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3. Risultati
3.1 ANALISI IN SILICO DI XPATZ1
La sequenza di patz1 di Xenopus laevis non è presente nei database sottoforma di cDNA, ma sono presenti solo EST che ricoprono parzialmente la regione codificante.
Visto il grado di omologia tra le due specie, e dato che il genoma di Xenopus tropicalis è stato completamente sequenziato (Hellsten et al., 2010), abbiamo allora cercato la sequenza relativa a patz1 in questa specie operando su http://xenbase.org/ nel database XENBASE_XT_7_1_GENE_MODEL_2. La sequenza genomica di Xenopus tropicalis (scaffold_1:55914391..55936517 (+ strand) è stata usata come query per effettuare inizialmente una ricerca di omologia con le sequenze EST di Xenopus laevis. La sovrapposizione di queste sequenze ha dato una parziale sequenza della regione codificante di patz1 in base alla quale sono stati disegnati i primer per effettuare la RT-PCR semiquantitativa e per clonare un frammento di cDNA necessario per gli esperimenti di WISH (vedi paragrafo “2.20 PRIMER UTILIZZATI”).
In seguito all'aggiornamento delle sequenze di Xenopus laevis su xenbase.org [Xenla_7_1_Scaffolds], abbiamo identificato le sequenze genomiche di Xpatz1 di laevis che corrispondono alla sequenza della putativa regione codificante identificata
per tropicalis (Ref.seq.
XM_004910596.1).
Il sofware blast utilizzato è il BLAST X. laevis presente all'indirizzo http://www.xenbase.org/genomes/blast.do e la matrice utilizzata è la BLOSUM62.
Gli allineamenti maggiormente significativi (Figura 3.1) sono stati:
Scaffold113816:80176..99919 (+ strand) Scaffold162663:1423366..1451609 (+strand)
Figura 3.1 Risultati dellìallineamento BLAST tra patz1 di X.tropicalis e il genoma di X.laevis, come ottenuti da http://www.xenbase.org/genomes/blast.do
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Gli stessi scaffold vengono dati come output dell'allineamento con la sequenza parziale di Xpatz1 da noi clonata in p-GEM-T.
I dettagli del confronto tra le sequenze delle due specie di rane africane sono riportati nella Tabella 3.1.
Dall'analisi delle sequenze trovate il gene Xpatz1 risulta avere 6 esoni (Figura 3.2).
Dalle sequenze genomiche trovate è stata ricavata la sequenza codificante putativa (eliminando le sequenze introniche), con cui è stata effettuatata una ricerca di omologia effettuando un BLASTn rispetto alla banca dati EST: “Xlaevis ESTs”
(contenente le Expressed Sequence TAGs della rana africana) su http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/. Da tale analisi si sono ottenuti dati indicativi relativi
Figura 3.2 Rappresentazione schematica della sequenza genica di Xpatz1 appartenente a Xenopus laevis (Scaffold162663:1423366..1451609 (+strand)). Le sequenze esoniche sono rappresentate dai riquadri in giallo, le sequenze UTR dai riquadri in chiaro, le sequenze introniche sono rappresentate dalla linea nera continua (da http://gbrowse.xenbase.org)
Tabella 3.1 Confronto dell'allineamento tra la regione codificante dell'mRNA predetto (variante 3) di Xpatz1 in X.tropicalis e le sequenze genomiche di Xpatz2 in X.laevis
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alla espressione della proteina: dove viene espressa, a livello di quale tessuto o organo (Figura 3.3).
Infine la sequenza è stata sottoposta a traduzione in proteina ipotetica tramite l'applicazione ExPASy (http://web.expasy.org/translate/) per verificare che possa rappresentare una possibile sequenza proteica. La sequenza proteica ottenuta è stata allineata con le sequenze proteiche della specie affine X.tropicalis, e con le sequenze di due mammiferi, Mus musculus e Homo sapiens (Figura 1.1) utilizzando lo strumento “Clustal Omega” (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
A livello proteico si denota una alto livello di somiglianza (65%) e buona parte delle differenze consistono in sequenze specifiche degli anfibi, assenti nei mammiferi e viceversa, le restanti differenze sono per lo più delle sostituzioni aminoacidiche conservative o semiconservative (10% della sequenza).
