8.1. VALUTAZIONE MORFOLOGICA 8.1.1 MICROSCOPIA OTTICA

(1)

64 CAPITOLO 8

RISULTATI SPERIMENTAZIONE IN VIVO

SESSIONE I

8.1. VALUTAZIONE MORFOLOGICA

8.1.1 MICROSCOPIA OTTICA – EMATOSSILINA/EOSINA

Nel tessuto renale sano (Fig. 8 e 9) come in quello del gruppo controllo ma trattato con RSV (Fig. 10 e 11) si può osservare la normale struttura morfologica; in particolare nella zona cortico-midollare (Fig. 8 e 10) è visibile la struttura glomerulare,ben conservata, con il glomerulo espanso con poco spazio urinifero ed una notevole cellularità glomerulare; i tubuli presentano un aspetto trofico, con lume generalmente ristretto per la presenza di cellule dell’epitelio tubulare voluminose. Invece, nella zona midollare (Fig. 9 e 11) è visibile solo la struttura tubulare.

(2)

65

Fig. 10 Cont. RSV cortico-midollare Ingr.40X Fig. 11 Cont. RSV midollare Ingr.40X L’analisi delle sezioni di tessuto di animali che hanno subito l’insulto ischemico di 40’ e sacrificati dopo 24h di riperfusione (Fig. 12 e 13) evidenzia alterazioni delle strutture tubulari e glomerulari; in particolare nella zona cortico-midollare (Fig. 12) si possono osservare, ialinizzazione glomerulare, ipocellularità, collasso glomerulare e presenza di microaneurismi. Inoltre è ben evidente una estesa condizione di morte ed atrofia tubulare, con rilevanti fenomeni di tubuloressi.

Nella zona midollare (Fig. 13) il tessuto appare ulteriormente danneggiato, testimoniato dalla presenza di atrofia tubulare e fenomeni di tubuloressi.

(3)

66

Negli animali del gruppo RSV+I/R che hanno subito un insulto ischemico, ma a cui è stato somministrato RSV, si può osservare dopo 24h di riperfusione glomeruli integri e riduzione della necrosi a livello della zona cortico-midollare (Fig. 14).

Anche la a livello della zona midollare si osserva come la struttura sia maggiormente preservata rispetto al gruppo ischemico (Fig. 15).

(4)

67 * p < 0.05 vs g0 e vs controllo g1 # p < 0.05 vs g0 e vs controllo e I/R g1 8.2 PARAMETRI FUNZIONALI 8.2.1 PROTEINURIA

Fig.16 Proteinuria espressa come variazione incrementale vs basale dopo 24h dall’insulto ischemico.

Giorno 0 Giorno 1

Cont I/R RSV+ I/R Cont I/R RSV+ I/R

Media 1,00 0,92 1,00 1,00 2,73 1,59

Dv.st 0,647 0,747 0,796 0,647 1,850 0,714

Er.st 0,264 0,236 0,213 0,264 0,585 0,191

Data la variabilità osservata nella concentrazione proteica urinaria degli animali, lo studio della proteinuria è stato fatto valutando la variazione incrementale di questo parametro in ogni animale rispetto al baseline (g0): la media delle misurazioni effettuate per ogni gruppo sperimentale è stata usata come valore di riferimento g0 (Fig. 16).

Come riportato in Fig.16 dopo 24h (g1) il gruppo “Cont” non mostra variazioni significative rispetto al g0, mentre nel gruppo I/R si osserva un aumento significativo rispetto ai livelli basali del

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Cont I/R RSV+ I/R Cont I/R RSV+ I/R

*

# Tab.1 vs b asal in e

(5)

68

g0 dei tre gruppi sperimentali e rispetto agli incrementi dei gruppi “Cont” e “RSV+I/R” al g.1 (I/R 2,73±0,58 vs “Cont” 1,00±0,26 e vs “RSV I/R” 1,59±0,19; p<0,05).

Negli animali con I/R ma iniettati con RSV si osserva un aumento significativo (p<0,05) della proteinuria rispetto sia ai valori basali dei tre gruppi sperimentali al g0, sia ai valori dei gruppi “Cont” al g1 (RSV+I/R 1,59±0,19 vs “Cont” 1,00±0,26; p<0,05); tuttavia la variazione di proteinuria risulta significativamente ridotta rispetto al gruppo I/R del g.1 (RSV+I/R 1,59±0,19 vs I/R 2,73±0,58; p<0,05).

(6)

69 8.2.2 CREATININA PLASMATICA

Fig.17 Creatinina plasmatica espressa in mg/dl

Cont Cont RSV I/R RSV + I/R

Media mg/dl 0,50 0,32 1,29 0,79

Dv st 0,202 0,171 0,863 0,261

Er.st 0,067 0,085 0,273 0,070

Test T vs Cont p<0,05 0,067

Test T vs isk 0,108

I dati ottenuti (Fig. 17) dall’analisi della creatinina plasmatica dopo 24h dall’evento ischemico mostrano come la somministrazione di 1h RSV 10µM non determina una variazione dei livelli di creatinina rispetto a quella osservata nel gruppo “Cont” (RSV 0,325±0,085 mg/dl vs Cont 0,50±0,067 mg/dl). L’evento ischemico e la successiva riperfusione di 24h determina nel gruppo I/R un aumento significativo (p<0,05) dei valori rispetto al gruppi “Cont” (I/R 1,29±0,273 mg/dl vs Cont 0,50±0,067 mg/d; p<0,05). Diversamente gli animali trattati con RSV 1h prima dell’ischemia di 40’ e la riperfusione di 24h [RSV +I/R] mostrano valori di creatinina plasmatica ridotti, ma non significativi, rispetto a quelli del gruppo “I/R” (RSV+I/R 0,79±0,070 mg/dl vs I/R 1,29±0,273 mg/dl; p=0,108) e non statisticamente diversi dal gruppo “Cont”, anche se con un trend incrementale (p=0,069) (RSV +I/R 0,79±0,070 mg/dl vs “Cont” 0,50±0,067 mg/dl).

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2

Cont Cont RSV I/R RSV + I/R

*

Tab.2 * p<0,05 vs il Cont. m g/d l

(7)

70 8.3 ESPRESSIONE DELLA COX-2

Cont I/R RSV+ I/R

Media 1,00 2,50 0,82

Dv st 0,060 0,262 0,099

Er.st 0,043 0,151 0,070

Test T vs Cont p<0,01 0,159

Test T vs I/R p<0,05

Dall’immagine relativa all’analisi dell’espressione dell’enzima COX-2 attraverso il Western Blot (Fig. 19) si può osservare come dopo 24h, nel gruppo “Cont” sono presenti bande anche se poco intense, mentre nel gruppo “I/R” dove gli animali sono stati sottoposti a 40’ di ischemia e 24h di riperfusione le bande sono ben visibili e ampiamente marcate. Infine si può osservare come le bande nel gruppo trattati con RSV i.v. 1h prima dell’insulto ischemico “RSV+I/R” sono pressoché assenti.

