modulazione dei fattori coinvolti nell’angiogenesi e nel rimodellamento tessutale

R. Alleva ¹ , M. Tomasetti ² , D. Sartini ³ , M. Emanuelli ³ , F. Di Donato ⁴ , B. Borghi ¹ , E. Nasole ⁴

1

Dipartimento di Anestesia, IRCCS Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna;

Dipartimento di Patologia Molecolare e Terapie Innovative, Università Politecnica delle Marche, Ancona;

Istituto di Biochimica e Biotecnologie, Università Politecnica delle Marche, Ancona;

Centro di Medicina Iperbarica, Bologna

Corrispondenza: dott.ssa Renata Alleva,

Dipartimento di Anestesia, IRCCS Istituti Ortopedici Rizzoli, via GC Pupilli 1, 40136 Bologna

e-mail: [email protected]

G It Diabetol Metab 2008:28:55-64 Pervenuto in Redazione il 17-10-2007 Accettato per la pubblicazione il 04-03-2008

Parole chiave: R

-acido lipoico, matrice extracellulare, angiogenesi, ossigeno iperbarico, ulcere diabetiche Key words: R

-lipoic acid, extracellular matrix, angiogenesis, hyperbaric oxygen, diabetic wounds

Lavoro originale

L’R ⁺ -acido lipoico accelera

la guarigione delle ulcere diabetiche sottoposte a terapia iperbarica:

modulazione dei fattori coinvolti nell’angiogenesi

e nel rimodellamento tessutale

RIASSUNTO

L’ulcera diabetica cronica è caratterizzata da una persistente infiammazione che determina un’alta concentrazione di protea- si. Le proteasi degradano diversi fattori di crescita e proteine della matrice extracellulare che sono essenziali per il normale processo di guarigione. La terapia iperbarica rappresenta tut- t’oggi un approccio terapeutico alternativo. In questo studio, è stato valutato l’effetto dell’R

-acido lipoico in pazienti affetti da ulcere diabetiche croniche sottoposti a terapia iperbarica.

Mediante tecnica ELISA, è stata valutata la concentrazione tes- sutale e plasmatica dei fattori coinvolti nell’angiogenesi e nel rimodellamento della matrice extracellulare. Pazienti sottoposti a terapia iperbarica sono stati inclusi in due gruppi, gruppo R

- acido lipoico e gruppo placebo. La concentrazione proteica è stata valutata in biopsie effettuate alla prima sessione di tratta- mento iperbarico (T

), alla quinta sessione (T

) e dopo 10 giorni di trattamento iperbarico (T

). La supplementazione con R

- acido lipoico in combinazione con il trattamento iperbarico inibi- sce lo stato infiammatorio cronico modificando i livelli proteasi/antiproteasi nel microambiente della ferita. La diminu- zione dei livelli di metalloproteasi-9 (MMP9) e l’aumento della concentrazione della metalloproteasi-2 (MMP2) e del fattore di crescita piastrinico (PDGF-BB) contribuiscono ad accelerare il processo di riparazione e guarigione della ferita. Dall’analisi clini- ca si evidenzia che la somministrazione di R

-acido lipoico determina una significativa riduzione della ferita rispetto al solo trattamento iperbarico (rispettivamente, 40,8 ± 37,2% vs 5,7 ± 43,3%, p = 0,02 osservato dopo 42 giorni di trattamento). In conclusione, l’acido R

-lipoico contribuisce alla distruzione del

“loop autocrino positivo” che mantiene lo stato cronico della feri-

ta, determinando la progressione del processo di guarigione.

SUMMARY

R

-lipoic acid accelerates healing process of diabetic ulcers treated with hyperbaric oxygen therapy: modulation of factors involved in the angiogenesis and tissue remodeling

Chronic diabetic ulcer is characterised by a persistent inflam- mation followed by a high proteases concentration. Proteases lead to the degradation of growth factors and proteins of extra- cellular matrix which are important in the normal healing process. Up to date, the hyperbaric oxygen (HBO) therapy rep- resents an alternative therapeutic approach. In this study, has been evaluated the effect of R

-lipoic acid in patients affected by chronic diabetic ulcers underwent to HBO therapy. By ELISA technique, the tissue and plasmatic concentration of factors involved in the angiogenesis and extracellular matrix remodelling have been evaluated. Patients underwent HBO therapy were included in two groups, the R

-lipoic acid group and the placebo group. Protein expression profiles for extracel- lular matrix and angiogenesis mediators were evaluated in biopsies and plasma samples collected at the first HBO ses- sion (T

), at the 5

HBO session (T

) and after 10 days of HBO treatment (T

). R

-LA supplementation in combination with HBO therapy inhibits the chronic inflammatory state, changing

the protease/anti-protease levels within the wound microenvi- ronment. Decrease in the metalloproteinase-9 (MMP9) expres- sion and the increase of metalloproteinase-2 (MMP2) together with increased levels of the piastrinic growth factor (PDGF-BB), significantly contribute to acceleration of the dermal wound repair process. Clinical analysis of the wounds show that R

- lipoic acid supplementation significantly reduce the wound area respect to the HBO treatment only (40.8 ± 37.2% vs 5.7 ± 43.3%, p = 0.02, respectively at day 42 of the treatment). In conclusion, R

-lipoic acid contributes to the disruption of the

“positive autocrine feedback loops” that maintain the chronic wound state promoting the progression of the healing process.

