STIMA DELL’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA IN VITRO DI DUE PRODOTTI COMMERCIALI CONTENENTI CLOREXIDINA E OLIO DI MELALEUCA SU CEPPI BATTERICI E LIEVITI ISOLATI DA CANI

Riassunto

Introduzione e scopo del lavoro - La terapia topica riveste un ruolo importante nel trattamento delle infezioni cutanee e del- le otiti nel cane poiché le concentrazioni antimicrobiche dei principi attivi agiscono direttamente contro i patogeni. Scopo del lavoro è stato valutare l’attività antimicrobica in vitro di due prodotti commerciali ad uso veterinario contenenti clorexidina ed essenza di Melaleuca alternifolia.

Materiali e metodi - Nello studio sono stati utilizzati diversi ceppi di batteri (Staphylococcus intermedius, Enterococcus fae- calis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) e di lieviti (Malassezia pachydermatis e Candida albicans) isolati da cani con infezioni cutanee e/o otite. L’attività nei confronti dei microrganismi è stata valutata tramite test a contatto utilizzando 2 prodotti (Diclorex foam

e Diclorex oto

, Candioli Farmaceutici, Italia) tal quali e diluiti. Per confrontare l’azione antibatterica dei due prodotti è stato utilizzato un test non parametrico (Wilcoxon signed rank test).

Risultati e discussione - Entrambi i prodotti si sono dimostrati efficaci nell’azione antimicrobica. Il prodotto ad uso cutaneo ha inibito la crescita batterica entro 1 minuto se usato tal quale e 60 minuti se utilizzato diluito. Il prodotto otologico non dilui- to è risultato efficace in tempi rapidi (1-5 minuti) verso S. intermedius, E. coli e un ceppo di P. aeruginosa mentre usandolo di- luito l’efficacia è risultata inferiore su tutti i batteri. Per i lieviti, solo i prodotti tal quali si sono dimostrati attivi; su M. pachy- dermatis hanno agito entrambi i prodotti, mentre C. albicans è stata inibita solo dal preparato otologico.

Summary

Introduction and aim of the study - Topical therapy plays a role in the treatment of skin infections and otitis in the dog be- cause antimicrobial concentrations of the agents come into direct contact with the pathogens. The aim of this study was to analyze in vitro the antimicrobial effect of two commercial products containing chlorhexidine and Melaleuca alternifolia.

Materials and methods - Bacteria (Staphylococcus intermedius, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) and yeasts (Malassezia pachydermatis and Candida albicans) isolated from dogs with skin diseases and/or otitis externa were used in the study. Antimicrobial activity was evaluated by contact tests using 2 products (Diclorex foam

and Diclorex oto

, Candioli Farmaceutici). The data about antibacterial activity were evaluated by a nonparametric test (Wilcoxon’s signed rank test).

Results and discussion - Both products showed to be effective against most microrganisms tested. The dermatological pro- duct eliminated all bacteria within 1 minute (non diluted product) and within 60 minutes (1/5 diluted product). The otological product was effective after 1-5 minutes against S. intermedius, E. coli and 1 strain of P. aeruginosa, while its activity was lower against all bacteria when used diluted. As regards yeasts, only non diluted products were effective. Both of them inhibited M.

pachydermatis growth, while C. albicans was inhibited only by the otological product.

“Articolo ricevuto dal Comitato di Redazione il 07/11/2007 ed accettato per pubblicazione dopo revisione il 13/02/2008”.

STIMA DELL’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA IN VITRO DI DUE PRODOTTI COMMERCIALI CONTENENTI

CLOREXIDINA E OLIO DI MELALEUCA

SU CEPPI BATTERICI E LIEVITI ISOLATI DA CANI

IN VITRO EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY

OF TWO PRODUCTS CONTAINING CHLORHEXIDINE AND MELALEUCA OIL ON BACTERIA AND YEASTS ISOLATED FROM DOGS

PATRIZIA NEBBIA

, PATRIZIA ROBINO

, CLARA TRAMUTA

MASSIMO BECCATI

, ANDREA PEANO

1 Dipartimento di Produzioni Animali, Epidemiologia ed Ecologia - Facoltà di Medicina Veterinaria, Università di Torino

2 Libero professionista - Clinica Veterinaria Adda - Capriate San Gervasio (BG)

INTRODUZIONE

Nel cane le infezioni batteriche e da lieviti che coinvol- gono cute e condotto uditivo esterno rappresentano un’e- venienza piuttosto comune