0 1 2 3

Cont I/R RSV+ I/R

#

*

Fig.19 Analisi W.B dopo 24h dalla fine dell’ischemia “Cont” “RSV+I/R” “I/R”

# p<0,01 vs cont

*

P<0,05 vs I/R Fig.18

Tab.3

(8)

71

Dal grafico (Fig. 18) si può osservare come l’insulto ischemico seguito da 24h di riperfusione nel gruppo “I/R” determina un aumento significativo dell’espressione della COX-2 rispetto a quella del gruppo “Cont” (I/R 2,50±0,151 vs “Cont” 1,00±0,043; p<0,01).

Diversamente nel gruppo a cui è stato iniettato RSV e dopo 1h sottoposto a I/R “gruppo RSV+I/R” si osserva come l’espressione dell’enzima non presenta variazioni significative rispetto al gruppo “Cont” (RSV+I/R 0,82±0,070 vs “Cont” 1,00±0,043) ed è significativamente ridotta rispetto a quella del gruppo sottoposto a I/R ma non trattato con RSV (RSV+I/R 0,82±0,070 vs I/R 2,50±0,151; p<0,05).

(9)

72

8.4 ANDAMENTO SEGNALI MOLECOLARI GRUPPO I/R

8.4.1 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE ERK

Cont ISK I/R 5' I/R 90' I/R 24h

Media 1,00 13,86 1,37 4,50 2,12

Dv st 0,110 5,811 0,553 1,677 1,173

Er.st 0,078 2,905 0,247 0,839 0,677

Test T p<0,05 0,420 p<0,05 0,291

In figura 20 e in tabella 4 sono riportati i dati relativi all’attivazione di ERK ½ espressa come rapporto tra pERK ed ERK totale.

La valutazione dell’attivazione di ERK 1/2 attraverso il Western Blot (Fig. 20 e Fig.21) mostra come durante il periodo di Ischemia si verifichi una rapida attivazione della via ERK 1/2, infatti

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Cont ISK I/R 5' I/R 90' I/R 24h

* * * p<0,05 vs Cont Fig.21 Fig.20 Tab.4

(10)

73

negli animali sacrificati al termine dell’ischemia di 40’; l’attivazione determina un aumento significativo della fosforilazione di ERK 1/2 rispetto al gruppo “Cont” non ischemizzato (ISK 13,86±2,90 vs Cont 1,00±0,08; p<0,05).

Durante la successiva riperfusione il segnale si attenua, tornando dopo 5’ di riperfusione [ gruppo I/R 5’] a valori vicini a quelli del gruppo “Cont” (I/R 5’1,37±0,25 vs Cont 1,00±0,08), mentre dopo 90’ [gruppo I/R 90’] torna ad essere significativamente maggiore rispetto al gruppo Cont (I/R 90’4,50±0,83 vs Cont 1,00±0,08; p<0,05).

Dopo 24h di riperfusione [gruppo I/R 24h] i livelli di fosforilazione di ERK 1/2 si riducono rispetto al gruppo I/R 90’; anche se si può osservare un trend positivo rispetto al gruppo “Cont” (I/R 24h 2,12±0,68 vs I/R 90’4,50±0,83 vs Cont 1,00±0,08).

(11)

74 8.4.2 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE AKT

Cont ISK I/R 5' I/R 90' I/R 24h

Media 1,00 1,65 2,66 2,38 2,41

Dv st 0,278 0,344 0,755 0,322 0,886

Er.st 0,197 0,154 0,338 0,186 0,443

Test T 0,065 p<0,05 p<0,01 0,105

In Fig. 22 ed in Tab 5 sono riportati i dati relativi all’analisi delle bande dell’attivazione di Akt espressa come rapporto tra pAKT e AKT totale, ottenuta tramite la tecnica del Western blot.

La valutazione dell’attivazione di AKT attraverso il Western Blot (Fig. 22 e Fig. 23) evidenzia un aumento non significativo di questo segnale durante il periodo di Ischemia [gruppo ISK] (ISK 1,65±0,154 vs Cont 1,00±0,197; p=0,06); tale incremento diventa significativo nella successiva

0 1 2 3 4

Cont ISK I/R 5' I/R 90' I/R 24h

*

#

* p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont. Fig.22 Fig.23 Tab.5 a.u

(12)

75

riperfusione, infatti dopo 5’ di riperfusione [ gruppo I/R 5’] si osserva un aumento significativo del rapporto pAKT/AKT tot rispetto al gruppo “Cont” (I/R 5’ 2,66±0,338 vs Cont 1,00±0,197; p<0,05). Tale aumento rimane significativamente maggiore rispetto al gruppo Cont anche dopo 90’ di riperfusione [I/R 90’] (I/R 90’2,38±0,186 vs Cont 1,00±0,197; p<0,01).

Dopo 24h di riperfusione [I/R 24h] si osservano dei livelli di attivazione non significativo, tuttavia è possibile sottolineare il trend positivo rispetto al gruppo “Cont” (I/R 24h 2,41±0,443 vs Cont 1,00±0,197).

(13)

76

8.5 ANDAMENTO SEGNALI MOLECOLARI GRUPPO RSV

Cont RSV 30' RSV 60' RSV TI RSV TI+90' RSV TI+24h

Media 1,00 4,96 4,57 3,25 1,10 0,37

Dv st 0,011 1,263 0,677 0,657 0,399 0,038

Er.st 0,008 0,729 0,479 0,465 0,230 0,027

Test T p<0,05 p<0,05 p<0,05 0,762 p<0,01

0 1 2 3 4 5 6

Cont RSV 30' RSV 60' RSV TI RSV TI+90' RSV TI+24h

*

# LEGENDA: 0’  Controllo 30’  RSV 30’ 60’  RSV 60’ TI  RSV 60’+40’ TI+90’  RSV 60’+40’+90’ TI+24h  RSV 60’+40’+24h Fig.24 Fig.25 Tab.6 * p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont. a.u

(14)

77

Con TI si intende l’intervallo di tempo comprendente i 60’ che intercorrono tra l’iniezione di RSV e l’interruzione della vascolarizzazione renale, più il tempo della fase ischemica (40’).

La valutazione dell’attivazione di ERK 1/2 attraverso il Western Blot (Fig. 24 e Fig. 25) mostra come l’infusione di resveratrolo 10µM determini una rapida attivazione della via ERK 1/2; infatti negli animali sacrificati dopo 30’ di infusione di RSV si osserva un aumento significativo del rapporto pERK 1/2/ERK Tot rispetto al gruppo “Cont” non trattato (RSV 30’ 4,96±0,729 vs Cont 1,00±0,008; p<0,05).

