosophila, per questo motivo i canali BK sono anche

chiamati dSlo. Si è visto inoltre che mutazioni del locus provocano l’abolizione delle correnti al potassio nei muscoli e nei neuroni (Atkinson et al., 1991). Lo splicing alternativo dell’mRNA di slowpoke da origine a diversi fenotipi del canale (Adelman et al., 1992). L’omologo umano del gene dSlo, hSlo, è stato clonato dal cervello (Dworetzky et al., 1994), mentre l’analogo murino mSlo dal cervello e dalla muscolatura scheletrica (Butler et al., 1993). Il gene umano che codifica per i canali BK è KCNM; in particolare il gene KCNMA1 codifica per la subunità α, quello KCNMB1 per la β.

Le subunità α vanno a costituire il poro, mentre le β rappresentano

subunità regolatorie. La subunità α è costituita da 7 domini

transmembrana (S0-S6) all’estremità N-terminale, da una regione poro

tra i segmenti S5 e S6 e da 4 segmenti idrofobici (S7-S10)

all’estremità intracellulare C-terminale. Diversamente dai canali SK e

IK, la subunità α ha un ulteriore dominio idrofobico (S0) che si lega

all’estremità N-terminale (Wallner et al., 1996). I domini S1-S6

mostrano un’ elevata omologia con i domini dei canali al K ⁺

voltaggio-dipendenti (Papazian et al., 1991). L’estremità N-terminale

si comporta come dominio di legame per le subunità β. Il poro, che

conferisce un elevato grado di selettività al K ⁺ , è situato al centro delle

4 subunità α; la parte più stretta del poro prende il nome di filtro di

selettività e determina l’elevata velocità di flusso dello ione; il gate del poro si suppone sia costituito dal dominio S6 (Jiang et al., 2002). La regione poro rappresenta anche il sito di legame per i bloccanti del canale: iberiotossina (IbTx) e caribdotossina (ChTx). I residui amminoacidici acidi del dominio S2 (Seoh et al., 1996) e S3 (Papazian et al., 1995) insieme ai residui basici (Arg), ogni 3 posizioni, del dominio S4 conferiscono la sensibilità al voltaggio ai BK (Papazian et al., 1991). La depolarizzazione causa uno spostamento di questi residui carichi, promuovendo dei cambiamenti conformazionali del canale, che causano l’apertura del poro (Stefani et al., 1997).

La regione carbossi-terminale è costituita da un dominio di

regolazione della conduttanza del potassio (RCK) domini S7-S8

(Jiang et al., 2001), connesso alla coda del dominio da una porzione

linker (Wei et al., 1994). Questa regione contiene numerosi siti di

regolazione come ad esempio siti di fosforilazione per le protein-

chinasi cAMP e cGMP dipendenti (Zhou et al., 2001), per la protein-

chinasi C e per la tirosina chinasi (Wang et al., 1999). La coda

dell’estremità C-terminale contiene i segmenti S9 e S10 e conferisce

la sensibilità al Ca ²⁺ (Wei et al., 1994). Una serie di residui

amminoacidici carichi negativamente (Asp) presenti subito prima del

dominio S10 rappresentano i siti di legame del Ca ²⁺ e sono chiamati

Ca ²⁺ -bowl (Schreiber e Salkoff, 1997). Esperimenti recenti hanno

dimostrato che la rimozione dell’estremità C-terminale, in parte o interamente, non ostacola l’apertura del canale, indicando che il calcio può legarsi a regioni diverse da quella del Ca ²⁺ -bowl (Piskorowski e Aldrich, 2002). Il dominio RCK, che contiene i segmenti S7 e S8, partecipa anch’esso in parte alla regolazione Ca ²⁺ -dipendente dei canali BK (Xia et al., 2002); comunque la relazione tra il legame del calcio e l’attivazione del canale non è stata pienamente compresa.

Oltre alla regolazione fisiologica dovuta al Ca ²⁺ è presente all’estremità C-terminale della subunità α un sito di legame per il Mg ²⁺ , il quale può modulare l’attività dei BK (Zeng et al., 2005).