Introduzione

Le ulcere del piede diabetico rappresentano un importante problema poiché sono associate a una significativa morbosi- tà e mortalità

, pertanto, il trattamento e la cura di tali ulce- re rappresentano a tutt’oggi un importante problema clini- co

. Le interazioni molecolari coinvolte nella mal cicatrizza-

Figura 1 Modello molecolare della fisiopato- logia dell’ulcera cronica. Nelle ferite croniche insorte in seguito a danni ricorrenti o cronici (i.e. ischemia intermittente), una volta stabili- te, si genera un circolo positivo e autocrino che mantiene lo stato cronico della ferita, prevenendo la progressione del processo di guarigione. Il trattamento OTI contribuisce a inibire l’infezione batterica stimolando la rige- nerazione tessutale. L’R

-acido lipoico inibi- sce lo stato infiammatorio cronico, modifi- cando il rapporto proteasi/antiproteasi a livel- lo di microambiente della ferita. L’interruzione del circolo positivo e autocrino accelera il processo di cicatrizzazione.

Ulcera del piede diabetico

• Eventi traumatici ripetuti

• Detriti/frammenti cellulari

• Tossine batteriche

• Aumento della risposta infiammatoria

• Invasione dei macrofagi e neutrofili

Attivazione dei macrofagi attraverso citochine e fattori di crescita

Cellule infiammatorie e fibroblasti

Serina-proteasi

Degradazione della matrice, dei fattori di crescita e dei loro recettori

FERITA CRONICA

R ⁺ -ACIDO LIPOICO Trattamento OTI

MMPs TIMPs

zione e il passaggio dello stato acuto a quello di ferita croni- ca hanno maggiormente interessato la ricerca scientifica

. Le ulcere del piede diabetico spesso non cicatrizzano a causa di persistenti e alti livelli di citochine proinfiammatorie in sede della ferita, i quali inducono alti livelli di metalloprotei- nasi (matrix metalloproteinases, MMPs) della matrice extra- cellulare (extra cellular matrix, ECM). Queste endopeptidasi zinco-dipendenti

a loro volta distruggono i fattori di cresci- ta, recettori e proteine della matrice che sono essenziali per la cicatrizzazione dell’ulcera

(Fig. 1). Le MMPs sono anche responsabili della frammentazione controllata della membrana basale, dell’angiogenesi e della epitelizzazione.

Il circolo autocrino positivo feedback loop mantiene lo stato cro- nico delle ferite, che insorgono in seguito a danni ricorrenti o cro- nici (i.e. ischemia intermittente), impedendone la guarigione.

Pertanto, per promuovere il processo di guarigione è fondamen- tale l’interruzione di questo circolo. Recentemente, è stata rivolta una grande attenzione alla scoperta di nuove molecole o tratta- menti in grado di stimolare il processo di cicatrizzazione. In uno studio svolto precedentemente

, è stato osservato che l’acido α-lipoico (AL) in associazione all’ossigeno terapia iperbarica (OTI) contribuiva efficientemente ad accelerare la regressione delle ulcere croniche, agendo sia da antiossidante sia da modulatore dell’infiammazione. L’acido α-lipoico viene usato nel trattamento

di varie patologie associate a polineuropatia, tra le quali il diabete mellito

. Diversi studi hanno dimostrato che l’enantiomero dell’a- cido α-lipoico, R

-acido lipoico (R

-AL), preferenzialmente viene accettato dal complesso della piruvato deidrogenasi rappresen- tando quindi la forma attiva e fisiologica dell’acido α-lipoico

. In questo studio, abbiamo studiato l’effetto dell’R

-AL nella modulazione di fattori coinvolti nel rimodellamento della ECM e nell’angiogenesi in pazienti affetti da ulcere diabetiche croniche trattate con OTI. È stato osservato che la supplementazione con R

-AL in combinazione con OTI inibisce efficacemente l’e- spressione delle citochine proinfiammatorie e dei fattori di cre- scita che, di conseguenza, regolano l’espressione e l’attività delle MMPs, promuovendo il processo di cicatrizzazione.

