6. MATERIALI E METODI
6.1. DESCRIZIONE DELLA PROVANell’ambito del progetto denominato MASCOT (Mediterranean Arable Systems Comparison Trial), il Centro Interdipartimentale di Ricerche Agro-Ambientali “Enrico Avanzi” (CIRAA) dell’ Università di Pisa conduce dal 2001 una ricerca di lungo periodo per mettere a confronto il sistema colturale biologico con quello convenzionale. Lo scopo del progetto è valutare nel lungo periodo la dinamica delle caratteristiche fisiche, chimiche e biologiche del terreno, dei macro-nutrienti, delle popolazioni di piante infestanti e fitofagi, della biodiversità, degli aspetti produttivi, economici ed energetici dell'intero processo produttivo, così come dei fattori che influiscono sulla qualità dei prodotti.
Il CIRAA si trova a 8 km a sud-ovest da Pisa e ad 1 km a est dalla costa tirrenica, all’interno dei confini del parco naturale di Migliarino-San Rossore-Massaciuccoli. La natura dei terreni è piuttosto eterogenea, variando da una consistenza sabbiosa (>82% di sabbia) ad argillosa (40-44% di argilla), con una presenza elevata di suoli limosi. In particolare, l’esperimento MASCOT è situato su terreni di natura limosa e copre una superficie di oltre 30 ettari sulla quale è stata applicata dal 2001 al 2005 una rotazione quinquennale (condotta sia nello spazio che nel tempo) di barbabietola da zucchero-frumento tenero-girasole-favino-frumento duro, mentre a partire dal 2006 la coltura della barbabietola è stata sostituita con mais. Nel sistema bio, fino al 2006 è stato effettuato un sovescio di trifoglio (traseminato a marzo nel frumento e sovesciato prima del successivo rinnovo), mentre dopo il 2006 tale sovescio è stato sostituito da una semina autunnale di veccia nei campi destinati alle colture da rinnovo e sovesciata in marzo/aprile poco prima della semina dei rinnovi (mais e girasole) .
Per quanto concerne le concimazioni del frumento, nel sistema convenzionale sono stati distribuiti 2 q/ha di 18.46 in presemina, corrispondenti a 36 unità di N e 92 di P2O5, mentre in copertura sono state eseguite due applicazioni (accestimento e levata) di 2,2 q/ha di nitrato ammonico (titolo 27), per un totale di 60 unità di N che moltiplicate per due applicazioni danno 120 unità. Dunque complessivamente nel sistema convenzionale sono state distribuite le seguenti unità: N = 156 e P = 92 (156 kg/ha di N e 92 kg/ha di P). Nel sistema biologico l’apporto azotato è consistito nella distribuzione di 10 q/ha di Nutex letame in presemina, con titolo 3,3,3 (N,P,K) (quindi sono state apportate 30 unità di N,P,K per ettaro).
Nel biologico, il controllo delle malerbe è stato reso possibile da una falsa semina, da una strigliatura durante la coltura invernale e da una sarchiatura durante la coltura primaverile. Al contrario, nel sistema convenzionale è stato eseguito un diserbo in pre-emergenza per barbabietola/mais e girasole, ed eventualmente in post-emergenza per frumento e barbabietola/mais. Infine, per quanto riguarda il controllo dei parassiti, nel sistema biologico non è stato fatto alcun controllo oppure un controllo con prodotti permessi dal Reg. UE. Lo sviluppo dei competitori naturali è stato favorito tramite l’impianto di strutture come siepi. Nel convenzionale sono stati eseguiti trattamenti anticrittogamici e insetticidi.
6.2. OPERAZIONI DI CAMPO DELL’ANNATA AGRARIA 2009/2010
Durante il mese di ottobre 2009 è stata effettuata un’aratura a 25 cm di profondità ed in seguito, verso la fine del mese, una concimazione di fondo per entrambi i sistemi con le modalità descritte in precedenza. Il 24 novembre 2009 è stato passato il frangizolle e, due giorni dopo, il passaggio dell’erpice rotante ha preceduto la semina del frumento alla dose di 200 kg /ha con seminatrice Gaspardo PI400, adoperando la varietà di frumento tenero Bologna. L’emergenza della coltura è stata osservata il 4 gennaio 2010.
Nel sistema convenzionale è stata eseguita la concimazione di copertura a marzo ed aprile, e, sempre in quest’ultimo mese, un trattamento diserbante in post-emergenza con 0.3 lt /ha di Hussar max (iodosulfuron-metile + mesosulfuron-metile).