Particolarmente conservati sono i domini funzionali della proteina: il dominio POZ, un dominio AT-hook e quattro dei sei domini Zinc fingers del tipo C2H2 predetti in Xenopus laevis. I domini relativi alla isoforma 4 della proteina di Homo sapiens sono stati individuati facendo riferimento al lavoro di Fedele et al. (2000); quelli di Xenopus laevis sono stati confermati tramite il software di predizione proteica InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro), grazie al quale sono stati individuati due
Figura 3.3 Espressione di patz1 in X.laevis ottenuta tramite esperimenti di conta delle ESTs nelle diversi organi (a sinistra) e nei diversi stadi (a destra). Da
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene
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ulteriori domini Zinc fingers, presenti sulla isoforma lunga di PATZ1 umana.
3.2 ANALISI DELL'ESPRESSIONE DI XPATZ1
Allo scopo di descrivere l'espressione di patz1 in Xenopus laevis, finora mai stata studiata,
sono stati effettuati esperimenti di RT-PCR semiquantitativa e di ibridazione in situ whole mount (whole mount in situ hybridisation, WISH).
L'analisi dei livelli di espressione tramite RT-PCR semiquantitativa è stata effettuata utilizzando gli stessi primers impiegati per amplificare il frammento di cDNA da cui ricavare il probe per la WISH (vedi paragrafo “2.20 PRIMERS UTILIZZATI”). Il gene costitutivo utilizzato come riferimento è il gene odc (ornithine decarboxylase).
Dall'analisi (Figura 3.4) si evince che il trascritto è presente a bassi livelli fin dai primi stadi, indicando la sua presenza tra i trascritti di derivazione materna. Si osserva un interessante incremento a stadio 18 (Nieuwkoop e Faber) seguito da una decrescita della trascrizione del gene. I livelli di espressione aumentano nuovamente intorno a stadio 37 (Nieuwkoop e Faber).
Figura 3.4 Espressione di Xpatz1. RT-PCR su embrioni interi wild-type a diversi stadi. ODC è usato per la normalizzazione.
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L'esperimento di WISH è stato effettuato su embrioni a stadi differenti per verificare il pattern di espressione sia a livello spaziale che nel tempo dello sviluppo (Figura 3.5).
L'espressione di patz1 mRNA inizia a essere chiara e ben localizzata allo stadio di neurula (stadio 15). A questo stadio l’mRNA è localizzato ai bordi laterali della placca neurale, ed appare più intenso nella parte anteriore dell’embrione dove raggiunge la regione presuntiva delle vescicole ottiche. In accordo con il risultato degli esperimenti di RT-PCR, allo stadio di neurula avanzata (stadio 17), l’espressione di patz1 si estende ed intensifica anteriormente; a questo stadio inizia ad essere visibile negli streams delle NCCs craniche, visibili lateralmente sui lati del tubo neurale in sviluppo. Allo stadio di bottone caudale (st. 22 e st. 28) l’espressione si continua a osservare nelle vescicole ottiche, e nel sistema nervoso centrale, intensificandosi nelle regioni cerebrali anteriori. L’mRNA di Patz1 si riscontra anche a livelli della vescicola otica; a stadio 28 e sucessivi si estende anche lateralmente colonizzando la regione degli archi branchiali in cui il segnale è chiaramente visibile nei flussi migratori mandibolare, ioideo e branchiale.
In conclusione, il trascritto di patz1 è presente nei primi stadi come mRNA di origine
materna, la sua espressione si conserva dopo l'attivazione della trascrizione genica
durante la transizione della blastula intermedia (stadio 9) e in particolare il suo livello
si innalza nella neurula tardiva, stadio in cui ha inizio il movimento migratorio delle
NCCs. L'espressione di patz1 appare soprattutto nelle strutture anatomiche della testa
che vengono colonizzate dalle NCCs, ma si mantiene fortemente espresso anche nelle
regioni anteriori del SNC, mentre nella parte posteriore esso è solo debolmente
espresso.
