Scopo della tesi
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Scopo della tesi
Il progetto in cui si inserisce il mio lavoro di tesi si propone di testare nanoparticelle magnetiche funzionalizzate come strumento per la somministrazione di farmaci oculari in grado di localizzare specificatamente nella regione posteriore dell’occhio. Nel presente lavoro di tesi ci proponiamo di mettere a punto un protocollo per la funzionalizzazione delle MNP, di caratterizzare i nanofarmaci prodotti e di studiarne la localizzazione intraoculare utilizzando come sistema modello lo zebrafish. In particolare in tale studio è stato utilizzato un modello transgenico doppio mutante
(roy-/-;nacre-/-;Tg(kdrl:egfp)s483 la cui peculiare caratteristica è l’espressione della proteina GFP
nelle cellule endoteliali, che consente la visualizzazione in vivo in fluorescenza dell’intero sistema vascolare. Avendo a disposizione tale modello, è stato dunque naturale scegliere come farmaco “reporter” il VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor), principale fattore pro-angiogenico, e in particolare l’isoforma
umana 165 essendo questa la più abbondante e quella maggiormente implicata nel processo neo-angiogenico.
Il primo obiettivo è stato produrre VEGF funzionante in E. coli in quantità sufficienti per la funzionalizzazione (mg) e, nello specifico, produrlo come proteina ricombinante che abbia un tag da sfruttare per la purificazione o come
linker nel legame alla nanoparticella. L’utilizzo di molecole commerciali infatti è
una strategia non perseguibile: in primo luogo, economicamente non sostenibile a causa della quantità di proteina necessaria per lo svolgimento dello studio (qualche decina di milligrammi) e in secondo luogo per la necessità di avere una
tag per la reazione di funzionalizzazione alle MNP.
Il secondo obiettivo è stato, dunque, la funzionalizzazione delle nanoparticelle magnetiche con la proteina ricombinante prodotta. Le MNP-rVEGF prodotte sono
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quindi state caratterizzate e successivamente testate in zebrafish allo scopo di valutare se la reazione chimica di funzionalizzazione tra VEGF ricombinante e MNP avesse alterato la bioattività del reporter utilizzato. Per il raggiungimento di tale scopo è stato necessario mettere a punto un sistema di neo-angiogenesi in zebrafish che consiste nell’induzione di angiogenesi nella regione SIV, in accordo al modello più consolidato in letteratura per lo studio dell’angiogenesi in embrioni di zebrafish.
Avendo confermato una bioattività inalterata dell’rVEGF nel complesso rVEGF, il passo successivo è stato dunque la valutazione degli effetti delle MNP-rVEGF a seguito di iniezione nell’occhio di zebrafish, valutando la biodistribuzione e la localizzazione delle particelle iniettate nei diversi compartimenti oculari.