Fig.6 - Subunità α dei canali BK

S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6

S7

S8 S9

S10

H

N

HOOC

Poro

Membrana

Spazio extracellulare

Spazio intracellulare

Mentre solo una subunità α è stata identificata fino ad ora, sono stati clonati 4 possibili tipi di subunità β: β1 dalla muscolatura liscia tracheale bovina (Knaus et al., 1994), β2 dalle cellule cromaffini del ratto (Wallner et al., 1999), β3 dal testicolo (Brenner et al., 2000) e β4 dal cervello (Meera et al., 2000). I trascritti della subunità β sono abbondanti nella muscolatura liscia e nel cuore mentre sono scarsi nei tessuti linfatici, nel cervello e nel fegato (Jiang et al., 1999).

La subunità β regolatoria comprende 2 unità transmembrana TM1 e TM2 connesse da una regione extracellulare (McManus et al., 1995).

Sia l’estremità C-terminale che la N-terminale della subunità β sono

collocate nella parte citoplasmatica della cellula; la regione

extracellulare invece contiene ponti disulfuro che emergono da 4

residui di cisteina (Hanner et al., 1998). Questi residui inducono

un’appropriata conformazione della subunità α, promuovendo il

legame con la ChTx. La subunità β1 incrementa la sensibilità verso il

Ca ²⁺ dei canali BK. Comunque l’associazione della subunità α con i

diversi fenotipi della subunità β porta ad una variazione delle

caratteristiche farmacologiche (Meera et al., 2000) e ad un’alterazione

della sensibilità al voltaggio e al calcio (Ramanathan et al., 2000) e

delle proprietà cinetiche (Wallner et al., 1999). Le diverse subunità β

hanno effetto sul meccanismo di apertura e chiusura del poro della

subunità α: i canali contenenti le sole subunità α, oppure in associazione con le subunità β1 o β4 promuovono la formazione di correnti sostenute (Meera et al., 2000), mentre al contrario la co- espressione con la subunità β2 inibisce le correnti, come è stato osservato nelle cellule cromaffini e nei neuroni dell’ippocampo.

(Wallner et al., 1999). Anche la subunità β3 si comporta in modo simile alla β2.

I diversi fenotipi della subunità β modulano anche la sensibilità dei

canali BK verso i bloccanti del poro. Un esempio è dato dai canali

costituiti dalle subunità α e β4, che risultano resistenti a

concentrazioni nanomolari di ChTx e IbTx; si pensa che la resistenza

sia dovuta alla porzione extracellulare della subunità β4, la quale va a

costituire una parte del recettore della tossina e previene il trasporto di

essa verso e dal sito di legame (Meera et al., 2000).

Fig.7 – Rappresentazione schematica della subunità α e β dei canali BK: i sette

domini di membrana S0-S6 (compreso il dominio sensibile al voltaggio, S4), la regione del poro e i quattro domini idrofobici intracellulari S7-S10 (che portano l’RCK e il Ca ²⁺ -bowl) formando l’estremità C-terminale della subunità α; e i domini transmembrana (TM1-TM2) della subunità β.

S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6

S7 S8

S9 S10

Extracellular side

H

N

Membrane

ψ ψ

COOH H

N

HOOC

Intracellular side

β-Subunit α-Subunit

+ + + Voltage sensor

P loop

TM1 TM2

RCK Ca

Bowl - - -

Tail domains

I canali BK Ca nei disturbi cardiovascolari

L’iperpolarizzazione svolge un ruolo importante nella reattività vascolare andando a bilanciare gli effetti negativi di un eccessiva vasocostrizione. I canali BK sono fondamentali nel mantenimento del normale tono vascolare, regolando il processo di contrazione. Nella muscolatura liscia vascolare, i BK si aprono in risposta ad un aumento del rilascio di calcio intracellulare dal reticolo sarcoplasmatico attraverso i recettori rianodinici, in seguito all’entrata di Ca ²⁺

extracellulare. I recettori rianodinici, che si trovano in prossimità dei canali BK, permettono il rilascio dal reticolo sarcoplasmatico di calcio che va ad attivare i canali provocando l’efflusso di potassio (Jaggar et al., 2000). L’efflusso di potassio promuove il rilasciamento della muscolatura vascolare sia portando il potenziale di membrana verso valori più negativi (iperpolarizzazione), sia chiudendo i canali al Ca ²⁺

voltaggio-dipendenti, attraverso i quali entra il calcio che provoca la contrazione.