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Figura 3.5 Pattern di espressione di Xpatz1 durante diversi stadi di sviluppo embrionale di Xenopus laevis, da neurula a stadio tailbud.
L'espressione di Xpatz1 è stato rivelato in piastra neurale (np, neural plate); pliche neurali (nf, neural fold); tubo neurale (nt,neural tube); creste neurali (nc, neural crest); vescicola ottica (ea, eye enlagen);
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3.3 ANALISI FUNZIONALE PRELIMINARE DI PATZ1
Per chiarire la posizione di Patz1 nella gerarchia dei geni del network delle NCCs una analisi funzionale preliminare è stata effettuata mediante esperimenti di micro- iniezione di trascritti cappati e di molecole morpholino antisenso in modo da produrre sovraespressione o down-regolazione di Patz1. In particolare, mi sono interessata a valutare le conseguenze della sovraespressione di Patz1 sull’altro gene di nostro interesse (hmga2); e le conseguenze della downregolazione di Msx1 e Slug (geni chiave per le NCCs) su Patz1.
Tutte le microiniezioni sono state effettuate in embrioni a stadio di 4 cellule nella regione animale di uno dei blastomeri dorsali (generalmente più piccoli e più chiari) in modo da dirigere il reagente iniettato nella zona presuntiva delle creste neurali (Figura 3.6). Assieme al mRNA o morpholino iniettato è stata iniettato, come tracciante, l’mRNA per una forma di β-galattosidasi a localizzazione nucleare.
Gli embrioni sono stati quindi fissati allo stadio di tailbud (stadio 28) e sono stati sottoposti a WISH per lo studio molecolare del fenotipo. Il gene Xtwist è stato usato come controllo nei diversi esperimenti di ibridazione in situ. Xtwist è noto come marcatore delle creste neurali, particolarmente apprezzabile negli stadi di neurula tardiva e tailbud.
In questo lavoro, per gli esperimenti di sovraspressione, è stata usata la variante 4 di Homo sapiens, visto che non avevamo disponibile la sequenza intera del gene di Xenopus laevis. La conservazione della proteina nei vertebrati (Figura 1.1) ci ha fatto
Figura 3.6 A) Mappa presuntiva di X.laevis, http://www.xenbase.org/anatomy/static/xenbasefate.jsp#;
B) Embrione di X.laevis a stadio di 4 cellule, la freccia nera indica il punto di iniezione.
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assumere che il trascritto umano potesse risultare funzionale una volta iniettato nell'anfibio. Inizialmente le dosi iniettate di hpatz1, pari a 10 pg e 50 pg per embrione, non hanno portato ad alcun fenotipo visibile: la espressione di Xtwist e Xslug risulta sostanzialmente inalterata (dati non mostrati e vedi Fig. 3.11 E, F). Per questo, le dosi iniettate sono state aumentate a 100 pg. In questo caso si è riscontrata una lieve riduzione di intensità nel dominio di espressione di Xhmga2 (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 48% degli embrioni, n=48); è stata anche riscontrata una riduzione di Xtwist (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 45% degli embrioni, n=48), usato come controllo (Figura 3.7).
Sono stati fatti inoltre esperimenti di down-regolazione con oligo morpholino antisenso contro Xms1 (MO-msx1) (Figura 3.8), implicato nella regolazione dei bordi della piastra neurale (Sato et al., 2006; Monsoro-Burq et al., 2005), e contro Xslug (MO-slug) (Figura 3.9), implicato nella specificazione delle creste neurale (Patthey et
Figura 3.7 Risultati della iniezione di hpatz1 in embrioni di Xenopus. Gli embrioni sono stati iniettati in uno dei blastomeri dorsali a stadio di 4 cellule con hpatz1 mRNA
(100 pg) e quindi processati per la rivelazione di Xhmga2 (a,b) e Xtwist (c,d).
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al., 2009; Steventon et al., 2009). Come ricordato nell’Introduzione, questi geni sono piuttosto a monte nel network regolatorio delle NCCs. Anche in questo caso, la sonda utilizzata come controllo negli esperimenti di guadagno e perdita di funzione è stata quella per Xtwist.
