5.1 Metodi cromatografici
5.1.1 Cromatografia su strato sottile
Le cromatografie su strato sottile sono state eseguite su lastre di gel di silice Kieselgel 60 F254 (Merck) di 0.25 mm di spessore su un supporto di vetro o di alluminio. Come fasi
mobili (eluenti) sono state scelte diverse miscele di solventi a seconda del campione in esame:
CHCl3-MeOH-H2O, in miscela 70:30:3 e 80:18:2
n-BuOH-CH3COOH-H2O, 60:15:25
La rivelazione delle macchie è stata effettuata sia con luce UV a 254 e 366 nm, sia con il seguente reattivo spray:
soluzione satura di solfato di cerio in acido solforico al 65%, seguita da riscaldamento a 120° C per 15 minuti, per consentire lo sviluppo della colorazione tipica delle macchie, indice della natura dei composti analizzati (Figura 5.1). Il solfato di cerio è stato impiegato come rivelatore universale.
5.1.2 Cromatografia su colonna
5.1.2.1 Cromatografia ad esclusione molecolare
La cromatografia ad esclusione molecolare è stata impiegata per cromatografare l’estratto cloroformio-metanolico (RCM) (11.5 g) e l’estratto
n-butanolico (6.8 g) delle foglie di Joannesia princeps Vell., ottenuto dalla ripartizione
n-BuOH/H2O dell’estratto metanolico (RM).
Come fase stazionaria è stato utilizzato gel di Sephadex LH-20 (25-100 µm, Pharmacia Fine Chemicals), impaccato in una colonna di 100 x 5 cm (id = 5 cm, V = 19.6 ml/cm) (Figura 5.2). Come fase mobile è stato utilizzato MeOH ed è stata utilizzata una pompa peristaltica Pharmacia Fine Chemicals P1 con un flusso costante di 1 ml/min.
5.1.3 HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Le separazioni in fase inversa con HPLC (20-100 bar) sono state effettuate con un apparecchio Shimadzu (Figura 5.3),
costituito da:
Pompa Shimadzu LC-8A
Rivelatore Shimadzu RID-10A Colonna Waters C-18 µ-Bondapak (30 cm x 7.8 mm) Integratore Shimadzu C- R3A
Figura 5.2 Colonna Sephadex LH-20 ad esclusione molecolare
Le separazioni sono state condotte utilizzando come fase mobile miscele eluenti di MeOH-H2O, ad una velocità di flusso di 2 ml/min, attenuazione 7x, con un numero
variabile di iniettate di 100 µl di campione (diluizione 10 mg/100 µl) ciascuna.
5.2 Metodi chimico-fisici
5.2.1 Spettri di massa
Spettri ESI-MS
Gli spettri di massa ESI-MS (modalità positiva e negativa) sono stati registrati con uno spettrometro Thermo Finningan LC-Q Advantage a trappola ionica, equipaggiato con un software Xcalibur. I campioni sono stati sciolti in MeOH alla concentrazione di 10-20 µg/ml ed iniettati nella fonte ESI utilizzando una pompa a siringa. La velocità del flusso è stata di 5 µl/min (Figura 5.4).
5.2.2 Spettri di risonanza magnetica nucleare
Per gli spettri NMR è stato utilizzato uno spettrometro Bruker DRX-600 (software UXNMR) operante a 599.19 MHz per 1H e 150.86 MHz per 13C e uno strumento Bruker AC-250 (software Topspin) operante a 250 MHz per 1H e 62.5 MHz per 13C (Figura 5.5).
Figura 5.4 Spettrometro di massa
Gli spettri mono e bidimensionali sono stati misurati in CD3OD usando come standard il
segnale relativo del solvente a 3.31 ppm. Negli spettri 13C-NMR è stato usato come riferimento il segnale a δ 49.0. L’esperimento di correlazione diretta omonucleare (DQF-COSY, Double Quantum Filtered COSY) è stato eseguito usando la convenzionale sequenza di impulsi. L’esperimento di correlazione diretta eteronucleare 1H-13C (HSQC) è stato realizzato su una matrice 512 × 1024, usando una costante di accoppiamento C-H di 135 Hz ed un relaxation delay di 1.5 sec (Kay et al., 1992; Palmer et al., 1991). L’esperimento di correlazione eteronucleare long range (HMBC) è stato ottenuto utilizzando la sequenza di Bax (Bax e Subramanian, 1986; Lerner e Bax, 1986) ad una costante long range media di 6-8 Hz e una matrice 512 × 1024. Gli esperimenti 1D-TOCSY sono stati ottenuti usando un software UX-NMR e sono stati eseguiti utilizzando un generatore di impulsi gaussiani usando, durante il mixing time, la sequenza di impulsi di tipo MLEV-17 (mixing time 80-100 ms), secondo quanto riportato in letteratura (Davis e Bax, 1985).
