La serina-treonina chinasi Akt gioca un ruolo importante nella proliferazione e nella sopravvivenza della cellula tumorale. Presenta, quindi, tutte le caratteristiche per essere un buon target per la terapia antitumorale.
Akt è una serin-treonin chinasi facente parte della famiglia ACG. Esistono tre isoforme di questo enzima: Akt1, Akt2, Akt3, ognuna delle quali possiede un dominio N-terminale PH (Pleckstrin homology), un dominio catalitico centrale ed un dominio C-terminale contenente una sequenza idrofobica denominata HM ( hydrophobic motif ). 16
Figura 33. Struttura di AKT
I principali Akt inibitori si possono classificare in: Inibitori del sito chinasico;
Inibitori del dominio PH; Inibitori allosterici.
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Figura 34. Akt inibitori
INIBITORI DEL SITO CHINASICO
La maggior parte degli inibitori del sito chinasico sono inibitori competitivi dell’ATP in quanto si legano alla tasca di legame per l’ATP.
Negli ultimi anni sono stati sintetizzati numerosi inibitori di Akt competitivi dell’ATP appartenenti a diverse classi strutturali.
I ricercatori di Abbott Labs hanno scoperto una serie di piridine-3,5- disostituite che hanno mostrato una buona attività inibitoria di Akt . Questi inibitori sono stati ottenuti per ottimizzazione del lead compound 1 (figura 35) (Akt1 IC50=5,3 µM). 120-122
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Studi di SAR su questi composti hanno dimostrato che il cloro in posizione 2 nel composto 1 non è necessario per l'attività. L’incorporazione di un gruppo arilico in posizione terminale della catena laterale (posizione 5) migliora nettamente l'attività su Akt. In particolare l’inserimento di una catena laterale contenente un gruppo indolico in posizione 3, come nel composto 2, determina un aumento dell’attività su Akt1 di circa 385 volte, rispetto al composto 1 (Figura 36) (Akt, IC50 = 14 nM).120
L’
N-
metilazione dell’indolo provoca una diminuzione dell’attività.L’ammina primaria presente nella catena laterale è essenziale per l’attività, infatti qualsiasi modifica del gruppo amminico, compresa la delezione, la sostituzione con un gruppo ossidrilico o con il gruppo metilico, ha determinato una significativa perdita di attività. Senza alcuna eccezione, tutti gli S-isomeri della serie sono da 20 a 150 volte più attivi rispetto ai corrispondente R-isomeri.
Figura 36. Struttura composto 2
Il derivato più potente di questa serie è il composto A-443654 (figura 37 A) (IC50=0.16 nM). È un potente induttore dell’apoptosi con buona attività
antiproliferativa, soprattutto quando associato ai chemioterapici classici, tuttavia non è somministrabile oralmente a causa della bassa biodisponibilità. Al fine di ottenere composti dotati di maggiore biodisponibilità, è stato sintetizzato A-674563, (figura 37 B) che presenta buona biodisponibilità ma ha un’attività 70 volte minore.
