Materiali e Metodi
Luria-Bertani Broth (LB)
NaCl 1% Bacto tryptone 1% Bacto yeast extract 0,5%
2.2.b Estrazione di DNA plasmidico su piccola
scala mediante lisi alcalina (mini-prep)
Tale metodo permette di ottenere circa 2-10 µg di DNA plasmidico. Da una piastra di cellule trasformate con il plasmide di interesse viene effettuato, in condizioni sterili, l’inoculo di una singola colonia in 2 ml di brodo di coltura LB con ampicillina (100 µg/ml), contenuti in un tubo da batteri da 15 ml. Il tubo è incubato per 12 ore circa a 37°C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. 0,9 ml di coltura vengono quindi centrifugati a 12000 RPM per 1-3 minuti, allo scopo di ottenere un pellet di cellule batteriche che viene risospeso in 400 µl di soluzione di sospensione, o “soluzione 1”.
Alla sospensione di cellule ottenuta si aggiungono 400 µl di soluzione di lisi alcalina o “soluzione 2”. La reazione di lisi non deve procedere per più di 5 minuti, trascorsi i quali si aggiungono 400 µl di “soluzione 3”, necessaria a tamponare il pH e far precipitare grosse molecole provenienti dalle membrane e dalle pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico e all’RNA ad alto peso molecolare ad esse associati. Dopo una centrifugazione di 15 minuti a 12000 RPM, viene recuperato il sopranatante, contenente DNA plasmidico, RNA a basso peso molecolare e proteine batteriche. Alla fase acquosa prelevata si aggiungono 0,7 volumi (V) di isopropanolo e si inverte più volte.
Materiali e Metodi
In questo modo il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare precipitano e vengono recuperati tramite centrifugazione (15 minuti a 12000 RPM). Il pellet ottenuto viene lavato in etanolo (EtOH) al 70% e risospeso in 20 µl di TER.
La concentrazione di DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con bromuro di etidio (EtBr), confrontandola con aliquote di preparazioni a concentrazione nota, utilizzate come standard.
Soluzioni: Soluzione 1 Tris-HCl 25 mM pH 8 EDTA 10 mM Glucosio 50 mM Lisozima 10 mg/ml Soluzione 2 NaOH 0,2 M SDS 1% Soluzione 3 pH 4.8 CH3COOK 5 M 60 ml CH3COOH 11,5 ml ([K + ]=3 M e [CH3COO -]=5 M) 51
Materiali e Metodi
TER
Tris 10 mM pH 8.0 EDTA 1 mM pH 8.0 RNase A 100 µg/ml
2.2.c Estrazione di DNA plasmidico su media scala
mediante colonne NUCLEOBOND (midi-prep)
Questa tecnica prevede l’utilizzo di colonnine cromatografiche “NUCLEOBOND” (Macherey-Nagel) a scambio ionico, disponibili in commercio insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego. Con questa procedura è possibile estrarre da 80 a 140 µg di DNA altamente purificato, per ogni passaggio di purificazione (abbiamo ripetuto tre passaggi di purificazione). Si procede, similmente alla “mini-prep”, con un inoculo in 100 ml di mezzo selettivo (LB con ampicillina 100 µg/ml). Dopo incubazione a 37°C in agitazione o/n, si procede alla centrifugazione della crescita batterica a 4000 RPM per 20 minuti. Il pellet così ottenuto viene risospeso in 12 ml di soluzione S1; si aggiungono quindi 12 ml di S2, si risospende delicatamente con la pipetta, lasciando a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo aver aggiunto 12 ml di S3 ed aver capovolto delicatamente, si incuba in ghiaccio per 10 minuti; segue una filtrazione su carta per ottenere un lisato limpido.
Si procede, a questo punto, con l’estrazione su colonna: si equilibra una colonna cromatografica AX-100, caricandola con 2 ml di soluzione N2, la cui eluizione avviene per gravità. Si carica poi un’aliquota di lisato filtrato. In