L'iniezione di MO-msx1 (dose di 20 ng) provoca una riduzione nell'espressione di Xpatz1 (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 66% degli embrioni, n=70, 3 exp.); come descritto in letteratura (Monsoro-Burq et al., 2005), anche per l'espressione di Xtwist, usato come marcatore di controllo viene fortemente ridotta nel lato iniettato rispetto a quello di controllo (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 81% degli embrioni, n=75, 3 exp.). L'esperimento è stato ripetuto con una dose minore di MO-msx1 (15 ng) confermando il dato di riduzione dell'espressione di Xpatz1 in una percentuale maggiore di embrioni (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 82% degli embrioni, n=46, 1 exp.) e di Xtwist (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 80% degli embrioni, n=49, 1 exp.).
Negli embrioni trattati con MO-msx1 si nota, allo stadio di bottone caudale, anche il mancato rigonfiamento a livello degli archi branchiali, fenotipo che prelude ad una forte riduzione delle strutture scheletriche della regione faringea e che viene
Figura 3.8 Risultati della iniezione di MOmsx1 in embrioni di Xenopus. Gli embrioni sono stati iniettati in uno dei blastomeri dorsali a stadio di 4 cellule con MOmsx1 (15 ng). Sono stati quindi processati per la rivelazione della
espressione di Xpatz1 (A,B) e Xtwist (C,D).
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osservato anche negli embrioni in cui viene provocata la down-regolazione di Xhmga2 (Macrì et al., in preparazione). Questo fenotipo si riscontra, seppur in maniera più lieve, negli embrioni iniettati con hpatz1 (100 pg) (Figura 3.9).
Ho quindi iniettato un oligo morfolino diretto contro Slug, che, nella gerarchia agisce a valle di Msx1. La down-regolazione di Xslug (Moslug 10 ng) ha visto anch'essa una diminuzione di Xpatz1 (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 76% degli embrioni, n=142) e del controllo Xtwist (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 84% degli embrioni, n=139).
E
Figura 3.9 Embrioni iniettati con Momsx1 (A, visione ventrale; B visione dorsale), e con hpatz1 (C, visione ventrale; D, visione dorsale) mostrano un simile fenotipo nella regione faringea: il lato iniettato presenta scarso rigonfiamento a livello degli archi branchiali . Nel riquadro a destra (E, visione ventrale) è mostrato lo stesso fenotipo ottenuto con iniezione di morpholino contro hmga2 (Macrì et al., in preparazione).
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La co-iniezione di hpatz1 (10 pg) e Xhmga2 (6,25 pg) ha mostrato come effetto una lieve riduzione dell'espressione di Xtwist (a stadio 28 la riduzione è stata osservata sul 47% degli embrioni, n=43). La sola iniezione di Xhmga2 (6,25 pg) non mostra avere effetti significativi su Xtwist (a stadio 28 il 50% degli embrioni non mostra variazioni
Figura 3.10 Risultati della iniezione di MOslug in embrioni di Xenopus. Gli embrioni sono stati iniettati in uno dei blastomeri dorsali a stadio di 4 cellule con MOslug (10 ng) e quindi processati per la rivelazione
di Xpatz1 (A,B) e Xtwist (C,D).
Tabella 3.2 Tabella riepilogativa dei risultati degli esperimenti di microiniezione.
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dell'espressione di Xtwist, n=12), confermando i dati (non pubblicati) di esperimenti precedenti condotti a stadio più precoce (Figura 3.11). Come già riportato, nemmeno l'iniezione singola di hpatz1 a basse dosi (10 pg) mostra effetti su Xtwist.
I dettagli dei singoli esperimenti di microiniezione sono riassunti nella Tabella 3.2.
Figura 3.11 Risultati della co-iniezione di hpatz1 e Xhmga2 in embrioni di Xenopus. Gli embrioni sono stati iniettati in uno dei blastomeri dorsali a stadio di 4 cellule con
hpatz1 mRNA (10 pg)+Xhmga2 (6,25pg) (A,B); con Xhmga2 (6,25pg) (C,D) e con hpatz1 (10 pg) (E,F) e quindi processati per la rivelazione della espressione di Xtwist.