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Figura 37. Strutture di A-443654 (A) e A-674563 (B)
Davies e colleghi della Astex Therapeutics hanno ottenuto strutture cristalline di A-443654 in complesso con Akt2. Un confronto strutturale tra l’inibitore complessato con PKA e Akt2 ha rivelato che A-443654 adotta una conformazione in Akt2 che differisce da quella adottata in PKA. Il metilindazolo e la piridina formano interazioni quasi identiche sia in PKA sia in Akt, mentre la conformazione dell’indolo è molto differente quando lega Akt, infatti, in questo caso l'anello indolico è diretto verso la parte anteriore della tasca di legame per l’ATP dove si trova una regione idrofobica formata dalle catene laterali di Met282, Phe439 e Val166. In questa conformazione, l'anello indolico forma legami non-polari di Van der Waals con la catena laterale di Met282, ciò non si verifica in PKA che presenta la Leu173 al posto della Met282. È interessante inoltre notare che in Akt il gruppo fenilico di Phe54 occupa la tasca idrofobica posta sotto la zona ricca di glicine che nel caso di PKA è occupata dall'anello indolico di A-443654 (Figura 38). 123
L'azoto indolico è ad una distanza di ~3.5 Å dall'ossigeno carbossilico di Glu236, questo spiega perché l’N-metilazione del indolo è dannosa per l'attività su Akt .120
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Figura 38. Interazione tra PKA e A-443654 (A) e AKT2 e A-443654 (B)
Nei laboratori della GlaxoSmithKline è stata sintetizzata una serie di imidazo[4,5-c]piridine che sono risultati essere buoni inibitori di Akt. Il capostipite di questa classe è il composto GSK 690693 (figura 39) .124 Questo derivato causa una riduzione dei livelli di fosforilazione di numerosi substrati di Akt e inibisce la crescita delle metastasi in vari tumori. E' un potente inibitore di tutte le isoforme di Akt (Akt1, IC50 = 2nM; Akt2, IC50 =13nM;
Akt3, IC50 =9nM),125 e attualmente è in Fase I di sperimentazione clinica per
il trattamento di tumori solidi e linfomi.126
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La continua ricerca di nuovi inibitori all’Astex Therapeutics ha portato alla sintesi di altri composti a struttura generale indicata in figura 40. 127-130 Il gruppo amminico basico richiesto per l’attività può essere primario, secondario o inserito in un eterociclo (fig.40 A e B).
Figura 40. Struttura generale dei Derivati della Astex Therapeutics.
Tra i composti di questa serie, quelli che hanno mostrato un’attività migliore (IC50< 100 nM), sono i composti 4 e 5 (figura 41) in cui X=Cl, n=2 e
Ar=pirazolo e che presentano, rispettivamente, un’ammina primaria e una secondaria.129
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Gli inibitori del domino PH impediscono l’interazione di Akt con la membrana e la sua conseguente attivazione.
Mentre il dominio ATPasico è presente in tutte le chinasi, il dominio PH, N- terminale, è presente in un numero minore di chinasi, quindi l’utilizzo di tale dominio come bersaglio farmacologico potrebbe portare alla sintesi di inibitori più selettivi.
Il substrato naturale del dominio PH di Akt è PIP3. Lo sviluppo di analoghi di PIP3 che competono con esso per il legame con il dominio PH rappresenta un approccio innovativo per la sintesi di molecole dotate di attività inibitoria nei confronti di questo pathway. Questi ligandi dovrebbero ridurre la traslocazione di Akt sulla membrana e quindi la sua attivazione.
Sulla base di questa ipotesi, Kozikowski et al. hanno sintetizzato il DPI (1D3- deossifosfatidil-inositolo, figura 42, b) in cui, rispetto al fosfatidilinositolo (PtdIns, figura 42, a), manca un gruppo ossidrilico.131,132 DPI ha mostrato una modesta attività anti-proliferativa contro le cellule di carcinoma umano e nessuna attività in vitro verso PI3K a concentrazioni inferiori a 250 µM;133 in modo simile si comporta il derivato clorurato (figura 42, c). Al contrario il 3- deossi-3-fluoro-PtdIns (figura 42, d) inibisce PI3K con IC50=30 µM,
suggerendo l’importante ruolo della natura elettronica e dell’ingombro sterico del sostituente in C3. 134
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Nel tentativo di aumentare la stabilità alle fosfolipasi sono stati sintetizzati anche dei derivati con un gruppo carbonato al posto del fosfato, i quali però sono risultati scarsamente attivi.
Tra gli analoghi eterei fosfoinositolici finora sintetizzati (PIAs), il composto più attivo è il PX-316 (Prolx Pharmaceutical, figura 43) che si trova in fase preclinica e sembra essere un inibitore potente e 10 volte più selettivo verso Akt (IC50= 1.5 µM) rispetto a PI3K (IC50= 14.8 µM). 135 PX-316 ha mostrato
una buona attività antiproliferativa contro diverse linee di cellulari di cancro umano con valori di IC50 nell’ordine del micromolare.