Il 9 luglio 2010 è stata effettuata la mietitrebbiatura del frumento.
6.3. ANALISI DEI PRINCIPALI PARAMETRI QUALITATIVO-TECNOLOGICI DEL FRUMENTO TENERO Oltre alla determinazione dei fenoli totali e di alcuni acidi fenolici, sono stati determinati i seguenti parametri produttivi e reologici:
Harvest Index: è la percentuale di biomassa della pianta allocata su organi economicamente utili. In genere l'HI per il frumento è pari a 0,5-0,45.
Durezza (hardness): è la resistenza delle cariossidi alla frantumazione; ha influenza sulla macinazione e sulla lievitazione. In base a questo carattere distinguiamo grani teneri hard,
medium e soft. Questa caratteristica è molto importante per l’industria molitoria in quanto
panificatoria, inoltre, i grani hard tendono a coincidere con i grani di forza, mentre quelli
soft corrispondono a grani panificabili o da biscotti (Bonciarelli e Bonciarelli, 2001).
Volume di sedimentazione in SDS: fornisce indicazioni sulla quantità e qualità delle
proteine e in particolare sulle caratteristiche del glutine. I valori sono espressi in millilitri (ml) e aumentano con il migliorare della qualità panificatoria (valori attorno a 40 ml indicano buona qualità) (Caramanico et al., 2010).
Contenuto proteico (% s.s.): esprime indirettamente la qualità di glutine, cioè della frazione di proteine insolubili in acqua, che rappresenta circa l’80% delle proteine totali. Si ricava moltiplicando per 5,74 il contenuto in azoto determinato sulla sostanza secca mediante il metodo Kjeldhal. Nel frumento il contenuto in proteine ammonta mediamente al 12%, con valori minimi del 7% e massimi del 18%..(Cappelli et Vannucchi, 2000)
Indice di caduta di Hagberg (Falling Numbers): misura il tempo in secondi in cui l’enzima amilasi, presente nella farina, idrolizza l’amido. Valori ottimali sono 240-300 sec.; valori alti (> 350 sec.) indicano perdita dell’attività amilasica per invecchiamento; valori bassi (< 160 sec.) indicano amido già degradato, ad esempio per pregerminazione delle cariossidi (Bonciarelli e Bonciarelli, 2001).
W (indice di forza o aleografico) = indica la capacità (“forza”) della farina di formare un impasto tenace ed elastico che con la lievitazione produca l’aumento di volume desiderato (Bonciarelli e Bonciarelli, 2001). A seconda del valore assunto da W, un frumento può essere classificato a partire da “di forza” (W ≥ 300) fino a “biscottiero” (W = 115 max) (Cabras e Martelli, 2004).
P/L (indice di elasticità) = è il rapporto tra la resistenza alla deformazione (P) e la duttilità ed estensibilità (L) dell’impasto. Bassi valori di P/L indicano un impasto morbido alla lavorazione e buona porosità della mollica (Bonciarelli e Bonciarelli, 2001). Anche in questo caso potremo avere un grano di forza (P/L = 1 max), fino ad uno biscottiero (P/L = 0.5 max), passando per tutte le categorie intermedie (frumento panificabile e panificabile superiore) (Cabras e Martelli, 2004).
6.4. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER LA DETERMINAZIONE DEI COMPONENTI FENOLICI
La macinazione del grano tenero vr. Bologna è stata effettuata pressol’Istituto Sperimentale per la Cerealicoltura di S. Angelo Lodigiano, utilizzando un mulino Buhler per la separazione della farina
bianca dalla crusca. La farina integrale deriva non dalla riunione di quest’ultime due matrici, bensì dalla macinazione della granella intera.
6.5. DETERMINAZIONE DEGLI ACIDI FENOLICI E DEI FENOLI TOTALI
Per ogni frazione (farina bianca, farina integrale e crusca) sono stati miscelati in un cilindro da 10 ml, 0,1 gr di ascorbato e 0,037 gr di EDTA, portando a volume con una soluzione di soda al 16%. In una provetta, sono stati addizionati 8 ml della miscela ad ogni frazione (farina bianca, farina integrale e crusca) ed il tutto è stato posto a bagnomaria bollente per 2 ore. Dopo raffreddamento, sono stati aggiunti 4 ml di una soluzione di HCL al 50% in modo da raggiungere un pH pari a circa 2. Al campione, posto in imbuto separatore, sono stati addizionati 10 ml di etil acetato. Il tutto è stato vigorosamente agitato e lasciato smistare in 2 fasi fino al raggiungimento della limpidezza. La fase superiore è stata recuperata, mentre la restante fase inferiore è stata ulteriormente lavata per due volte aggiungendo ogni volta 10 ml di etil acetato. La fase recuperata è stata portata a secco con una pompa a vuoto. Il residuo secco è stato nuovamente sospeso in 800 μl di aceto nitrile al 50%.