. Queste si possono instaurare senza un’apparente causa sottostante o in conseguenza di fattori predisponenti di varia origine (malattie allergiche, parassitarie, metaboliche, difetti di cheratinizzazione, alte- razioni del microclima cutaneo). Mentre diverse specie bat- teriche possono essere implicate nel determinismo di pio- dermiti e otiti, tra i lieviti il microrganismo di più frequen- te riscontro è Malassezia pachydermatis, mentre Candida al- bicans è molto più rara

. Vista la frequenza di infezioni mi- ste, si rende necessario un approccio terapeutico combina- to nei confronti di batteri e lieviti.

Il ruolo della terapia topica riveste un’importanza deter- minante al fine di una corretta gestione terapeutica sia in corso di infezioni cutanee che di otiti. Numerose molecole, ad esempio iodiopovidone, etil lattato, triclosan, benzoilpe- rossido e clorexidina, vengono usate comunemente per la detersione cutanea e/o auricolare, da sole o come coadiu- vanti della terapia farmacologica sistemica. La clorexidina è un valido antisettico utilizzato sia in campo umano

che veterinario

, efficace verso diverse specie batteriche e M.

pachydermatis

. In ambito veterinario viene usata a concen- trazioni fino al 4% in prodotti destinati alla pulizia del pelo e disinfezione della cute del cane e del gatto e a concentra- zioni minori come detergente auricolare e coadiuvante nel- la terapia delle otiti batteriche e da Malassezia

.

Da qualche anno vengono studiati anche gli effetti anti- microbici di alcuni oli, fra cui l’essenza di Melaleuca (Me- laleuca alternifolia), di cui è stata dimostrata l’efficacia ver- so diversi batteri e lieviti

.

Scopo del lavoro è stato valutare e comparare l’attività antimicrobica in vitro di due prodotti commerciali ad uso veterinario, un prodotto ad uso cutaneo e un prodotto ad uso otologico, contenenti clorexidina a diversa concentra- zione ed essenza di Melaleuca (Tabella 1). I prodotti utiliz- zati per le prove sono stati forniti dalla ditta di produzione (Istituto Farmaceutico Candioli S.p.a, Italia) e testati tal quali e diluiti.

MATERIALI E METODI Parte A

I ceppi batterici usati nell’esperimento sono stati isolati da cani affetti da piodermite e otite. Nei confronti di en- trambi i prodotti sono stati testati 3 ceppi batterici di 5 di-

verse specie (Staphylococcus intermedius, Enterococcus fae- calis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeru- ginosa) per un totale di 15 ceppi. Tutti gli isolati erano re- sistenti ad almeno 4 antibiotici (dati non riportati). Ogni esperimento è stato eseguito in doppio e in casi dubbi in triplicato per ciascun prodotto da testare. Sono stati consi- derati validi i risultati che hanno dato lo stesso esito in al- meno due test.

La metodica impiegata è basata su un lavoro di Lloyd et al.

con alcune modifiche. I prodotti sono stati provati tal quali e diluiti 1/5. In breve, ciascun ceppo, dopo una not- te di incubazione a 37°C in agitazione in 40 ml di Brain Heart Infusion (BHI; Oxoid, Milano, Italia), veniva cen- trifugato a 5000 x g per 7 minuti (PK12IR, ALC). Il pellet veniva risospeso in Mueller Hinton Infusion (MHI;

Oxoid, Milano, Italia) e quantificato mediante spettrofo- tometro a 550 nm (ultrospec2000, Pharmacia Biotech, Mi- lano, Italia) per ottenere una torbidità finale corrispon- dente a 1,5 x 10

Unità Formanti Colonia (UFC) per ml.

Venti µl di ogni sospensione batterica venivano poi addi- zionati a 2 ml dei prodotti da provare (sia tal quali che di- luiti 1/5 in acqua distillata sterile) e a 2 ml di una soluzio- ne salina sterile (0,9% di NaCl, Sigma-Aldrich, Milano, Italia), come controllo della crescita batterica. In seguito, aliquote (100 µl) venivano rimosse a diversi intervalli di tempo (1, 3, 5, 10, 20, 30, 60, 120 minuti) e spatolate su Tryptone Soya Agar (TSA w/Lecithin and polysorbate 80;

Himedia Laboratories, Mumbai, Maharashtra, India.), contenente lecitina e Tween 80 per neutralizzare l’attività residua della clorexidina

. Le piastre erano incubate a 36 °C per 48 ore e veniva quindi osservata l’eventuale cre- scita di colonie. Sono state considerate negative le piastre con il 100% di inibizione della crescita. I risultati ottenuti sono stati analizzati statisticamente con un test non para- metrico (Wilcoxon signed rank test).