Anche negli animali sacrificati dopo 60’(gruppo RSV 60’) e 60’+40’(gruppo TI) si ha una significativa attivazione del segnale rispetto al gruppo “Cont” (RSV 60’ 4,57±0,479, RSV TI 3,25±0,465 vs Cont 1,00±0,008; p<0,05); infatti negli animali del gruppo “RSV TI+90’” i livelli di attivazione della proteina tornano ad essere sovrapponibili a quelli del gruppo “Cont” (RSV TI+90’ 1,10±0,230 vs Cont 1,00±0,008) fino a ridursi significativamente nel gruppo “RSV TI+24h” rispetto all’attivazione osservata negli animali non trattati “Cont” (RSV TI+24h 0,37±0,027 vs Cont 1,00±0,008; p<0,01).

(15)

78

Fig.26 8.5.2 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE AKT

Cont RSV 30' RSV 60' RSV TI RSV TI+90' RSV TI+24h

Media 1,00 0,79 0,70 1,25 5,26 3,55

Dv st 0,001 0,028 0,217 0,202 0,834 0,795

Er.st 0,001 0,020 0,153 0,142 0,590 0,459

Test T p<0,01 0,187 0,216 p<0,05 p<0,05

La valutazione dell’attivazione di AKT ottenuta tramite l’analisi delle bande (Fig. 26 e Fig. 27)dimostra come anche dopo l’iniezione di RSV questo segnale si attivi con lo spegnersi del segnale ERK 1/2: dopo 30’ dalla somministrazione i.v. di resveratrolo 10 µM i livelli di pAKT si riducono significativamente rispetto al gruppo “Cont” (RSV 30’ 0,79±0,020 vs Cont 1,00±0,001;

0 1 2 3 4 5 6 7

Cont RSV 30' RSV 60' RSV TI RSV TI+90' RSV TI+24h

#

*

LEGENDA: 0’  gruppo Controllo 30’  gruppo RSV 30’ 60’  gruppo RSV 60’ TI  gruppo RSV 60’+45’ TI+90’  gruppo RSV 60’+45’+90’ TI+24  gruppo RSV 60’+45’+24h LEGENDA: 0’  gruppo Controllo 30’  gruppo RSV 30’ 60’  gruppo RSV 60’ TI  gruppo RSV 60’+45’ TI+90’  gruppo RSV 60’+45’+90’ TI+24  gruppo RSV 60’+45’+24h * p<0,05 vs Cont

#

p<0,01vs Cont Tab.7 Fig.27 a.u

(16)

79

p<0,01) mentre a tempistiche successive, quelle dei gruppi RSV 60’ e RSV TI, i valori tornano paragonabili a quello del gruppo “Cont” (RSV 60’ 0,70±0,153, RSV TI 1,25±0,142 vs Cont 1,00±0,001). L’attivazione del segnale AKT si osserva solo per tempistiche ulteriori, come si può osservare nel gruppo RSV TI+90’, dove si registra un aumento significativo rispetto al gruppo “Cont” (RSV TI+90’ 5,26±0,590 vs Cont 1,00±0,001 p<0,05).

Nel gruppo “RSV TI+24h” pur se ridotta rispetto a quella del gruppo RSV TI+90’, i livelli di attivazione risultano significativamente maggiori rispetto a quella del gruppo “Cont” (RSV TI+24h 3,55±0,459 vs Cont 1,00±0,001; p<0,05).

(17)

80

8.6 ANDAMENTO SEGNALI MOLECOLARI GRUPPO RSV+I/R

Cont RSV+I/R RSV+I/R 5' RSV+I/R 90' RSV+I/R 24h

Media 1,00 4,55 4,46 1,56 1,04

Dv st 0,025 1,205 1,307 1,299 0,224

Er.st 0,018 0,645 0,755 0,750 0,129

Test T p<0,05 p<0,05 0,604 0,808

0 1 2 3 4 5 6

Cont RSV+I/R RSV+I/R 5' RSV+I/R 90' RSV+I/R 24h

*

* p<0,05 vs Cont Fig.29 Fig.28 Tab.8 a.u

(18)

81

La valutazione dell’attivazione di ERK 1/2 attraverso il Western Blot (Fig. 28 e Fig. 29) mostra l’andamento del segnale nel tempo in animali che hanno ricevuto la somministrazione di RSV e sono stati sottoposti al danno da ischemia e riperfusione. Gli animali hanno ricevuto RSV 10µM 60’ prima dell’ischemia (della durata di 40’) e sacrificati a tempistiche di riperfusione diverse: 5minuti (RSV+I/R 5’), 90 minuti (RSV+I/R 90’) e 24h (RSV+I/R 24h).

Dal grafico (Fig.X) si può osservare un aumento significativo dell’attivazione di ERK 1/2 rispetto agli animali del gruppo “Cont” negli animali trattati con RSV e sacrificati alla fine dell’evento ischemico (RSV+I/R) o dopo 5’ di riperfusione (RSV+I/R 4,55±0,645 e I/R 5’ 4,46±0,755 vs Cont 1,00±0,018; p<0,05). I livelli di fosforilazione di questo segnale tornano a valori basali dopo 90’: in entrambi i gruppi RSV+I/R 90’ e RSV+I/R 24h il rapporto pERK/ERK Tot risulta paragonabile a quello del gruppo Cont. (RSV+I/R90’ 1,56±0,750 e RSV+I/R 24h 1,04±0,129 vs Cont 1,00±0,018).

(19)

Cont RSV+I/R RSV+I/R 5' RSV+I/R 90' RSV+I/R 24h

Media 1,00 1,64 1,52 1,05 1,31

Dv st 0,064 0,212 0,266 0,208 0,311

Er.st 0,037 0,122 0,154 0,147 0,179

Test T p=0,05 0,082 0,777 0,275

La valutazione dell’attivazione di AKT attraverso il Western Blot (Fig. 31) mostra l’andamento del segnale nel gruppo RSV+I/R, dove il RSV 10 µM è sto somministrato i.v. 60’ prima dell’evento ischemico, della durata di 40’, seguito o meno da tempistiche diverse di riperfusione: 5 minuti (RSV+I/R 5’), 90 minuti (RSV+I/R 90’) e 24h (RSV+I/R 24h).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Cont RSV+I/R RSV+I/R 5' RSV+I/R 90' RSV+I/R 24h

§

a.u Fig.31 Fig.30 Tab.9 § p=0,05

(20)

83

Dal grafico (Fig.30) si può osservare come ci sia un trend positivo anche se non significativo solo negli animali del gruppo “ISK” rispetto agli animali del gruppo “Cont”, non sottoposti a trattamento con RSV né ad insulto ischemico (RSV+I/R 1,64±0,122 vs Cont 1,00±0,037 p=0,05). Tale trend si osserva anche dopo 5’ riperfusione (RSV+I/R 5’ 1,52±0,154 vs Cont 1,00±0,037 p=0,082).