Materiale e metodi

Reclutamento dei pazienti e supplementazione con R ⁺ -acido lipoico

Previo consenso informato, 20 pazienti (9 maschi e 11 femmi- ne, età media 77 ± 9 anni) sono stati arruolati al Centro di Medicina Iperbarica di Bologna. Le patologie prese in esame Tabella 1 Caratteristiche cliniche dei soggetti.

Soggetti Sesso Età Trattamento Area ulcera HbA _1c Patologia Sede Terapia (n) (M/F) (anni) (lipoico/placebo) (cm ² ) (%)

1 F 86 Lipoico 47,9 11,6 Venosa Gamba Insulina

2 F 82 Placebo 40,3 8,2 Arteriosa Gamba Ipoglic. orale

3 M 80 Placebo 9,0 7,9 Arteriosa Piede Insulina

4 F 64 Lipoico 2,3 9,1 Arteriosa Piede Insulina

5 F 89 Lipoico 0,09 8,3 Arteriosa Piede Insulina

6 F 87 Placebo 2,7 8,6 Arteriosa Gamba Ipoglic. orale

7 F 81 Lipoico 2,7 9,3 Arteriosa Gamba Ipoglic. orale

8 F 63 Placebo 4,9 8,9 Venosa Malleolo Ipoglic. orale

9 M 66 Lipoico 33,9 8,7 Arteriosa Piede Insulina

10 F 70 Placebo 7,5 8,4 Arteriosa Piede Ipoglic. orale

11 M 71 Placebo 22,9 8,4 Arteriosa Malleolo Ipoglic. orale

12 F 79 Placebo 0,06 7,9 Venosa Piede Insulina

13 M 74 Lipoico 6,4 8,2 Arteriosa Piede Insulina

14 M 77 Lipoico 21,1 11,1 Arteriosa Piede Insulina

15 M 71 Lipoico 18,0 9,2 Arteriosa Piede Insulina

16 F 70 Placebo 40,9 8,4 Venosa Gamba Ipoglic. orale

17 M 69 Placebo 3,2 8,9 Arteriosa Gamba Ipoglic. orale

18 F 87 Placebo 8,2 9,1 Venosa Gamba Insulina

19 M 68 Lipoico 25,4 8,7 Arteriosa Gamba Ipoglic. orale

20 M 72 Lipoico 11,7 7,8 Arteriosa Piede Insulina

e trattate con OTI erano ulcere ischemiche del piede diabetico, area dell’ulcera 15 ± 15 cm

. I soggetti presentavano valori di emoglobina glicata (HbA

) di 8,25 ± 0,04% ed erano sottopo- sti a terapia insulinica (0,5 U/kg) o a terapia ipoglicemizzante orale (glibenclamide, 15 mg/die, Tab. 1). I fattori di inclusione erano: non fumatori con ulcere di almeno 30 giorni, piede dia- betico < stadio Wagner 4, pressione arteriosa alla caviglia ≥ 50 mmHg, ossimetria transcutanea basale (pTcO

) ≥ 20 mmHg.

Pazienti con altre malattie (infiammazioni, malattie reumatiche ed endocrine) e soggetti sottoposti a trattamenti farmacologici o a supplementazione antiossidante sono stati esclusi dallo studio. I pazienti sono stati randomizzati e divisi in due gruppi, gruppo R

-acido lipoico (gruppo R

-AL) e gruppo placebo (gruppo PL) e lo studio condotto in doppio cieco. Alla prima sessione OTI, i soggetti ricevevano 300 mg di R

-acido lipoico (1 capsula) o placebo (1 capsula) un’ora prima dell’esposizio- ne all’ossigeno e una capsula immediatamente dopo la tera- pia. Successivamente, i pazienti hanno continuato ad assume- re l’antiossidante o il placebo (2 capsule al giorno) per 6 setti- mane (tempo medio di durata di un ciclo OTI).

Protocollo iperbarico

I pazienti sono stati sottoposti a 30 trattamenti OTI consecutivi (1 sessione al giorno, 5 giorni/settimana) come da protocollo adottato per le ulcere cutanee croniche. La camera iperbarica (Galeazzi, La Spezia, Italia) era pressurizzata con aria compres-

sa e i pazienti respiravano ossigeno al 100% alla pressione di 2,5 atmosfere attraverso una maschera oro-nasale. Il trattamen- to consisteva nella respirazione di ossigeno per tre periodi suc- cessivi di 25 minuti intervallato da 3 minuti di respirazione di aria dall’ambiente, per una durata totale della terapia di 90 minuti.

