Materiali e Metodi
2.2 Trasformazione di cellule batteriche ed
amplificazione del DNA plasmidico
(Sambrook et al., 1989).
2.2.a Trasformazione
La trasformazione è una tecnica che consente di inserire DNA esogeno all'interno di cellule batteriche. Sono state utilizzate cellule di Escherichia coli, ceppo DH5α, rese competenti alla trasformazione mediante la seguente procedura. Dopo aver ottenuto una crescita batterica sufficiente, si pone in ghiaccio per 10-15 minuti e si effettua una centrifuga a 3000 x g, per 15 minuti a 4°C. Il pellet di cellule ottenuto viene risospeso in una soluzione RF1, lasciando in ghiaccio per 15 minuti. Dopo una seconda centrifugazione, si risospende il pellet ottenuto in una soluzione RF2 e poi si conservano le cellule, ormai rese competenti, in stocks a -80°C.
Soluzioni:
RF1 x 100 ml
RbCl 1,2 g MnCl 4. H2O 0,99 g
CH3COOK 1M pH 7.5 3 ml
CaCl2 anidro 0,111 g (o 1 ml di CaCl2 1 M)
Glicerolo 12 ml
(portare a pH 5.8 con CH3COOH 0,2 M)
Materiali e Metodi RF2 x 100 ml MOPS 0,5 M pH 6.8 2 ml RbCl 0,12 g CaCl2 anidro 0,832 g Glicerolo 12 ml
(portare a pH 6.8 con NaOH 0.1 M)
Per trasformare le cellule batteriche con il DNA di interesse occorre aggiungere, ad un’aliquota di 100 µl di cellule competenti, circa 1-10 ng di plasmide superavvolto, oppure circa 50 ng di DNA totale della miscela di ligation. Successivamente, si incuba in ghiaccio per 30 minuti. Segue un heat shock a 42°C per 3 minuti ed un’altra incubazione in ghiaccio per 2 minuti. Le cellule vengono quindi piastrate su terreno solido selettivo (LB con agar e ampicillina 100 µg/ml). Dopo incubazione a 37°C in stufa per tutta la notte (o/n, over night), sulla piastra Petri compaiono le colonie batteriche: l’antibiotico presente permette la crescita alle sole cellule che hanno assunto il plasmide, dal momento che esso contiene il gene che conferisce resistenza all’ampicillina. Come controlli interni, abbiamo normalmente effettuato la trasformazione con 10 ng di plasmide pCS2+ (come controllo positivo), per valutare l'efficacia della reazione, a prescindere dalla bontà dei nostri costrutti. Per scongiurare la presenza, fra le cellule batteriche utilizzate, di ceppi inquinanti, abbiamo effettuato un controllo negativo, non somministrando alcun vettore da trasformare: ci si aspetta che le piastre ottenute non presentino alcuna colonia, dato che la crescita su terreno selettivo è permessa dal gene di resistenza amp presente nel vettore plasmidico, ma non nel genoma batterico delle cellule DH5α.
Soluzione:
Materiali e Metodi
Luria-Bertani Broth (LB)
NaCl 1% Bacto tryptone 1% Bacto yeast extract 0,5%
2.2.b Estrazione di DNA plasmidico su piccola
scala mediante lisi alcalina (mini-prep)
Tale metodo permette di ottenere circa 2-10 µg di DNA plasmidico. Da una piastra di cellule trasformate con il plasmide di interesse viene effettuato, in condizioni sterili, l’inoculo di una singola colonia in 2 ml di brodo di coltura LB con ampicillina (100 µg/ml), contenuti in un tubo da batteri da 15 ml. Il tubo è incubato per 12 ore circa a 37°C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. 0,9 ml di coltura vengono quindi centrifugati a 12000 RPM per 1-3 minuti, allo scopo di ottenere un pellet di cellule batteriche che viene risospeso in 400 µl di soluzione di sospensione, o “soluzione 1”.
Alla sospensione di cellule ottenuta si aggiungono 400 µl di soluzione di lisi alcalina o “soluzione 2”. La reazione di lisi non deve procedere per più di 5 minuti, trascorsi i quali si aggiungono 400 µl di “soluzione 3”, necessaria a tamponare il pH e far precipitare grosse molecole provenienti dalle membrane e dalle pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico e all’RNA ad alto peso molecolare ad esse associati. Dopo una centrifugazione di 15 minuti a 12000 RPM, viene recuperato il sopranatante, contenente DNA plasmidico, RNA a basso peso molecolare e proteine batteriche. Alla fase acquosa prelevata si aggiungono 0,7 volumi (V) di isopropanolo e si inverte più volte.