Prima dell’analisi, ogni campione è stato diluito con la fase mobile B rispettando le seguenti proporzioni: 1:1 per farina bianca e integrale (volume totale= 1600 μl), 1:3 per la crusca (volume totale= 2400 μl). La miscela ottenuta è stata in seguito microfiltrata.
L’analisi quanti-qualitativa degli acidi fenolici è stata condotta utilizzando una metodologia HPLC in fase inversa (RP-HPLC). Per ogni campione, sono stati iniettati 20 μl. Il cromatografo utilizzato era una HPLC Waters 515, dotato di una colonna 3,9 x 150 mm Nova-Pack C18 (Waters, Milford, MA) e di un detector UV-visibile a doppia lunghezza d’onda (Waters 2487). La separazione è stata effettuata mediante un’analisi in gradiente, dove la fase mobile A conteneva il 98% di acqua e il 2% di acido acetico, mentre la fase mobile B era composta dal 68% d’acqua, il 30% di aceto nitrile e il 2% di acido acetico. E’ stato utilizzato un gradiente lineare 10-95% della fase mobile B ad un flusso di un 1 ml/min. Ogni corsa aveva una durata di 70 minuti. L’identificazione è stata ottenuta facendo la comparazione con un cromatogramma contenete i seguenti standard (20 ng): acido gallico, protocatecuico, p-idrossibenzoico, clorogenico, vanillico, caffeico, siringico, p-cumarico e ferulico. Le analisi cromatografiche sono state realizzate grazie al software Millenium 32 (Waters).
La determinazione dei fenoli totali è stata effettuata facendo reagire il campione con il reagente Folin Ciocaleu’s. Per la lettura è stato impiegato un spettrofotometro di assorbanza Varian (Cary 1E) a doppio raggio UV-visibile, utilizzando una lunghezza d’onda di 735 nm. La miscela del saggio conteneva i seguenti reattivi:
490 μl acqua milliQ 10 μl di estratto
250 μl di reagente Folin-Ciocalteu’s 1,25 ml di Na2CO3
La lettura è stata effettuata contro un bianco contenente le stesse soluzioni, a parte il campione sostituito con 10 μl di acqua per raggiungere lo stesso volume.
6.6. ANALISI STATISTICA
I dati relativi a tutti i parametri analizzati nell’ambito di questo lavoro sono stati preliminarmente sottoposti al test di omogeneità della varianza campionaria (Bartlett’s test). Nel caso della concentrazione relativa percentuale dei singoli acidi fenolici sul totale di quelli analizzati, il test ha riportato un risultato positivo, pertanto sono state apportate le opportune trasformazioni dei dati in (x1/2)+0,5 o in arcoseno.
I risultati produttivi della coltura di frumento tenero coltivata nel 2009/10 nei due sistemi (biologico e convenzionale) sono stati sottoposti ad analisi della varianza (ANOVA) ad 1 via utilizzando un disegno sperimentale a blocchi randomizzati con il sistema di coltivazione come unico fattore sperimentale, replicato tre volte. Il test di segregazione delle medie utilizzato è stato l’LSD (p≤0.05).
Nel caso dei parametri reologici analizzati su diverse matrici (farina integrale, farina bianca, crusca), l’ANOVA ha seguito un disegno sperimentale di tipo fattoriale (strip-plot), con la matrice analizzata come fattore principale e il sistema di coltivazione come fattore sub-plot. Tale decisione è motivata dall’intenzione di verificare l’esistenza di eventuali interazioni tra l’effetto del fattore sperimentale vero e proprio (il sistema di coltivazione) e quello determinato dalla diversa tipologia di materiale analizzato, attribuendo comunque la maggior precisione all’esame del primo. In caso di significatività dell’interazione tra i due fattori, è stato eseguito un pair comparison utilizzando il test LSD per la segregazione delle medie.