Analisi clinica delle ulcere

La valutazione clinica delle ferite è stata eseguita mediante software mouse-eye (RG Taylor, USA, 2001, disponibile su:

www.hop.man.ac.uk/staff/rtaylor); l’ossimetria transcuta- nea è stata attuata con un ossimetro Kontron Instrument a 2 canali. L’area della ferita è stata valutata in pazienti sup- plementati e non supplementati con l’enantiomero R

- acido lipoico, prima (T

) e dopo 14 (T

) e 42 (T

) giorni dal- l’inizio del trattamento OTI. I risultati sono stati espressi come variazione in percentuale dell’area a T

e T

rispet- to al valore basale (T

).

Raccolta e processamento del plasma e delle biopsie tessutali

Il sangue e il tessuto bioptico sono stati prelevati alla prima sessione OTI (prima del trattamento, T

), alla quinta sessio- ne (dopo 1 settimana di supplementazione, T

) e alla deci- ma sessione (dopo 14 giorni di supplemetazione (T

). Il

* *

* *

*

*

*

Figura 2 Concentrazione tessutale e plasmatica della MMP2 totale e attiva in pazienti supplementati e non sup- plementati con R

-acido lipoico sotto- posti a OTI. I livelli di MMP2 sono stati determinati nel tessuto bioptico (A) e nel plasma (B) di soggetti supplemen- tati (gruppo R

-AL) e non supplemen- tati (gruppo PL) al primo trattamento OTI (T

), alla quinta sessione di tratta- mento iperbarico (T

) e dopo 10 giorni di terapia OTI (T

). °T

e T

vs T

; *grup- po R

-AL vs gruppo PL, p < 0,05.

A

B

Gruppo PL

T0 T1 T2 T0 T1 T2

T0 T1 T2 T0 T1 T2

*T1 e T2 vs T0, p < 0,05 Non-attiva Attiva 250

200 150 100 50 0

2000

1500

1000

500

0

2500 2000 1500 1000 500 0 300

200

100

MMP2 biopsia (ng/mgP) MMP2 plasma (ng/ml) MMP2 plasma (ng/ml) MMP2 biopsia (ng/mgP) 0

Gruppo R ⁺ -AL

sangue periferico (10 ml) raccolto in provette con eparina, è stato immediatamente centrifugato a 1000× g per 15 minuti e il plasma ottenuto è stato conservato a –80 °C fino all’analisi in ELISA. Campioni di 5 mm di tessuto bioptico sono stati presi al centro della ferita. Il prelievo bioptico è stato immediatamente congelato a –20 °C per l’analisi in ELISA. Questi ultimi sono stati omogeneizzati in un tampo- ne di lisi (50 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 7,4) e suc- cessivamente centrifugati a 12.000× g per 5 minuti per rimuovere il particolato. Il sovranatante è stato analizzato per il contenuto proteico (Bradford, Sigma, St Louis CA), e conservato a –80 °C.

Determinazione dell’attività enzimatica delle MMP2 e MMP9

L’attività enzimatica delle MMP2 e MMP9 è stata analizza- ta nelle biopsie e nel plasma mediante kit ELISA (Amersham Biosciences, NJ). Anticorpi specifici per le MMP2 e MMP9 sono attaccati sul fondo di una piastra a 96 pozzetti. La forma attiva delle MMPs presenti nel tessuto bioptico e nel plasma viene catturata dagli anticorpi speci- fici dopo incubazione per l’intera notte. Dopo quattro lavaggi, vengono aggiunti 50 µl di reagente di rivelazione.

Dopo incubazione a 37 °C per 3-4 ore, l’assorbanza dei campioni viene letta alla lunghezza d’onda di 405 nm in un

lettore ELISA (Sunrise, Tecan, Milano, Italia). La concentra- zione delle forma attiva delle MMPs è stata estrapolata da una retta standard e l’attività calcolata come cambi di assorbanza a 405 nm per ora, moltiplicata per un fattore 1000 ed espressa come unità per ml (U/ml).

Determinazione della concentrazione

dei fattori angiogenetici e delle metalloproteinasi

La concentrazione dei fattori implicati nell’angiogenesi (vascu- lar endothelial growth factor, VEGFβ, fibroblastic growth factor, bFGF, platelet derived growth factor, PDGF-BB, interleuchine IL-1 β e IL-6, tumor necrosis factor, TNF α ) e delle metallopro- teinasi della matrice (MMP2, MMP9) e dei loro inibitori (tissue inhibitor metalloproteinase, TIMP1, TIMP2) è stata determina- ta nei lisati bioptici e nel plasma mediante metodica multiplex sandwich ELISA (SearchLight, Pierce Biothecnology, Rockford, IL). Ogni pozzetto della micropiastra è stato ricoperto con anticorpi specifici ai quali si legano le proteine corrispondenti presenti nel campione. Dopo opportuni lavaggi, la rivelazione è stata eseguita mediante reazione biotina-streptoavidina e il segnale chemiluminescente rilevato con SearchLight CCD Imaging System.