Sulla base del loro ruolo di regolatori a feed-back negativo, i canali

BK sembrano essere un potenziale target nel trattamento

dell’ipertensione. Questo particolare meccanismo a feed-back

negativo è regolato dalla sensibilità dei canali BK all’incremento di

Ca ²⁺ intracellulare. Da un punto di vista strutturale, una sensibilità

all’incremento di Ca ²⁺ è conferita dalla presenza della subunità β1 (McManus et al., 1995) e in assenza della funzionalità della subunità β1, il meccanismo di vasodilatazione risulta significatamente compromesso (Patterson et al., 2002), come per esempio nel caso di ratti spontaneamente ipertesi (SHR) (Amberg e Santana, 2003; Chang et al., 2006), nei quali si osserva una espressione alterata o una down regulation della subunità β1 dei canali BK. Questa osservazione è stata confermata da altre scoperte: una down regulation della subunità β1 è stata trovata anche nelle cellule della muscolatura liscia vascolare di ratti resi ipertesi mediante infusione di angiotensina II (Amberg et al., 2003), inoltre, topi geneticamente modificati, mancanti della subunità β1, hanno canali BK della muscolatura liscia vascolare che sono disaccoppiati dal Ca ²⁺ ; in questi animali il conseguente incremento del tono vascolare porta all’ipertensione (Brenner et al., 2000; Plüger et al., 2000). Un recente studio sullo stato di ipertensione è stato associato ad una down regulation in seguito ad una ipossia cronica, infatti un abbassamento di tensione dell’O 2 produce un decremento dei livelli di subunità β1 di canali BK nell’mRNA nei miociti arteriosi nel ratto e nell’uomo (Navarro-Antolìn et al., 2005).

Più in generale, sia nei ratti che negli uomini, un sostanziale

decremento dell’espressione dei canali BK è stato osservato nella

muscolatura liscia coronarica durante l’invecchiamento. Tale decremento dell’espressione dei canali BK fornirebbe un meccanismo di accrescimento di fenemeni di vasospasmo coronarico nell’invecchiamento (Marjiic et al., 2001).

Recentemente, oltre al classico meccanismo di attivazione, è stato descritto un ruolo dei canali BK come target di alcune sostanze vasorilascianti come NO, PGI2 e EDHF (Tanaka et al.,2004). Queste scoperte sono state confermate e più dettagliate in uno studio in cui il contributo dell’apertura dei canali BK per la vasodilatazione endotelio-dipendente diventa più importante dopo un episodio di riperfusione ischemica grazie all’incremento della capacità di NO (o cGMP) di aprire questi canali (Woodman e Wongsawatkul, 2004).

Secondo alcune scoperte, un ulteriore ruolo dei BK è stato suggerito

nelle disfunzioni dell’endotelio o più in generale in disfunzioni

vascolari associate al diabete. In condizioni di resistenza insulinica, a

livello vascolare c’è una riduzione della densità di corrente del

potassio attraverso i canali BK, questo spiega l’alterato processo di

rilasciamento, dovuto probabilmente ad una modificazione del

processo di apertura e chiusura dei canali. Sorprendentemente infatti,

l’espressione cellulare e la sensibilità al voltaggio e al Ca ²⁺ rimangono

invariati (Dimitropoulou et al., 2002). Partendo dalle osservazioni

sperimentali che la corrente di potassio è ridotta nelle cellule della muscolatura liscia microvascolare (Dimitropoulou et al., 2002), un altro gruppo di ricercatori ha trovato che la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nell’iperglicemia indotta, danneggia la funzione dei canali BK riducendo la corrente e alterando la cinetica dei canali, probabilmente attraverso l’ossidazione della cisteina 911 (Lu et al., 2006).

In conclusione gli attivatori dei canali BK possono essere utilizzati per

il trattamento di disfunzioni vascolari, e ci si aspetta un promettente

futuro da parte di agenti antipertensivi che agiscano sulla subunità β1

dei canali con attività comparabile a quella dei Ca ²⁺ -antagonisti e dei

bloccanti dei recettori β-adrenergici (Ghatta et al., 2006).