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Riassunto
Durante lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati sono necessari una serie di eventi altamente coordinati, tra cui la specificazione della piastra neurale anteriore, l’evaginazione laterale delle vescicole ottiche dal prosencefalo e infine il differenziamento del cristallino e dei vari strati della retina. Tra i geni essenziali per il corretto sviluppo di questo organo un ruolo critico e’ svolto dal fattore di trascrizione di tipo paired-like Rx1.
In Xenopus laevis, Xrx1 è espresso a partire dallo stadio di neurula nella piastra neurale anteriore. Successivamente, la sua espressione si localizza nelle vescicole e nelle coppe ottiche, nel diencefalo ventrale e nella ghiandola pineale. Una volta terminato il differenziamento della retina, la sua espressione nell’occhio si restringe alla zona marginale ciliare, dove è implicato nel mantenimento della staminalità dei progenitori che permettono la rigenerazione dei neuroni retinici.
Nell’ambito di un progetto volto a identificare i geni regolati da questo fattore di trascrizione, sono stati effettuati esperimenti utilizzando i
“microarray” commerciali “GeneChip Xenopus laevis genome array”. Grazie a queste tecniche è stato possibile evidenziare i trascritti che cambiano livello di espressione in seguito alla sovraespressione o all’inattivazione funzionale di Xrx1 allo stadio di neurula precoce, e che quindi hanno maggiore probabilità di essere effettivamente controllati da Xrx1 durante lo sviluppo. Tra questi sono stati selezionati trascritti dotati di un comportamento coerente con il piu’
semplice modello ipotizzabile, quindi quelli che rispettivamente aumentano
nella sovraespressione e diminuiscono nella inattivazione funzionale, o
viceversa.
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Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il profilo di espressione dei trascritti selezionati, fornendo così anche una prima conferma dei dati provenienti dagli esperimenti di microarray e, inoltre, di identificare i trascritti analizzati per evidenziare eventuali relazioni funzionali con Xrx1.
Sono stati analizzati undici dei trascritti selezionati. Il profilo di espressione di questi geni è stato studiato mediante ibridazione in situ su embrioni interi a diversi stadi di sviluppo, da nerula precoce a larva natante.
Inoltre sono state effettuate ibridazioni in situ su sezioni di retina differenziata a stadio di girino per verificarne la localizzazione, in particolare a livello della CMZ. Dalle analisi su embrioni interi e sezioni di retine è risultato che sette trascritti sono espressi ad alti livelli nell’occhio e nel sistema nervoso centrale anteriore: di questi, quattro sono specificamente localizzati o arricchiti nella zona marginale ciliare. Infine uno dei trascritti selezionati, L11, è localizzato nell’endoderma a stadio di neurula, mentre non risulta trascritto a stadi successivi. Per indagare più approfonditamente sulla sua eventuale interazione con Xrx1 sono stati effettuati esperimenti di guadagno di funzione sovraesprimendo Xrx1 e analizzando l’espressione di L11 a stadio di neurula.
Inoltre sono state effettuate analisi bioinformatiche di omologia di sequenza e successivamente ricerche in letteratura per tentare di identificare, anche solo parzialmente, i trascritti sconosciuti o inferirne una funzione.
I risultati confermano che, ad eccezione di due trascritti, tutti gli altri
hanno domini di espressione parzialmente sovrapposti o riconducibili a quello
di Xrx1, e sono quindi dotati della giusta localizzazione per essere
effettivamente regolati da Xrx1 durante lo sviluppo. Per mezzo delle indagini
bioinformatiche sono stati individuati alcuni trascritti particolarmente
interessanti per la funzione svolta in relazione alle attività di Xrx1, ad esempio
nel mantenimento della staminalità.
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Abstract
Vertebrate eye development needs specific sequential steps, such as the specification of the anterior neural plate, the evagination of the optic vesicles and finally, the differentiation of the lens and the layers of retina. Among the essential genes for right development of the eye, the paired-like transcription factor Rx1 has a crucial role.
In Xenopus laevis, Xrx1 is expressed starting from neurula stage in the anterior neural plate. Later, its expression is localized in the optic vesicles and cups, in the ventral diencephalon and in the pineal gland. By the time the retina is differentiated, Xrx1 expression is restricted to the ciliary marginal zone, where it is involved in maintenance of retinal progenitor stem cells. This allows for retinal neurons regeneration over time.
Previously, in our lab,, a microarray analysis was carried out by use of GeneChip Xenopus laevis genome arrays, to identify genes regulated by Xrx1, . This technique allowed to identify transcripts that changed their expression levels after overexpression or downregulation of Xrx1 in early neurulae. These transcripts have a greater chance to be actually regulated by Xrx1 during development. Among these, transcripts were selected when displaying a coherent behaviour according to the simplest model that can be inferred for Xrx1 function: for this reason, transcripts that increase their expression level after overexpression of Xrx1 and decrease in downregulation, or viceversa.
The aim of this thesis is to characterize the expression patterns of selected
transcripts, to initially corroborate the data from microarray experiments and
analyze selected transcripts to find possibly functional connections with Xrx1.
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