Nei restanti gruppi sperimentali i livelli di attivazione di AKT rimangono sostanzialmente simili a quelli del gruppo “Cont” (RSV+I/R 90’ 1,05±0,147, I/R 24h 1,31±0,179 vs Cont 1,00±0,037).

(21)

84 CAPITOLO 9

SPERIMENTAZIONE IN VITRO

SESSIONE II

9.1. VALUTAZIONE ESPRESSIONE SIRT-1

Fig.32 Cont. RSV 24h Media 1,00 1,69 Dv.st 0,310 0,512 Err.st 0,103 0,209 Test T 0,006

In figura 32 e tabella 10 sono riportati i valori relativi all’analisi dell’espressione di SIRT-1 ottenuta con il Western blot, su lisati di cellule tubulari.

Dal grafico (Fig.32) si può osservare come l’incubazione di RSV 200nM per 24h determini un aumento significativo dell’espressione di SIRT-1 rispetto a quella osservata nel gruppo “Cont” (RSV 1,69±0,209 vs Cont 1,00±0,103; p<0,01). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Cont. RSV 24h

#

Tab.10 Fig.33 # p<0,01 vs Cont.

(22)

85 9.2. VALUTAZIONE ESPRESSIONE HIF2a

Nel grafico in Fig. 34 e nella tabella Tab.11 sono riportati i dati relativi alla valutazione dell’espressione di HIF-2α ottenuta tramite il Western blot.

Il grafico (Fig. 34) mostra come l’incubazione con RSV 0,2 µM per 24h determini un aumento significativo dell’espressione di HIF-2α rispetto al gruppo “Cont” (RSV 1,57±0,042 vs Cont 1,00±0,027; p<0.01). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Cont. RSV 24h

#

Cont. RSV 24h Media 1,00 1,57 Dv.st 0,038 0,060 Err.st 0,027 0,042

Test T 0,008 Tab.11 _Fig.35

Fig.34

# p<0,01 vs Cont.

(23)

86

9.3 ANALISI ANDAMENTO SEGNALI MOLECOLARI

Cont 30' RSV 30' Cont 90' RSV 90' Cont 120' RSV 120'

Media 1,01 1,56 1,00 1,53 1,00 0,24

Dv st 0,263 0,221 0,167 0,267 0,099 0,036

Er.st 0,084 0,164 0,059 0,063 0,035 0,087

Test T 0,018 0,032 0,007

0,003 vs RSV 90'

La valutazione dell’attivazione di ERK 1/2 attraverso il Western Blot (Fig. 36 e Fig. 37) evidenzia come anche l’incubazione delle cellule con RSV 0,2 µM per 30’ attivi significativamente ERK 1/2

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Cont 30' RSV 30' Cont 90' RSV 90' Cont 120' RSV 120'

*

# § Fig. 36 Fig. 37 Tab.12 * p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont. § p<0,01 vs RSV 90’ a.u

(24)

87

(RSV 30’ 1,56±0,16 vs Cont 30’ 1,01±0,08, p<0,05). Tale attivazione si osserva anche dopo 90’ dall’aggiunta di RSV (RSV 90’1,53±0,06 vs Cont 90’ 1,00±0,06, p<0,05), mentre dopo 120’ di incubazione si osserva una riduzione significativa dell’attivazione di ERK1/2; tale riduzione è significativa sia rispetto al gruppo Cont che al gruppo RSV 90’(RSV 120’ 0,24±0,09 vs Cont 1,00±0,04, p<0,01vs RSV 90’1,53±0,06, p<0,01).

(25)

88

9.3.2 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE P-AMPK/AMPKα1

Cont 30' RSV 30' Cont 90' RSV 90' Cont 120' RSV 120'

Media 1,00 0,80 1,11 1,21 1,08 2,84

Dv st 0,237 0,366 0,263 0,490 0,167 0,123

Er.st 0,084 0,164 0,093 0,245 0,059 0,087

Test T 0,244 0,315 0,000

In figura 38 e in tabella 13 sono riportati i dati relativi all’attivazione di AMPK espressa come rapporto tra di P-AMPK e AMPK α1.

Nella Fig. 38 sono riportati i dati dall’analisi delle bande ottenute attraverso il Western Blot (Fig. 39) per quanto riguarda l’attivazione di AMPK. Dopo 30’ e 90’ di incubazione con RSV 0,2 µM non si osservano variazioni significative (RSV 30’ 0,80±0,16 vs Cont 30’ 1,00±0,08 e RSV 90’

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

# Fig. 38 Fig. 39 Tab. 13 # p<0,01 vs Cont. a.u

(26)

89

1,21±0,24 vs Cont 90’ 1,11±0,09), mentre dopo 120’ di incubazione si osserva un aumento significativo dell’attivazione della proteina rispetto a quella del gruppo Cont (RSV 120’ 2,84±0,09 vs Cont 120’ 1,08±0,06).

(27)

Cont 30' RSV 30' Cont 90' RSV 90' Cont 120' RSV 120'

Media 1,00 1,97 1,00 1,07 1,00 1,12

Dv st 0,632 0,044 0,546 0,254 0,450 0,170

Er.st 0,447 0,031 0,386 0,179 0,318 0,120

Test T 0,171 0,903 0,817

La valutazione dell’attivazione di AKT ottenuta tramite l’analisi delle bande (Fig. 40 e Fig. 41) dimostra come dopo 30’ di incubazione con RSV 0,2µM ci sia solo un trend positivo rispetto al gruppo Cont (RSV 30’ 1,97±0,03 vs Cont 30’ 1,00±0,45), mentre dopo 90’ e 120’ di incubazione i livelli di attivazione di questo segnale sono pressoché sovrapponibili a quelli dei gruppi Cont (RSV 90’ 1,07±0,18 vs Cont 90’ 1,07±0,18 e RSV 120’ 1,12±0,12 vs Cont 120’ 1,00±0,12). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Tab.14 Fig. 41

Fig. 40

(28)

91 9.4 VALUTAZIONE DANNO OSSIDATIVO

9.4.1 TEST DI VITALITÀ TRIPAM BLU

H2O2 0,1 mM H2O2 0,3 mM H2O2 0,5 mM

Cont 2h 5h 18h 2h 5h 18h 2h 5h 18h

Media 6,80 18,05 21,55 14,15 87,95 96,5 96,8 89,4 96,05 99,05

Dv st 0,283 3,889 7,425 0,354 0,636 0,566 3,394 2,404 3,465 0,212 Er.st 0,200 2,750 5,250 0,250 0,450 0,400 2,400 1,700 2,450 0,150 Test T 0,055 0,107 0,039 0,002 0,001 0,018 0,012 0,016 0,002

Fig 42 e Tab 15. Valutazione a differenti concentrazioni di H2O2 e a diversi tempi di incubazione. La mortalità (espressa come % cellule morte) è stata valutata dopo 24h dall'aggiunta del H2O2.

