4. NEXT-GENERATION SEQUENCING
Negli ultimi anni, la tecnica dei microarrays ha portato alla ribalta il concetto dell’eterogeneità del carcinoma alla mammella, cioè il fatto che i distinti sottotipi molecolari siano sostenuti da diverse alterazioni genetiche ed epigenetiche. I profili di espressione basati sui microarrays e le tecniche di ibridazione però forniscono dati con importanti limitazioni; ad esempio, questi possono garantire solo una valutazione semiquantitativa dell’espressione genica e presentano qualche difetto in termini di specificità e sensibilità. Sebbene inoltre abbiano fornito abbondanti dati relativi alle anomalie del numero di copie geniche, non sono stati in grado di studiare le alterazioni genomiche strutturali e le mutazioni puntiformi. Uno strumento ideale per la caratterizzazione genetica dei carcinomi dovrebbe fornire informazioni riguardo alle anomalie del numero di copie, agli alleli, ai riarrangiamenti somatici, alle mutazioni delle coppie di basi, all’interno dello stesso esperimento. I progressi della tecnologia hanno portato così all’avvento del sequenziamento massivo in parallelo (anche conosciuto come sequenziamento di nuova generazione, NGS) che ha permesso di maturare informazioni qualitative e quantitative riguardo ogni tipo di acido nucleico in un dato campione con un incredibile produttività e costi relativamente limitati. Con un diverso approccio, questi metodi di sequenziamento hanno superato la limitata produttività del tradizionale sequenziamento di Sanger creando dei micro reattori e/o attaccando le molecole di DNA che devono essere sequenziate a superfici solide o biglie, permettendo il realizzarsi di milioni di reazioni di sequenziamento in parallelo. Ancora più importante della produttività del sequenziamento garantita da questa tecnologia e del suo costo relativamente basso, è il tipo di dati che essa genera. Il sequenziamento di nuova generazione fornisce infatti, rispetto a quello classico, letture molto più corte (da 21 a 400 paia di basi) ma milioni di esse; è possibile in questo modo ottenere il sequenziamento di una singola molecola di DNA, cioè si è in grado di identificare una mutazione somatica all’interno di una piccola sotto-popolazione di cellule immerse in una popolazione più grande con sequenze wild-type. Tuttavia, l’accuratezza di ogni lettura (reads) può risultare significativamente più bassa rispetto ai risultati generati dal sequenziamento di Sanger e per questo motivo viene generalmente richiesta una validazione fisica utilizzando i tradizionali metodi di sequenziamento. Ad ogni modo, i sequenziamenti di nuova generazione hanno trovato oggi molte applicazioni a partire dall’analisi di specifiche regioni del genoma, per arrivare a sequenziamenti dell’intero esoma passando dallo studio del DNA germinale, dal catalogo dei polimorfismi presenti nella popolazione, dal sequenziamento dell’RNA e dall’analisi dell’espressione genica.
Nell’ambito del carcinoma della mammella, questa tecnologia offre l’opportunità di passare dall’attuale sistema di classificazione descrittivo e prognostico a una tassonomia funzionale genomica basata sulle alterazioni molecolari che guidano i diversi sottogruppi di cancro. Già molto gruppi di ricerca si sono orientati in tal senso (3). L’NGS si è dimostrato in grado di identificare nuove potenziali mutazioni alla base di specifici sottotipi di malattia e di mostrare come lo spettro mutazionale del tumore evolve nel tempo.
Sebbene la presenza di tessuti non-neoplastici (stroma, infiltrato infiammatorio e tessuto normale) rappresenti un problema per l’analisi dei genomi delle lesioni pre-invasive, dei tumori primitivi e dei depositi metastatici, le evidenze suggeriscono che se il tumore è sequenziato con più letture, le mutazioni somatiche possono essere comunque individuate. Un’altra importante applicazione di questa piattaforma è l’identificazione di mutazioni secondarie come meccanismi di resistenza a specifici agenti terapeutici. Allo stesso tempo, il dilagare degli studi effettuati con l’NGS richiederà un po’ di tempo per portare alla luce informazioni clinicamente rilevanti. Dal momento che ogni genoma tumorale presenta più di 10000 mutazioni somatiche, si è resa necessaria una validazione attraverso l’identificazione di mutazioni ricorrenti o attraverso laboriosi studi funzionali per separare le mutazioni driver da quelle passenger. Oltre che un supporto bioinformatico all’avanguardia, questo tipo di sequenziamento necessita quindi un controllo di qualità e una standardizzazione.
In conclusione, evitando un eccessivo ottimismo non giustificato, questa tecnologia potrà molto probabilmente rappresentare un valido supporto nella ricerca di base e traslazionale relativa al carcinoma della mammella (133).