Ogni campione è stato determinato in duplicato e la con- centrazione espressa in ng/mg proteina per le biopsie e in ng/ml per il plasma.

Tabella 2 MMPs attiva/totale e complesso MMPs/TIMPs in soggetti supplementati e non supplementati con R ⁺ -acido lipoico sottoposti a OTI.

A

Biopsia Gruppo PLGruppo R ⁺ -AL

T ₀ T ₁ T ₂ T ₀ T ₁ T ₂

MMP2att/MMP2tot 0,69 ± 0,27 0,60 ± 0,56 0,46 ± 0,66 0,47 ± 0,55 0,92 ± 0,87* 0,74 ± 0,22*

MMP9att/MMP9tot 0,22 ± 0,03 0,16 ± 0,03 0,21 ± 0,04 0,27 ± 0,28 0,34 ± 0,25 0,13 ± 0,14*

MMP2/TIMP1 1,00 ± 0,84 0,89 ± 0,50 0,53 ± 0,08* 1,74 ± 0,45 3,96 ± 3,71* 4,79 ± 2,95*

MMP2/TIMP2 2,26 ± 2,24 6,43 ± 6,44 2,02 ± 1,61 2,20 ± 2,53 2,01 ± 2,53 6,06 ± 1,90*

MMP9/TIMP1 1,60 ± 0,03 2,32 ± 1,25 1,70 ± 0,57 2,46 ± 0,56 2,35 ± 1,46 1,36 ± 0,79*

MMP9/TIMP2 3,38 ± 3,06 17,11 ± 7,33* 5,86 ± 3,81* 3,19 ± 3,61 3,44 ± 3,80 2,10 ± 3,84*

B

Plasma Gruppo PLGruppo R ⁺ -AL

T ₀ T ₁ T ₂ T ₀ T ₁ T ₂

MMP2att/MMP2tot 1,12 ± 1,40 0,84 ± 0,91 0,70 ± 1,07* 1,18 ± 0,83 1,94 ± 1,35* 1,50 ± 1,02*

MMP9att/MMP9tot 1,26 ± 1,56 1,57 ± 0,49 0,82 ± 0,70* 1,02 ± 0,80 0,73 ± 1,00 0,57 ± 0,49*

MMP2/TIMP1 3,07 ± 2,17 1,57 ± 0,55* 1,24 ± 2,02* 2,53 ± 0,29 1,94 ± 0,67 15,90 ± 12,46*

MMP2/TIMP2 3,80 ± 0,94 3,15 ± 0,92 2,26 ± 1,88* 4,36 ± 1,50 3,79 ± 1,17 29,55 ± 18,81*

MMP9/TIMP1 0,91 ± 0,69 0,75 ± 1,00 0,67 ± 0,76* 0,87 ± 0,36 0,80 ± 0,92 0,30 ± 0,68*

MMP9/TIMP2 2,32 ± 1,39 2,37 ± 0,92 2,34 ± 1,47 2,83 ± 3,04 2,30 ± 2,44 3,17 ± 2,85

*p < 0,05, T1 e T2 vs T0.

Figura 3 Concentrazione tessutale e plasmatica della MMP9 totale e attiva in pazienti supplementati e non supple- mentati con R

-acido lipoico sottoposti a OTI. I livelli di MMP9 sono stati deter- minati nel tessuto bioptico (A) e nel pla- sma (B) di soggetti supplementati (gruppo R

-AL) e non supplementati (gruppo PL) al primo trattamento OTI (T

), alla quinta sessione di trattamento iperbarico (T

) e dopo 10 giorni di tera- pia OTI (T

). °T

e T

vs T

; *gruppo R

- AL vs gruppo PL, p < 0,05.

Analisi statistica

I test non parametrici di Kruskal-Wallis e Mann-Whitney sono stati usati per determinare le differenze significative della concentrazione e dell’attività delle MMPs e i livelli dei fattori di crescita tra i tre punti di prelievo (T

, T

, T

) e tra i gruppi. I valori di p < 0,05 sono stati considerati statistica- mente significativi. L’analisi statistica è stata condotta mediante l’uso del programma statistico SPSS versione 11.0 (SPSS, Chicago, IL).