Parte B

Sono stati utilizzati per le prove 3 ceppi di Malassezia pa- chydermatis e 2 di Candida albicans. La metodica usata è basata sulle indicazioni della normativa europea UNI EN 1275, che specifica il metodo di prova e i requisiti minimi per l’attività fungicida di base di prodotti disinfettanti chi- mici e antisettici che formano un preparato fisicamente sta- bile

. La metodica consiste nel valutare la diminuzione del numero di microrganismi vitali dopo contatto con gli agen- ti antisettici per periodi di tempo variabili. Brevemente, i lieviti utilizzati corrispondono a 3 ceppi di Malassezia pa- chydermatis e a 2 ceppi di Candida albicans isolati a partire da cani con dermatite e/o otite. Dopo almeno due trapian- ti su terreno di Sabouraud destrosio (Biolife, Milano, Italia) le colonie ottenute sono state prelevate con spatola sterile e stemperate in soluzione fisiologica sterile. Queste sospen- sioni (Test Suspension - TS) sono state standardizzate a 1,5- 5,0 x 10

UFC/ml di soluzione tramite la valutazione della densità utilizzando uno spettrofototometro a 630 nm (ul- trospec2000, Pharmacia Biotech, Milano, Italia). All’inizio di ogni prova 1 ml della TS è stato aggiunto in tre provette sterili contenenti rispettivamente 9 ml del prodotto da te- stare (concentrazione finale 90%), 7 ml di soluzione fisio- logica e 2 ml del prodotto (concentrazione finale 20%), 9

Tabella 1

Concentrazione di clorexidina ed essenza di Melaleuca nei due prodotti testati

Prodotto % clorexidina % olio di Melaleuca

Diclorex foam^® 0,5% 3,0%

Diclorex oto^® 0,3% 3,0%

ml di fisiologica (controllo di crescita). Dopo i tempi di contatto prefissati, 1 ml della sospensione è stato asportato da ciascuna provetta e immediatamente aggiunto a 9 ml di una soluzione neutralizzante contenente Tween 80 al 3%

(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e lecitina 3 g/l (Sigma-Al- drich). Dopo 5 minuti 1 ml di questa sospensione è stato seminato su terreno di Sabouraud destrosio (Biolife, Mila- no, Italia). Dopo incubazione a 37 °C per 24-48 ore (Can- dida) e a 37 °C per 5 giorni (Malassezia) si è proceduto al- la lettura delle UFC per singola piastra. Tenendo conto del- le diluizioni utilizzate si è risaliti al numero di UFC, ovve- ro di microrganismi vitali presenti nelle sospensioni ai di- versi tempi studiati. Secondo la norma seguita un determi- nato prodotto è considerato efficace nei confronti del fun- go testato se si osserva una riduzione delle UFC di almeno 4 unità logaritmiche rispetto al numero iniziale. Sono stati valutati i risultati dopo 15 minuti essendo questo il tempo di contatto di riferimento della procedura seguita, che in- dica anche la possibilità di una valutazione a tempi aggiun- tivi (5 e 30 minuti).

RISULTATI Parte A

I risultati sono riassunti nella Tabella 2, che mostra il tempo di contatto necessario affinché ciascun prodotto sia in grado di inibire la crescita batterica. Il prodotto ad uso dermatologico è stato efficace su tutti i batteri entro 1 mi- nuto; lo stesso prodotto, diluito 1/5, ha avuto bisogno di tempi maggiori sui Proteus e su un ceppo di E. faecalis.

Il prodotto otologico ha dimostrato attività antibatterica dopo 1-5 minuti di contatto verso S. intermedius, E. coli e

un ceppo di P. aeruginosa. Nei confronti degli altri germi il prodotto, sia tal quale che diluito, ha richiesto tempi più lunghi per inibire la crescita batterica.

L’analisi statistica ha evidenziato che il tempo di azione del prodotto otologico (tal quale e diluito) è significativa- mente maggiore del tempo di azione del prodotto derma- tologico tal quale (P<0.001). Non ci sono differenze signi- ficative fra il tempo d’azione del prodotto ad uso dermato- logico usato tal quale e diluito.