In Fig. 42 e tabella Tab.15 sono riportati i dati della tossicità di concentrazioni diverse di H2O2 e tempi di incubazione diversi su cellule tubulari ottenuta tramite il test del Trypan Blue. L’incubazione con H2O2 alla concentrazione di 0.1 mM determina un aumento della mortalità significativo solo nelle cellule incubate con H2O2 per 18h ( H2O2 2h 14,15±0,250 % vs Cont

0 20 40 60 80 100 120 Cont 2h 5h 18h 2h 5h 18h 2h 5h 18h * * * # # # * Tab. 15 Fig. 42 * p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont. % c ell u le m or te

(29)

92

6,80±0,200 %; p<0,05); infatti nelle cellule incubate a 2h e 5h con H2O2 non si osservano variazioni significative delle sopravvivenze cellulari alle 24h rispetto al gruppo “Cont” (H2O2 2h 18,05±2,750 % H2O2 5h 21,55±5,250 % vs Cont 6,80±0,200 %).

Le cellule incubate con H2O2 0.3 mM alle diverse tempistiche (2h, 5h, 18h) e staccate dopo 24 dall’aggiunta dello stimolo ossidante, mostrano invece già nel gruppo incubato per sole 2h un aumento significativo della mortalità rispetto alle cellule non stimolate “Cont” (H2O2 2h 87,95±0,450 vs Cont 6,80±0,200 p<0,01); tale aumento si osserva anche in cellule incubate per 5h e 18h con H2O2, con una mortalità media intorno al 97%, significativa verso il gruppo (H2O2 5h 96,5±0,400 % vs Cont 6,80±0,200 %; p<0.01 H2O2 18h 96,8±2,400 vs Cont 6,800±0,200 % p<0,05).

Infine, le cellule dei 3 gruppi sperimentali (2 h, 5h e 18 h) incubate con H2O2 alla concentrazione di 0.5 mM hanno valori di mortalità compresa tra il 90% ed il 100%; tali valori sono significativi rispetto a quelli del gruppo “Cont” (H2O2 2h 89,4±1,700 %, H2O2 5h 96,05±2,450 % vs Cont 6,80±0,200 %; p<0,05 H2O2 18h 99,05±0,150 vs Cont 6,80±0,200 p<0,01).

(30)

93 9.5 PROTEZIONE DAL DANNO OSSIDATIVO

9.5.1 TEST DI VITALITÀ TRIPAM BLU

Cont RSV H2O2 RSV + H2O2

Media % 7,95 8,10 68,95 40,25

Dv.st 0,919 0,879 9,405 5,162

Err.st 0,531 0,507 6,650 2,980

Test T vs H2O2 p<0,01 p<0,01 p<0,05

Nel grafico in Fig. 43 e Tab.16 è riportata la valutazione della protezione dal danno ossidativo dopo 24h dalla fine dello stimolo ottenuta tramite il test di citotossicità col trypan blue, espressa come % di cellule morte.

Dal grafico 43 si può osservare come l’incubazione di H2O2 0.3 mM per 2h determini un aumento della percentuale di cellule morte (68,95±6,650%), mentre le cellule incubate con RSV 0,2µM per

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Cont RSV H2O2 RSV + H2O2

*

# # Fig.43 Tab. 16 * p<0,05 vs H2O2 # p<0,01 vs H2O2 % c ell u le m or te

(31)

94

24h prima dell’aggiunta dello stimolo ossidante abbiano una mortalità significativamente inferiore rispetto a quella del gruppo H2O2 (RSV+H2O2 40,25±2,980 % vs H2O2 68,95±6,650 %; p<0,05). Inoltre, i gruppi “Cont” e “RSV” (incubato con solo RSV 0,2µM) presentano una % di morte cellulare significativamente ridotto rispetto al gruppo H2O2 (Cont 7,95±0,531% RSV 8,10±0,507 % vs H2O2 68,95±6,650 %; p<0,01).

(32)

95

9.5.2 TEST DI CITOTOSSICITÀ CITOTOX FLUOR

* p<0,05 vs H2O2

# p<0,01 vs H2O2

Cont

RSV

H2O2

RSV + H2O2

Media 0,60 0,75 94,93 68,80

Dv.st 0,010 0,030 8,123 17,545

Err.st 0,007 0,021 5,744 12,406

Test T vs H2O2 p<0,01 p<0,01 p<0,05

Nel grafico in Fig. 44 e Tab. 17 è riportata la valutazione della protezione dal danno ossidativo dopo 22h dalla fine dello stimolo ottenuta col test di citotossicità CitoTox Fluor TM, espressa come % di cellule morte.

I dati ottenuti con il test di citotossicità CitoTox Fluor (Fig. 44), evidenziano una % di cellule morte prossima al 100 % nelle cellule incubate per 2h con H2O2 0,3mM, dopo 22h dalla fine dello stimolo ossidativo (H2O2 94,93±5,744 %).

Le cellule pretrattate con RSV 0,2µM e successivamente sottoposte allo stimolo ossidativo, mostrano riduzione significativa della mortalità rispetto al gruppo “H2O2” (RSV+H2O2 68,80±12,406 % vs H2O2 94,93±5,744 %; p<0,05); la % di mortalità resta comunque

0 20 40 60 80 100 120

Cont RSV H2O2 RSV + H2O2

*

#

Tab. 17 Fig. 44 % c ell u le m or te

(33)

96

significativamente aumentata rispetto ai gruppi Cont e RSV( trattamento con RSV senza H2O2). I gruppi “Cont” e “RSV” mostrano una % di mortalità significativamente ridotta ance rispetto al gruppo H2O2 (Cont 0,60±0,007 %, RSV 0,75±0,021 % vs H2O2 94,93±5,744 %; p<0,01); inoltre, il solo trattamento con RSV non determina variazioni della mortalità basale (RSV 0,75±0,021 vs Cont 0,60±0,007).

(34)

97 9.5.4 TEST DI VITALIVÀ DELL’XTT

* p<0,05 vs H2O2

§ p=0,05 vs H2O2

Cont H2O2 RSV + H2O2

Media 5,13 1,00 2,54

Dv.st 0,810 0,347 0,372

Err.st 0,573 0,246 0,263

Test T vs H2O2 P<0,05 P=0,05

Nel grafico in Fig. 44 è riportata la valutazione della protezione dal danno ossidativo dopo 4h dalla fine dello stimolo ottenuta col test dell’XTT.

Per valutare la protezione da parte del RSV nel danno da H2O2 è stato effettuato anche il test dell’XTT. Dalla lettura effettuata dopo 4h dalla fine dello stimolo, tempo ragionevole per il mantenimento della funzione degli enzimi mitocondriali (coinvolti nella trasformazione del substrato) in presenza dello stimolo citotossico, si può osservare (Fig.X) come nel gruppo controllo “Cont” le letture di assorbanza siano significativamente superiori ai valori osservati nel gruppo H2O2 (Cont 5,13±0,573 % vs H2O2 1,00±0,246 %; p<0,05).