Risultati

Concentrazione tessutale e plasmatica delle MMP2, MMP9 e dei loro inibitori TIMP1, TIMP2

Il livello proteico di MMP2 e MMP9 sia nel tessuto bioptico sia nel plasma è stato valutato sia come proteina totale sia come attività proteica. Come mostrato in figura 2, la MMP2 non attiva e la sua forma attiva diminuivano leggermente in seguito al trattamento OTI (gruppo PL). Nel gruppo R

-AL, la MMP2 totale e la sua attività aumentavano significativa- mente al tempo T

, come osservato sia nella biopsia sia nel plasma. Il rapporto MMP2 attiva/MMP2 totale era significa- tivamente ridotto a T

nel gruppo PL, contrariamente a quanto osservato nel gruppo R

-AL nel quale tale rapporto

aumentava a livello sia tessutale sia plasmatico (Tab. 2 A, B). Un andamento opposto è stato osservato per la MMP9 la cui espressione e attività erano indotte dal trattamento OTI. La supplementazione con R

-acido lipoico riduceva le concentrazioni della MMP9 sia a livello dell’ulcera sia a livel- lo plasmatico (Fig. 3), mostrando di conseguenza un ridot- to rapporto MMP9 attiva/MMP9 totale (Tab. 2 A, B). I livelli di TIMP1 e TIMP2 non subivano cambiamenti durante la terapia OTI e non erano significativamente diversi tra i grup- pi (dati non mostrati). I TIMPs rivestono un ruolo chiave nella regolazione dell’attività enzimatica delle MMPs; l’atti- vità delle MMPs è inibita dal legame dei TIMPs in un rap- porto molare di 1:1. Di conseguenza un controllo bilancia- to dei complessi MMPs/TIMPs è necessario per un regola- re processo di riparazione. Comunque, iI complesso MMP2/TIMP1 e MMP2/TIMP2 era significativamente aumentato al tempo T

nel gruppo R

-AL (Tab. 2 A, B).

L’acido R

-lipoico determinava anche una riduzione del complesso MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2 osservato al punto T

(Tab. 2 A, B).

Concentrazione plasmatica delle citochine IL-1 β , IL-6, TNF α

L’incremento dei livelli delle proteasi, includendo le MMPs, è stato associato alla presenza, a livello dell’ulcera, di cellule infiammatorie (leucociti e monociti) e alla presenza di elevate

*

* B

A

Gruppo PL

T0 T1 T2 T0 T1 T2

T0 T1 T2 T0 T1 T2

*T1 e T2 vs T0, p < 0,05 250

200 150 100 50 0

600

400

200

0 600

400

200

0

400

300 200

100

MMP9 biopsia (ng/mgP) MMP9 plasma (ng/ml) MMP9 biopsia (ng/mgP) MMP9 plasma (ng/ml) 0

Gruppo R ⁺ -AL

citochine proinfiammatorie

. Quindi, le citochine IL-1β, IL-6 e TNFα sono state valutate nel plasma di pazienti supple- mentati e non supplementati con R

-acido lipoico che erano sottoposti a terapia OTI. Come mostrato in figura 4, non sono stati osservati cambiamenti significativi nei due gruppi (gruppo PL e gruppo R

-AL) per quanto riguarda TNF α . Contrariamente, i livelli plasmatici di IL-1β e IL-6 aumentava- no in seguito a trattamento OTI nei pazienti che ricevevano placebo, probabilmente per i processi infiammatori, mentre l’R

-acido lipoico inibiva marcatamente l’espressione di tali citochine.

Livelli tessutali e plasmatici

dei fattori di crescita PDGF-BB, bFGF, VEGF β

È noto che l’infiammazione a livello dell’ulcera determina distruzione tessutale, coinvolgendo la degradazione del proteoglicano e del collagene, dei fattori di crescita, della fibronectina e dei fattori che inibiscono le proteasi. Sono stati, quindi, esaminati in entrambi i gruppi i livelli tessutali e plasmatici dei fattori di crescita quali VEGFβ, bFGF e PDGF-BB. Un significativo incremento della concentrazio- ne del VEGFβ e del bFGF è stato osservato nel gruppo pla- cebo in seguito al trattamento con ossigeno. La supple- mentazione con l’antiossidante inibiva l’espressione del VEGFβ e del bFGF, ma induceva, rispetto al gruppo PL, un significativo aumento della concentrazione tessutale e pla- smatica del PDGF-BB (Fig. 5).

L’R ⁺ -acido lipoico accelera il processo di guarigione delle ulcere croniche trattate con OTI

Dall’analisi clinica si è evidenziato che il solo trattamento iperbarico determinava una leggera riduzione dell’area della ferita del 2,1 ± 6,2% e del 5,7 ± 43,3% rispettiva- mente dopo 14 e 42 giorni di trattamento iperbarico. La somministrazione giornaliera di R

-acido lipoico accele- rava efficacemente il processo di guarigione determi- nando una significativa riduzione della ferita, osservata dopo 42 giorni di trattamento, del 40,8 ± 37,2%, p = 0,02 (Fig. 6).