Parte B

I risultati, riassunti nella Tabella 3, vengono espressi in scala logaritmica come differenza tra il numero di UFC del- la TS e il numero di UFC dopo contatto con i due prodot- ti (concentrazione 90%) per i diversi tempi. Non vengono riportati i dati relativi ai due prodotti al 20% in quanto non si è evidenziata efficacia verso i funghi testati. Le Figure 1 e 2 illustrano la diminuzione del numero di lieviti (M. pa- chydermatis) nel tempo di contatto. Ciascun grafico mostra la media dei risultati ottenuti sui tre ceppi in esame.

DISCUSSIONE

La terapia topica viene frequentemente utilizzata per le infezioni cutanee e dell’orecchio esterno nel cane. Questo approccio permette di utilizzare principi antimicrobici di- rettamente sui patogeni ad una concentrazione ottimale

. I nostri risultati sull’azione antibatterica in vitro mostra- no che il prodotto ad uso cutaneo ha una elevata efficacia in quanto inibisce la crescita di tutti i ceppi entro un mi- nuto. Dati quasi sovrapponibili si ottengono utilizzando il

Tabella 2

Tempo di contatto (espresso in minuti) necessario ai prodotti testati (non diluiti e diluiti 1/5) per ottenere colture batteriche negative (100% di inibizione della crescita)

Specie Ceppo Diclorex foam^® Diclorex oto^® Diclorex foam^® Diclorex oto^®

1/5 1/5

A 1 1 1 3

S. intermedius B 1 1 1 120

C 1 1 1 10

A 1 5 1 60

E. faecalis B 1 >120 10 120

C 1 5 1 60

A 1 3 1 10

E. coli B 1 5 1 10

C 1 5 1 20

A 1 60 60 >120

P. mirabilis B 1 20 60 >120

C 1 60 30 >120

A 1 3 1 1

P. aeruginosa B 1 30 1 30

C 1 20 1 30

prodotto diluito 1/5, con l’eccezione di P. mirabilis che è in grado di crescere anche dopo un’ora di contatto. Il pro- dotto otologico ha dimostrato di agire rapidamente sui Gram positivi (eccetto un ceppo di E. faecalis) e su E. coli, mentre sono necessari tempi più lunghi per ottenere l’ini- bizione della crescita degli altri Gram negativi. Una volta diluito il prodotto perde notevolmente efficacia su tutti i batteri in esame. Lo studio in vitro conferma l’attività anti- microbica a largo spettro dei prodotti esaminati ed eviden- zia come il tempo di contatto necessario per eliminare i mi- crorganismi possa dipendere non solo dalla specie in cau- sa, ma anche dalla consistenza del prodotto. I due prepara- ti presentavano una diversa densità - più fluido il dermato- logico, più vischioso il prodotto otologico - ed è possibile che questa caratteristica abbia influito negativamente sul- l’efficacia in vitro di quest’ultimo. Infatti nonostante la per- centuale di clorexidina nel prodotto ad uso cutaneo sia so- lo leggermente superiore a quella del prodotto otologico, l’azione del primo risulta molto rapida su tutti i batteri te- stati ed è significativamente più efficace (P>0.001). Alcuni lavori su prodotti per la disinfezione orale nell’uomo con- fermano questa ipotesi, ad esempio Vianna et al.

hanno os- servato che l’attività antibatterica della clorexidina a bassa concentrazione (0,2%) è superiore in irriganti liquidi ri- spetto ai gel, mentre a concentrazioni maggiori non vi sono differenze fra le due forme.

Per quanto riguarda l’attività fungicida, entrambi i pro- dotti si sono dimostrati efficaci nei confronti di M. pachy- dermatis, riducendo di più di 4 unità logaritmiche il nu- mero di microrganismi dopo 15 minuti di contatto. Se- condo la procedura adottata

tutti e due possono quindi essere considerati efficaci nei confronti di questo agente eziologico. In particolare il prodotto ad uso dermatologi- co era già attivo, con una riduzione a 0 del numero di UFC, dopo 5 minuti di contatto. Per ciò che concerne le prove con i prodotti diluiti al 20%, si è dimostrata l’inef- ficacia degli stessi. Questo dato concorda con quanto ri- scontrato in letteratura su analoghe prove con concentra- zioni simili di clorexidina

.