0 1 2 3 4 5 6

Cont H2O2 RSV + H2O2

§ *

Fig.44

Tab.17

(35)

98

Nelle cellule preincubate con RSV 0,2 µM prima dell’aggiunta di H2O2, nonostante la riduzione rispetto al gruppo “Cont.”, si osserva un aumento dei valori delle letture rispetto a quelle del gruppo H2O2 (RSV+H2O2 2,54±0,263 % vs H2O2 1,00±0,246 %; p=0,05).

(36)

99 9.6 RISULTATI FASE III

9.6.1 VALUTAZIONE ESPRESSIONE SIRT-1

Cont RSV ERKi ERKi+RSV AMPKi AMPKi+RSV

Media 1,00 1,39 0,54 0,71 0,14 0,05

Dv.st 0,004 0,009 0,076 0,250 0,067 0,002

Err.st 0,002 0,006 0,054 0,177 0,048 0,001

Test T vs Cont 0,000 0,013 0,243 0,003 0,000

Test T vs RSV 0,004 0,062 0,001 0,000

In figura 46 e in tabella 19 sono riportati i dati relativi all’espressione di SIRT 1 espressa come rapporto di SIRT 1 e β-Actina.

0,0 0,5 1,0 1,5

#

*

§

Tab. 19 Fig. 47 Fig. 46 * p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont § p<0,01 vs RSV a.u

(37)

100

Il grafico (Fig.46) mostra, come già visto in precedenza, che l’incubazione di RSV 200nM per 24h determina un aumento significativo dell’espressione di SIRT-1 rispetto a quella osservata nel gruppo “Cont” (RSV 1,39±0,006 vs Cont 1,00±0,002 p<0,01).

Le cellule incubate con PD 98059, l’inibitore di ERK 1/2, per 24h mostrano una riduzione significativa dell’espressione di SIRT-1 sia rispetto al gruppo trattato con RSV (ERKi 0,54±0,054 vs RSV 1,39±0,006; p<0,01) sia al gruppo “Cont” (ERKi 0,54±0,054 vs Cont 1,00±0,002; p<0,05). Inoltre il grafico mostra come l’aggiunta dell’iERK 100µM 60’ prima del RSV, inibisca l’aumento dell’espressione di SIRT-1 alle 24h rispetto al gruppo “Cont” (ERKi+RSV 0,71±0,177 vs Cont 1,00±0,002) anche se con livelli di SIRT-1 maggiori, pur se non significativamente (p=0,062), rispetto al gruppo “ERKi”(ERKi+RSV 0,71±0,177 vs ERKi 0,54±0,054).

Le cellule trattate con il Coumpound C, inibitore di AMPK alla concentrazione di 10 µM dopo 24h mostrano un’evidente riduzione significativa dei livelli di espressione di SIRT-1 rispetto sia al gruppo “Cont” (AMPKi 0,14±0,048 vs Cont 1,00±0,002; p<0,01) sia al gruppo “RSV” (AMPKi 0,14±0,048 vs RSV 1,39±0,006; p<0,01). Nelle cellule incubate con RSV 200 nM per 24h, aggiunto 30’ dopo l’inibitore di iAMPK, l’espressione proteica di SIRT-1 viene inibita, risultando significativamente ridotta rispetto sia al gruppo “Cont” sia al gruppo “RSV” (AMPKi+RSV 0,05±0,001 vs RSV 1,39±0,006; p<0,01).

(38)

101 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Cont H2O2 5' H2O2 30' H202 90' H2O2 2h+2h # # # # * p<0,05 vs Cont # p<0,01 vs Cont 0 1 2 3 4 5 6

Cont H2O2 5' H2O2 30' H202 90' H2O2 2h+2h #

*

9.7 RISULTATI FASE IV

9.7.1 ANDAMENTO SEGNALI MOLECOLARI

Fig.48 e Tab. 20: dati relativi all’attivazione di ERK 1/2 espressa come rapporto P-ERK/ERK TOT.

Fig.49 e Tab.21: dati relativi all’attivazione di AMPK espressa come rapporto P-AMPK/AMPK α1.

Fig.50 e Tab 22: dati relativi all’attivazione di Akt espressa come rapporto tra P-AKT/AKT TOT.

Cont H2O2 5' H2O2 30' H202 90' H2O2 2h+2h Media 1,04 2,60 6,38 2,56 0,38 Dv.st 0,209 1,906 4,480 1,500 0,221 Err.st 0,063 0,720 1,693 0,671 0,090 Test T vs cont 0,015 0,001 0,004 0,000 Cont H2O2 5' H2O2 30' H202 90' H2O2 2h+2h Media 1,00 1,30 1,62 1,11 1,05 Dv.st 0,250 0,164 0,221 0,255 0,674 Err.st 0,125 0,094 0,128 0,147 0,302 Test T vs cont 0,137 0,019 0,593 0,068 Cont H2O2 5' H2O2 30' H202 90' H2O2 2h+2h Media 1,00 5,18 3,59 2,51 1,19 Dv.st 0,108 0,218 0,993 0,379 0,205 Err.st 0,076 0,154 0,702 0,268 0,145 Test T vs cont 0,002 0,067 0,032 0,218 0 0,5 1 1,5 2

CONT H2O2 5' H2O2 30' H2O2 90' H2O2 2h+2h

*

# p<0,01 vs Cont * p<0,05 vs Cont a .u a .u a .u

(39)

102 9.7.1.1 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE ERK 1/2.

Lo studio del segnale ERK 1/2 con il Western Blot (Fig. 48) evidenzia come già dopo 5’ di incubazione con H2O2 0.3 mM si osservi un aumento significativo dell’attivazione di ERK 1/2 rispetto al gruppo Cont (H2O2 5’ 2,60±0,72 vs Cont 1,04±0,06, p<0,05). Tale aumento risulta più marcato dopo 30’ di incubazione, tempo al quale si ha l’attivazione massima di ERK1/2 (H2O2 30’ 6,38±1,69 vs Cont 1,04±0,06, p<0,01); a 90’ restano significativamente maggiore rispetto al gruppo Cont (H2O2 90’ 2,56±0,67 vs Cont 1,04±0,06, p<0,01), anche se si osserva una riduzione rispetto al tempo 30’.

Infine nel gruppo H2O2 2h+2h, dove le cellule sono state incubate per 2h con H2O2 0,3 mM e per altre 2h con solo terreno, l’attivazione di ERK 1/2 risulta significativamente ridotta rispetto al gruppo Cont (H2O2 2h+2h 0,38±0,09 vs Cont 1,04±0,06, p<0,01).