Figura 43. Struttura di PX-316
Importante agente antitumorale appartenente a questa classe, somministrabile oralmente, è la perifosina (figura 44), un alchilfosfolipide che ricorda la struttura dei fosfolipidi. La perifosina inibisce l'attivazione di Akt senza inibire direttamente PI3K e PDK1, inoltre ha dimostrato una forte attività antitumorale in vitro contro molte linee cellulari tumorali 138-140 e la capacità di rendere sensibili varie linee cellulari tumorali agli agenti citotossici.141-144 Studi preclinici farmacocinetici hanno dimostrato un'elevata biodisponibilità orale e lunga emivita nel topo e nel ratto [165-166].145,146
La perifosina sembra essere attiva anche in alcuni tipi di metastasi, sia da sola che somministrata con altri agenti antitumorali26, ed è attualmente in
54 della mammella e melanoma.147,148
Figura 44. Struttura della perifosina.
Perifosina è in corso di valutazione in più di 10 studi clinici, fino ad oggi più di 1200 pazienti sono stati trattati con questo antitumorale in studi clinici condotti sia negli Stati Uniti che in Europa.147 Il profilo di sicurezza sembra essere nettamente diverso da quello della maggior parte degli agenti citotossici, infatti la perifosina non causa i tipici effetti collaterali che si hanno frequentemente con le chemioterapie esistenti (mielosoppressione, trombocitopenia, rash cutaneo, sintomi simil-influenzali o alopecia). I principali effetti collaterali della perifosina sono stati nausea, vomito, diarrea e affaticamento, che comunque risultano di lieve entità o inesistenti alle dosi efficaci a indurre la regressione del tumore .146,149,150
Alcuni studi di fase II per valutare l'efficacia della somministrazione orale quotidiana della perifosina in combinazione con radioterapia o con altri agenti antitumorali (come la gemcitabina, paclitaxel, docetaxel, imatinib mesilato desametasone e trastuzumab) sono attualmente in corso.26
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INIBITORI ALLOSTERICI
Recentemente, nei laboratori della Merck sono stati sintetizzati due inibitori allosterici di Akt (composti 6 e 7, figura 45). 152-156 Questi due composti presentano un’elevata selettività: il composto 6 è attivo solo verso Akt1 (Akt1 IC50 = 4,6 µM) mentre il composto chinossalinico 7 è attivo sia verso Akt1
che verso Akt2 (IC50 = 2,7 e 21 µM, rispettivamente). Nessuno dei due
composti presenta attività nei confronti di Akt3 o qualsiasi altro membro della famiglia delle AGC chinasi (come PKA, PKC o SGK) a concentrazioni fino a 250 µM.157 Questi dati indicano che questa classe d’inibitori mostra un livello
di specificità per Akt che finora non era mai stato raggiunto.
Figura 45. Struttura dei composti 6 e 7.
Studi sul meccanismo d’azione di questi composti hanno rivelato che non sono inibitori competitivi per l’ATP e agiscono con potenza simile a quella degli inibitori chinasici di Akt, bloccando la fosforilazione di Akt1 e Akt2 sulla Thr308 da parte di PDK1, senza interferire con la fosforilazione degli altri substrati peptidici.26
È stato inoltre dimostrato che questi ligandi non sono attivi su nessuna delle tre isoforme di Akt se in queste manca il dominio PH; è stato ipotizzato, quindi, che questi inibitori si leghino a tale dominio.
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seguente meccanismo d’azione: questi inibitori si legano sia al dominio PH che al dominio catalitico, (in un sito diverso da quello deputato al legame con l’ATP), formando un complesso che stabilizza la forma “chiusa” di Akt, così che l’enzima né può essere attivato da PDK1 né può esercitare la propria attività chinasica.26 Gli inibitori allosterici sembrano colpire preferenzialmente
le cellule tumorali rispetto a quelle sane, ed inoltre sono molto attivi come chemiosensibilizzanti.158
Lo studio dei rapporti struttura attività dei derivati chinossalinici ha evidenziato che tale nucleo è un gruppo farmacoforico dotato di alta potenza. Sono stati sintetizzati vari composti che presentano un gruppo parafenilalchilamminico sul C2 della chinossalina (figura 46) a cui sono state legate varie catene laterali.