Discussione

L’ulcera cronica è una seria complicazione del diabete mellito. La ferita spesso non cicatrizza a causa di una per- sistente e alta concentrazione di citochine proinfiammato- rie presenti nel sito dell’ulcera, portando a sua volta a un aumento della concentrazione delle proteasi. Queste ulti- me di conseguenza provvedono a degradare diversi fatto- ri di crescita e proteine della matrice, fattori essenziali per il normale processo di cicatrizzazione

. Una riduzione dell’attività delle MMPs nell’essudato raccolto dalle ferite croniche è stato descritto da altri autori. Tale riduzione

veniva associata all’inizio di guarigione dell’ulcera

. Una significativa riduzione della MMP9 e del complesso MMP9/TIMP1, associata a un aumento dell’attività della MMP2 e dei livelli del complesso MMP2/TIMP1 e MMP2/TIMP2 è stata osservata sia nelle biopsie sia nel plasma del gruppo R

-AL. Le MMP2 e MMP9 sono forte- mente implicate nel processo di cicatrizzazione, in quan- to degradano il collagene tipo IV e V della membrana basale e il collagene tipo I nell’interstizio

permettendo la

*

*

Figura 4 Concentrazione plasmatica delle citochine IL-1β, IL- 6, e TNFα in pazienti supplementati e non supplementati con acido R-lipoico sottoposti a OTI. I livelli di citochine IL-1β, IL-6, e TNFα sono stati determinati nel plasma di sog- getti supplementati (gruppo R

-AL) e non supplementati (gruppo PL) al primo trattamento OTI (T

), alla quinta sessione di trattamento iperbarico (T

) e dopo 10 giorni di terapia OTI (T

). °T

e T

vs T

; *gruppo R

-AL vs gruppo PL, p < 0,05.

T0 T1 T2

T0 T1 T2

T0 T1 T2

14 12 10 8 6 4 2 0

20 16 12 8 4 0

60

40

20

0

IL-1 β (ng-ml) IL-6 (ng-ml) TNF α /ng/ml)

°T1 e T2 vs T0, *gruppo AL vs gruppo PL, p < 0,05 Gruppo PL

Gruppo R

-AL

*

*

*

* *

*

*

*

*

*

Figura 5 Concentrazione tessutale e plasmatica dei fattori di crescita PDGF-BB, bFGF, e VEGFβ in pazienti supplementati e non supplementati con acido α-lipoico sottoposti a OTI. I livelli dei fattori di crescita PDGF-BB, bFGF, e VEGFβ sono stati determinati nel tessuto bioptico e nel plasma di soggetti supplementati (gruppo R

-AL) e non supplementati (gruppo PL) al primo trattamento OTI (T

), alla quinta sessione di trattamento iperbarico (T

) e dopo 10 giorni di terapia OTI (T

). °T

e T

vs T

; *gruppo R

-AL vs gruppo PL, p < 0,05.

MMP2 interviene nel processo di guarigione più tardiva- mente, ed è coinvolta nei cambiamenti strutturali del tes- suto

. L’induzione selettiva della MMP2 e l’inibizione della MMP9 indotta dall’R

-acido lipoico può promuovere la cicatrizzazione della ferita non solo stimolando la migra- zione cellulare, ma anche prevenendo l’infiammazione. La transiente comparsa delle MMPs a livello della membrana basale dell’epitelio in proliferazione implica che l’espres- sione delle MMPs, durante la riparazione della ferita, è regolato efficientemente dal punto di vista sia spaziale sia temporale. Questo efficiente sistema di controllo viene mediato dall’azione dei fattori di crescita e delle citochine che sono transitoriamente presenti nella fase infiammato- ria

. I cheratinociti e le cellule endoteliali sono sorgenti di MCP-1 e IL-8; tali citochine sono over-regolate duran- te il normale processo di riparazione dell’ulcera

e sono responsabili dell’innesco dell’infiammazione.

Un’infiammazione autoregolata è un normale e necessario prerequisito per l’attivazione dei fibroblasti e per la sintesi di nuova matrice. Diversamente, un’infiammazione sostenuta e con una prolungata persistenza di neutrofili e monociti nella sede della ferita inibisce la normale cicatrizzazione

. migrazione cellulare

. L’incremento dell’attività della

MMP2 indotta dall’R

-acido lipoico è un evento positivo per la cicatrizzazione. Infatti la MMP2 non solo regola il rimodellamento della matrice extracellulare, ma svolge anche un effetto antinfiammatorio, modulando la protei- na-3 chemiotattica dei monociti (monocyte chemotactic protein-3, MCP-3), una chemochina che promuove la chemiotassi leucocitaria

. La MMP2 è una delle metallo- proteinasi più efficienti nel tagliare e inattivare la MCP-3, determinando non solo il blocco dell’inizio di una risposta infiammatoria, ma inibendo un’infiammazione preesisten- te

. Al contrario, la MMP9 non disattiva la MCP-3, ma taglia e attiva le citochine proinfiammatorie IL1β e IL8, potenziando la loro attività