9.7.1.2 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE AMPK

Dall’analisi delle bande ottenute attraverso il Western Blot (Fig.49) si osserva un trend positivo per l’attivazione di AMPK dopo 5’ di incubazione con H2O2 0.3 mM (H2O2 5’ 1,30±0,09 vs Cont 1,00±0,12) AMPK risulta infatti significativamente attivato dopo 30’ (H2O2 30’ 1,62±0,13 vs Cont 1,00±0,12, p<0,05), mentre dopo 90’ e nel gruppo H2O2 2h+2 il rapporto pAMPK/AMPK α1 torna ad essere sovrapponibile al gruppo Cont (H2O2 90’ 1,11±0,15 e H2O2 2h+2h 1,05±0,30 vs Cont 1,00±0,12).

9.7.1.3 ATTIVAZIONE DEL SEGNALE AKT

La valutazione dell’attivazione di AKT ottenuta tramite l’analisi delle bande (Fig.50), evidenzia una rapida attivazione di questo segnale; infatti le cellule incubate per 5’con H2O2 0.3 mM attivano

(40)

103

rapidamente e significativamente AKT (H2O2 5’ 5,18±0,15 vs Cont 1,00±0,08, p<0.01); dopo 30’di incubazione con H2O2 0.3 mM i livelli di attivazione tendono a diminuire, pur rimanendo maggiori al baseline (H2O2 30’ 3,59±0,70 vs Cont 1,00±0,08 p=0,067), l’aumento resta significativo anche nel gruppo incubato 90’ con H2O2 (H2O2 90’ 2,51±0,27 vs Cont 1,00±0,08, p<0,05).

Infine dopo 2h di incubazione con H2O2 0,3 mM e 2h di incubazione con terreno completo al 3% i livelli di attivazione tornano ad essere sovrapponibili a quelli osservati nel gruppo Cont (H2O2 2h+2h 1,19±0,14 vs Cont 1,00±0,08).

(41)

104 CAPITOLO 10

SPERIMENTAZIONE IN VIVO TRATTAMENTO SUB ACUTO

SESSIONE III.

10.1 STUDIO PILOTA: VALUTAZIONE ESPRESSIONE SIRT-1

Nel grafico in Fig.51 e tabella 23 sono riportati i risultati relativi all’analisi, condotta con il Western blot, dell’espressione della SIRT-1 (espressa come rapporto di SIRT1 e β-Actina).

I dati riportati nelle Fig. 51 e Fig. 52 sono relativi alla prova pilota fatta per decidere quale via di somministrazione utilizzare per il trattamento di 15 giorni su animali.

Ogni gruppo era composto da 3 animali. La Fig. 51 permette di osservare come dopo 15 giorni di somministrazione orale di RSV 323µM ci sia un trend positivo dei livelli di espressione di SIRT-1 rispetto al gruppo “Cont” (RSV P.OS. 1,88±0,394 vs Cont 1,00±0,192).

0 1 2 3 4 5

Cont RSV P.OS. RSV I.P.

Cont RSV P.OS. RSV I.P.

Media 1,00 1,88 3,57 Dv st 0,385 0,788 2,264 Er.st 0,192 0,394 0,924 Test T 0,091 0,063 Tab. 23 Fig.51 Fig.52 a.u

(42)

105

La somministrazione intraperitoneale del RSV determina un trend più marcato (p=0,063), che comunque costituisce un elemento importante, data la numerosità del campione (RSV I.P. 3,57±0,924 vs Cont 1,00±0,192).

(43)

106

10.2 VALUTAZIONE MORFOLOGICA E FUNZIONALI

10.2.1 MICROSCOPIA OTTICA – EMATOSSILINA/EOSINA

L’analisi istologica condotta su sezioni di tessuto di animali sottoposti a trattamento con RSV via I.P. una volta al giorno per 15 giorni, evidenzia come tale somministrazione sub-acuta di questo stilbene non vada ad alterare la normale struttura morfologica del tessuto renale sia a livello cortico midollare (Fig. 52) sia a livello midollare (Fig. 53).

Fig. 52 RSV I.P. cortico-midollare. 40X Fig. 53 RSV I.P. midollare. 40X

L’analisi delle sezioni di tessuto di animali che hanno subito l’insulto ischemico della durata di 40’ e sacrificati dopo 24h di riperfusione (Fig. 55 e 56), analogamente a quanto già osservato in Fig. 12 e Fig.13 per la prima fase sperimentale, evidenzia chiare alterazioni a livello delle strutture tubulari e glomerulari; in particolare nella zona cortico-midollare (Fig. 55) si possono osservare, ipocellularità e collasso glomerulare. Inoltre è ben evidente una estesa condizione di morte ed atrofia tubulare, come rilevabile dai fenomeni di tubuloressi.

Nella zona midollare (Fig. 56) il tessuto appare ulteriormente danneggiato, testimoniato dalla presenza di atrofia tubulare e fenomeni di tubulo ressi; è inoltre possibile osservare la frequente presenza di materiale proteico nel lume tubulare.

(44)

107

Fig. 55 I/R 24h cortico-midollare. Ingr. 40X Fig. 56 I/R 24h midollare. Ingr. 40X

Negli animali a cui è stato somministrato RSV per 15 giorni, sottoposti a interruzione del flusso sanguigno per 40’ e riperfusi per 24h, si può osservare come a livello della zona cortico-midollare (Fig. 57) la struttura glomerulare sia ben preservata, se pure la struttura tubulare presenti qualche segno di sofferenza evidente da atrofia tubulare e pochi fenomeni di tubulo ressi.

L’effetto protettivo è confermato dalle sezioni midollari nelle quali i tubuli presentano un’architettura maggiormente preservata (Fig. 58) rispetto al gruppo ischemico, pur con episodi di atrofia tubulare e sporadici fenomeni di tubuloressi.

(45)

108 10.2.2 PROTEINURIA come variazione incrementale

Data la variabilità osservata nella concentrazione proteica urinaria degli animali, lo studio della proteinuria è stato fatto valutando la variazione incrementale di questo parametro in ogni animale rispetto al baseline.