Figura 46. Modifiche strutturali e struttura dei composti 8 e 9.
Il composto più interessante è quello che presenta come catena laterale quella benzimidazolon-piperidinica e che ha mostrato un aumento della potenza di circa 10 volte con valori di IC50 di 0,29 µM e 2,1 µM per Akt1 e
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Inoltre sono stati sintetizzati altri composti ottenuti da modifiche a livello della porzione chinossalinica. Il miglior derivato sintetizzato è l’eterociclo 9 (composto 9, figura 46), che presenta una buona attività, un’aumentata solubilità e permeabilità cellulare.159 Tale composto sensibilizza numerose
linee cellulari tumorali agli agenti citotossici e agli stimoli apoptotici. la sua sensibilità aumenta nella somministrazione con Rapamicina.160
Il sostituente fenilico in posizione C3 sembra essere essenziale per l’attività ed è stato mantenuto in tutti i derivati sintetizzati.
Un altro composto molto interessante è MK-2206 (figura 47), il quale possiede una buona potenza con valori di IC50 nell’ordine del nanomolare,
sulle 3 isoforme di Akt. Questo composto provoca una riduzione della fosforilazione di Akt e PRAS40 nelle cellule tumorali, in quelle ematiche e nei follicoli piliferi. MK-2206 è attualmente in fase I di studio clinico per il trattamento dei tumori solidi.160 In vivo dopo somministrazione di MK-2206 a pazienti affetti da tumori del pancreas, neuroendocrini e melanoma è stata riscontrata riduzione della massa tumorale. I principali effetti collaterali dovuti a questo composto sembrano essere rash cutaneo e iperglicemia transitoria.
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PI3K INIBITORI
PI3K è membro di una famiglia di chinasi formata da otto isoforme che sono raggruppate in tre classi I, II, III, la classe più studiata è la I. Le chinasi di classe I sono eterodimeri composti da una subunità catalitica (p110) ed una subunità regolatrice (p85).
Questa Classe è ulteriormente suddivisa in due sotto classi:
1. IA, comprende chinasi attivate dai recettori protein-tirosin-chinasi (RTK) le quali sono formate da tre tipi di subunità catalitica p110α, 110β, 110δ che formano eterodimeri con una delle tre subunità regolatrici p85α, p85β, p55γ.
2. IB, comprende chinasi la cui subunità catalitica p110γ, forma eterodimeri con la subunità regolatrice p84 o con quella p101, questa classe è attivata da recettori accoppiati a proteina G.
La subunità catalitica contiene diversi domini tra cui: un dominio per il legame della subunità regolatrice p85, un dominio RAS-binding (RBD), un dominio C2 (proteinkinase C homology-2), un dominio a elica e uno catalitico (figura 48).
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Figura 48. Subunità catalitica di PI3K.
Gli inibitori di PI3K sviluppati fino ad ora vanno ad interagire con tutte le isoforme enzimatiche appartenenti alla I classe. I due inibitori di PI3K meglio caratterizzati sono wortmannin e LY294002 (figura 49).
Figura 49. Strutture di Wortmannin e LY29002
Wortmannin è un metabolita a struttura furano-steroidea isolato dal fungo Penicillum funiculosum. È stato identificato come potente inibitore di PI3K, in
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nM; (PI3Kβ) = 0.7 nM; (PI3Kδ) = 4.1 nM; (PI3Ky) = 9.0 nM). Wortmannin è un inibitore irreversibile di PI3K e agisce legandosi covalentemente ad un residuo di lisina che è normalmente coinvolto nel legame con il fosfato.161 Ha
attività antitumorale sia in vivo che in vitro, è solubile in solventi organici, ma è molto instabile in ambienti acquosi, ciò ne limita l'uso terapeutico.
