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INDICE
INTRODUZIONE... 3
1. L’aldoso reduttasi ... 4
1.2. Generalità ... 4
1.3 Struttura enzimatica e meccanismo d’azione ... 5
1.4 La via dei polioli e le complicanze secondarie del diabete ... 8
1.5 L’inibizione dell’Aldoso Reduttasi ... 11
1.6 Comportamento non-Michaeliano dell’aldoso reduttasi ... 14
MATERIALI E METODI ... 15
2.1 Reagenti ... 16
2.2 Strumentazione ... 17
2.3 Determinazione dell’attività aldoso reduttasica ... 18
2.4 Determinazione della concentrazione delle proteine ... 19
2.5 Elettroforesi ... 20
2.6. Purificazione dell'ALR2 ricombinante umana ... 22
2.6.1. Preparazione dell’estratto grezzo ... 23
2.6.2. Cromatografia a scambio ionico ... 24
2.6.3. Cromatografia per affinità ... 26
2.6.4. Cromatografia ad esclusione molecolare ... 28
2.7. Preparazione e determinazione della concentrazione di HNE ... 30
RISULTATI ... 31
3.1. Apparente cooperatività negativa dell’aldoso reduttasi utilizzando D-glucosio come substrato. ... 32
3.2. Comportamento cinetico dell’aldoso reduttasi con altri substrati aldeidici ... 34
3.3. Apparente cooperatività negativa dell’aldoso reduttasi utilizzando come substrati aldosi a 5 e 6 atomi di carbonio... 40
3.4. Effetto di emiacetali di aldosi sull’attività aldoso reduttasica. ... 45
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