Come riportato in Fig.59 e Tab. 24 negli animali trattati 15 giorni con RSV per via I.P “gruppo RSV I.P.” si osserva un leggero incremento, ma non significativo, dei valori della proteinuria rispetto al gruppo “Cont.” (Cont” 0,98±0,112 vs “RSV I.P.” 1,21±0,173); mentre nel gruppo “I/R” dove gli animali sono stati sottoposti a ischemia di 40’ e riperfusione per 24h si osserva un aumento significativo di questo parametro rispetto agli incrementi dei gruppi “Cont” e “RSV I.P” (I/R 4,09±0,830 vs “Cont” 0,98±0,112 e vs “RSV I.P.” 1,21±0,173; p<0,001). 0 1 2 3 4 5 6

Cont RSV I.P. I/R RSV I.P.+ I/R

#

§

#

*

¶

Cont RSV I.P. I/R RSV I.P.+ I/R

Media 0,98 1,21 4,09 2,27 Dv st 0,512 0,625 1,855 1,388 Er.st 0,112 0,173 0,830 0,567 Test T vs Cont p<0,001 p<0,01 Test T vs RSV I.P. p<0,001 p<0,05 p<0,05 vs I/R # p<0,01 vs Cont *p<0,05 vs RSV I.P. § p<0,01 vs RSV I.P. ¶ p<0,05 vs I/R Fig. 59 Tab. 24 Vs ba se li n e

(46)

109

Negli animali trattati con RSV 10µM I.P. per 15 giorni, sottoposti a 40’ di ischemia e 24h di riperfusione, si osserva un aumento significativo della proteinuria rispetto ai valori del gruppo “Cont” (RSV I.P.+I/R 2,27±0,567 vs Cont” 0,98±0,112; p<0,01) sia ai valori dei gruppi “RSV I.P.” (RSV I.P.+I/R 2,27±0,567 vs “RSV I.P.” 1,21±0,173; p<0,05); tuttavia la variazione di proteinuria risulta significativamente ridotta rispetto al gruppo I/R (RSV I.P.+I/R 2,27±0,567 vs I/R 4,09±0,830; p<0,05).

(47)

110 10.2.3 CREATININA PLASMATICA

Cont RSV I.P. I/R RSV I.P.+ I/R

Media mg/dl 0,75 0,70 1,23 1,00

Dv. st 0,072 0,083 0,288 0,296

Er. st 0,036 0,042 0,118 0,121

Test T vs Cont p<0,01 p=0,079

I dati ottenuti (Fig. 60 e Tab. 25) dall’analisi della creatinina plasmatica dopo 24h dall’evento ischemico mostrano come la somministrazione giornaliera di RSV 10µM per 15 giorni non determina una variazione dei livelli di creatinina rispetto a quella osservata nel gruppo “Cont” (RSV I.P. 0,70±0,042 mg/dl vs Cont 0,75±0,036 mg/dl). L’evento ischemico e la successiva riperfusione di 24h determina nel gruppo I/R un aumento significativo (p<0,01) dei valori rispetto ai gruppi “Cont” e RSV (I/R 1,23±0,118 mg/dl vs Cont 0,75±0,036 mg/dl; p<0,01). Diversamente gli animali trattati con RSV per 15 giorni prima dell’ischemia di 40’ e la riperfusione di 24h [RSV I.P.+I/R] mostrano valori di creatinina plasmatica ridotti rispetto a quelli del gruppo “I/R” e non statisticamente diversi dai gruppi “Cont” e “RSV I.P.”, anche se con un trend incrementale (p=0,079) (RSV I.P+I/R 1,00±0,121 mg/dl vs “Cont” 0,75±0,036 mg/dl e vs RSV I.P. 0,70±0,042 mg/dl).

0,0 0,5 1,0 1,5

#

§

Fig. 60 Tab. 25 # p<0,01 vs Cont § p=0,079 vs Cont m g/d l

(48)

111 10.3 VALUTAZIONE ESPRESSIONE SIRT-1.

Cont RSV I.P. I/R RSV I.P.+ I/R

Media 1,00 1,94 0,76 1,95

Dv st 0,385 0,160 0,203 0,342

Er.st 0,192 0,065 0,117 0,198

Test T 0,004 0,378 0,020

Nel grafico in Fig.61 e tabella 26 sono riportati i risultati relativi all’analisi condotta con il Western blot dell’espressione della SIRT 1 (espressa come rapporto di SIRT-1/β-Actin).

Il grafico (Fig. 61) e la tabella (Fig. 26) mostrano come il trattamento con RSV 10µM somministrato per 15 giorni una volta al giorno per via intraperitoneale prima dell’induzione dell’ischemia di 40’ incida sui valori dell’espressione proteica di SIRT-1.

Dal grafico si può osservare che i livelli di espressione di SIRT 1 negli animali trattati con RSV e non sottoposti a ischemia sono significativamente maggiori rispetto a quelli del gruppo “Cont” (RSV I.P 1,94±0,065 vs Cont 1,00±0,192; p<0,01), inoltre mostra come l’evento ischemico non determina variazioni rispetto al gruppo “Cont” (I/R 0,76±0,117 vs Cont 1,00±0,192). Negli animali trattati con RSV per 15 giorni ed in seguito sottoposti ad I/R si osserva comunque un aumento dell’espressione di questa proteina rispetto al gruppo “Cont”(RSV I.P+I/R 1,95±0,198 vs Cont 1,00±0,192; p<0,05).

0 1 2 3

*

#

a.u Fig. 61 Tab. 26 * p<0,05 vs Cont

#

p<0,01vs Cont

(49)

112

10.4 ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA: VALUTAZIONE ESPRESSIONE SIRT-1

L’analisi immunoistochimica per la SIRT-1 rileva l’espressione basale di questa proteina a livello tubulare. Infatti in Fig. 62 dove è rappresentata la zona cortico-midollare è visibile qualche tubulo marcato; fenomeno maggiormente evidente nella Fig. 63, rappresentativa della zona midollare.

Fig. 62 Cont. 24h cortico-midollare Ingr.40X Fig. 63 Cont. 24h midollare Ingr.40X

Negli animali a cui è stato somministrato per un periodo di 15 giorni RSV 10µM via I.P. analogamente a quanto riportato dall’analisi dei Western Blot (Fig. 51) si osserva, un aumento dell’espressione della SIRT-1 (Fig. 64 e Fig. 65) evidenziato, sia da un maggior numero di cellule SIRT-1 positive che dall’aumentata intensità della marcatura DAB. L’aumento è particolarmente evidente a livello dei tubuli, a livello cortico-midollare, ed in alcuni glomeruli, oltre che nelle cellule tubulari midollari (Fig. 64).

(50)

113

Come mostrano le Fig.66 e Fig. 67 l’insulto in animali sottoposti a ischemia di 40’ e 24h di riperfusione non determina sostanziali variazioni nel numero di cellule SIRT-1 positive né nell’intensità della marcatura.

Tale risultato è in accordo con l’analisi del Western Blot ed osservabile sia a livello cortico-midollare che cortico-midollare.

Fig. 66 I/R cortico-midollare. 40X Fig. 67 I/R midollare. 40X

Gli animali sottoposti a trattamento con RSV 10µM I.P. per 15 giorni prima dell’insulto ischemico di 40’ e la successiva riperfusione di 24h, mostrano un aumento dell’espressione della SIRT-1 rispetto al gruppo ischemizzato ma non trattato e al gruppo “Cont” (Fig.68 e Fig.69). In particolare, la Fig.68 mostra come nella zona cortico midollare siano presenti estese aree marcate sia a livello dei glomeruli sia dei tubuli mentre nella zona midollare (Fig.69) si può osservare un elevato numero di cellule SIRT-1 positive.