Per C. albicans i dati ottenuti portano a definire efficace il prodotto otologico e non efficace il prodotto ad uso der- matologico. Questo dato risulta di difficile interpretazione se si considera che la concentrazione di clorexidina è infe- riore nel prodotto otologico e l’olio di Melaleuca è alla stes- sa concentrazione. L’ipotesi è che altri componenti del pro- dotto otologico possano agire in “sinergia” con la clorexi- dina. Ulteriori prove dovrebbero essere effettuate per chia- rire questo punto, anche se l’interesse clinico-applicativo non sarebbe elevato. Le infezioni da C. albicans nel cane so- no infatti evenienza rara, addirittura rarissima se confron- tate con le infezioni da Malassezia

.

In letteratura vi sono numerosi lavori che testimoniano

Tabella 3

Entità della riduzione del numero di UFC (Unità Formanti Colonia) dei ceppi fungini dopo i diversi tempi di contatto con i prodotti al 90%.

È evidenziata la colonna relativa ai 15 minuti di contatto perché è a questo tempo che deve essere valutata l’efficacia del prodotto¹⁵. Un numero superiore a 4 indica che il prodotto può essere considerato efficace.

Diclorex foam^® Diclorex oto^®

Specie Ceppo

5 min 15 min 30 min 5 min 15 min 30 min

A 6,45 6,45 6,45 2,13 6,45 6,45

M. pachydermatis B 6,35 6,35 6,35 3,00 6,35 6,35

C 6,57 6,57 6,57 3,30 6,57 6,57

C. albicans A 2,12 2,51 3,54 3,40 4,34 6,64

B 2,33 3,94 4,21 3,53 4,20 6,50

FIGURA 1 - Attività del prodotto ad uso dermatologico contro Malasse- zia pachydermatis(media su 3 ceppi). Il grafico è in scala logaritmica.

La linea tratteggiata indica il numero di UFC (Unità Formanti Colonia) del controllo, la linea continua il numero di UFC dopo contatto col prodotto.

tempo di contatto

0 5 min 15 min 30 min

10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1

numero delle UFC

FIGURA 2 - Attività del prodotto otologico contro Malassezia pachyder- matis(media su 3 ceppi). Il grafico è in scala logaritmica. La linea trat- teggiata indica il numero di UFC (Unità Formanti Colonia) del controllo, la linea continua il numero di UFC dopo contatto col prodotto.

tempo di contatto

0 5 min 15 min 30 min

10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1

numero delle UFC

l’efficacia della clorexidina in vitro a differenti concentra- zioni

. In ambito veterinario questo principio attivo è contenuto in prodotti ad uso topico a diverse formulazioni.

Lloyd e Lamport

hanno testato su batteri e Malassezia preparazioni commerciali a diverse concentrazioni di clo- rexidina ottenendo risultati sovrapponibili ai nostri. Que- sto conferma come l’efficacia antimicrobica in vitro sia cor- relata non solo alla concentrazione di clorexidina, ma an- che alla formulazione del prodotto.

Difficile quantificare il ruolo dell’essenza di Melaleuca presente alla stessa concentrazione (3,0%) in entrambi i prodotti. I dati bibliografici confermano un’attività antimi- crobica di questo olio

nonché una attività fungistatica e fungicida nei confronti di diversi lieviti

, ma non evi- denziano un effetto sinergico significativo se associato alla clorexidina

. Data la presenza di questi due principi attivi in entrambi i prodotti testati, risulta comunque difficile at- tribuire un ruolo preciso all’olio di Melaleuca nell’attività antimicrobica.

In conclusione, le prove in vitro indicano che i due pro- dotti in studio possono essere vantaggiosamente utilizzati come coadiuvanti per il controllo delle infezioni cutanee e auricolari di origine batterica e da Malassezia nel cane; in particolare la contemporanea attività antibatterica ed anti- micotica risulta di estrema utilità visto il frequente riscon- tro di infezioni miste. Riteniamo quindi che sarebbe utile proseguire lo studio per valutarne l’attività antimicrobica in vivo.

Questo studio è stato sponsorizzato dall’Istituto Farma- ceutico Candioli, Beinasco (TO) Italia.

Parole chiave

Attività antimicrobica, clorexidina, batteri, lieviti, cute, orecchio.

Key words

Antimicrobial activity, chlorhexidine, bacteria, yeasts, skin, ear.

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