, inducendo un innalzamento del flusso leucocitario e di conseguenza un aumento del processo infiammatorio. È ben noto che la MMP9 prefe- renzialmente degrada la matrice extracellulare nelle prime fasi del processo di cicatrizzazione. I livelli di MMP9 si innalzano nelle due prime settimane dal danno, decre- scendo poi ai valori basali tra le due e le quattro settima- ne. Questo coincide con il tempo al quale inizia il proces- so angiogenico in cui viene formato nuovo tessuto

. La

T0 T1 T2 Biopsia

Gruppo PL Gruppo R

-AL

Plasma

T0 T1 T2

T0 T1 T2 T0 T1 T2

T0 T1 T2 T0 T1 T2

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

50 40 30 20 10 0 12 10 8 6 4 2 0

PDGF-BB /ng/mgP)

40

30

20

10

0

PDGF-BB /ng/mgP)

3

2

1

0

bFGF (ng/ml)

bFGF (ng/mgP) VEGF β (ng/mgP)

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0

VEGF β (ng/ml)

°T1 e T2 vs T0, *gruppo AL vs gruppo PL, p < 0,05

*

* ¹

* ⁵

Figura 6 Valutazione clinica delle ferite in soggetti supple- mentati (gruppo R

-AL) e non supplementati (gruppo PL) sottoposti a OTI. L’area della lesione è stata calcolata mediante programma mouse-eyes. Le ulcere sono state analizzate dopo 14 giorni (T

) e 42 giorni (T

) di OTI. I risul- tati sono stati espressi come variazione in percentuale dell’a- rea a T

e T

rispetto al valore basale (T

).

In questo studio abbiamo osservato che i prelievi bioptici di ulcere diabetiche croniche mostravano elevati livelli di cito- chine e fattori di crescita. La terapia OTI induceva un aumen- to dei fattori di crescita bFGF e VEGFβ e delle citochine proinfiammatorie IL-1β, IL-6 a livello sia tessutale sia plasma- tico. La supplementazione con R

-acido lipoico riduceva marcatamente i livelli di tali molecole.

IL-1β e IL-6 agiscono come citochine proinfiammatorie e la loro inibizione contribuisce a sopprimere il processo infiam- matorio. Analogamente, il PDGF-BB rappresenta un fattore chemiotattico per i monociti e i fibroblasti regolando il pro- cesso di angiogenesi

. Il PDGF-BB accelera la granulazio- ne tessutale e la deposizione di matrice extracellulare

. In questo studio, abbiamo osservato che l’R

-acido lipoico induce significativamente l’espressione proteica per PDGF- BB determinando un incremento della sua concentrazione a livello tessutale e plasmatico. Diversamente, una riduzione dei livelli del PDGF-BB è stata osservata nel gruppo place- bo. Alcuni autori hanno dimostrato che in ferite con difetti di riparazione, il processo di cicatrizzazione veniva stimolato applicando alcuni fattori polipeptidici di crescita, quali il FGF e il PDGF-BB

. Questo ha contribuito all’uso del PDGF-BB ricombinante nel trattamento delle ulcere diabetiche. Infatti il PDGF-BB promuove la fase infiammatoria/proliferativa di riparazione con la deposizione di nuova matrice senza distruggere la normale sequenza di eventi di guarigione, diversamente da quanto osservato per altri fattori di cresci- ta, quali il FGF e il TGFβ che alterano il normale processo di cicatrizzazione

. In questo studio, sebbene preliminare per il numero dei casi esaminati, abbiamo osservato che nelle ulcere diabetiche croniche i fattori proinfiammatori erano altamente espressi. L’infiammazione cronica e la contamina- zione batterica stabiliscono insieme un circolo autocrino

positivo che contribuisce a mantenere l’ulcera in uno stato cronico. Una scarsa e compromessa ossigenazione rappre- senta un fattore che limita il processo di cicatrizzazione, per- tanto un adeguato trattamento OTI è necessario per stimo- lare la rigenerazione tessutale.L’R

-acido lipoico inibisce lo stato infiammatorio cronico, modificando il rapporto protea- si/antiproteasi a livello del microambiente della ferita. Il decremento di espressione della MMP9 e l’aumento della MMP2, unito a un aumentato livello del PDGF-BB, contribui- scono ad accelerare il processo di riparazione dell’ulcera come osservato dopo 42 giorni di trattamento, suggerendo un ruolo benefico della supplementazione con R

-acido lipoi- co nel trattamento delle ferite croniche (Fig. 1).

Ringraziamenti

Si ringrazia la ditta MDM, Milano, per aver generosamente fornito la molecola R

-acido lipoico (Patiox capsule).

Conflitto di interessi

Nessuno.

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T ₁₄ T ₄₂ 100

0

-100

-200

*p = 0,02

N = 10 10 10 10

Gruppo PL Gruppo R ⁺ -AL

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