LY294002 è un derivato flavonoide e, diversamente dal wortmannin, è un inibitore competitivo reversibile dell'ATP con una IC50 di 1.4 µM. Molti studi
hanno dimostrato che possiede attività antiproliferativa e proapoptotica in vitro,162 e buona efficacia nel trattamento delle metastasi in vivo.163
Entrambi i derivati inibiscono le diverse isoforme enzimatiche di PI3K con differente affinità e sebbene abbiano già di per sé attività antiproliferativa, la combinazione con farmaci citotossici tradizionali e radioterapia ne aumenta l'efficacia .164
L’ottimizzazione del wortmannin ha portato alla scoperta di due nuovi composti PWT-458 e PX-866(figura 50).
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PWT-458 è un derivato pegilato del wortmannin che ha mostrato un indice terapeutico migliore in studi preclinici su modelli animali rispetto al wortmannin. Dopo somministrazione endovenosa, la porzione polietilene- glicolica (PEG) viene scissa e viene rilasciato il 17-idrossi-wortmannin. Attività antitumorale in vivo è stata riportata in diversi modelli di tumori umani. PX-866 è un derivato semisintetico del wortmannin che inibisce potentemente e in modo irreversibile PI3Kα, γ e δ (IC50= 5,5, 9,0 e 2,7 nM
rispettivamente). Diversamente dal wortmannin, mostra un certo livello di selettività (IC50 (PI3Kβ)> 300 nM), una maggiore stabilità e provoca una
inibizione più prolungata di PI3K. PX-866 ha dimostrato attività antitumorale contro diversi modelli di tumori solidi umani quando usato da solo (2 mg/kg, per via orale) o in combinazione con agenti chemioterapici antitumorali (per esempio, paclitaxel o gefitinib). Effetti collaterali dovuti alla somministrazione di PX-866 sono perdita di peso, leucocitosi ed iperglicemia; questi sintomi sono dose-dipendente e reversibili dopo l’interruzione del trattamento.165 Dall’ottimizzazione strutturale di LY29400 si è giunti al suo profarmaco idrosolubile SF-1126 (Figura 51). Il composto inibisce tutte le isoforme di PI3K (IC50= 0,5-5,7 µM) e altri membri della famiglia di chinasi PI3K, in
particolare DNA-PK e mTOR. SF-1126 blocca la fosforilazione e l'attivazione di AKT in vivo con valori di IC50=2,4 µM. La somministrazione del profarmaco
sembra aumentare la biodisponibilità dell’inibitore attivo nelle cellule tumorali, ciò comporta una significativa attività antitumorale in modelli di tumore umano. Oltre alla sua diretta attività sulle cellule tumorali, l’analisi della densità dei microvasi nel tessuto tumorale ha dimostrato che il composto ha significativa attività antiangiogenica in vivo. La sicurezza di SF- 1126 negli esseri umani è attualmente in fase I di sperimentazione clinica, i pazienti sono trattati due volte a settimana con infusione endovenosa, in cicli di trattamento di 4 settimane.165
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Figura 51. Struttura di SF -1126
XL147 e XL765 (strutture non divulgate) sono inibitori di PI3K in fase I di sperimentazione clinica.
XL-147 è attivo contro le PI3K di classe I (IC50=39,383,23,36 nM,
rispettivamente per α, β, γ e δ),inibisce la via di PI3K in cellule tumorali in coltura e blocca la crescita vascolare indotta dal fattore endoteliale.166,167 La
somministrazione orale di XL-147 rallenta la crescita o induce diminuzione del tumore in modelli preclinici di tumori della mammella, del polmone, dell'ovaio, della prostata e gliomi.
Una maggiore inibizione della crescita tumorale è stata ottenuta combinando questo PI3K inibitore con farmaci antitumorali noti (per esempio, carboplatino, paclitaxel o erlotinib).
XL-765 ha attività verso la classe I di PI3K (IC50 = 39, 113, 9 e 43 nM per α,
β, γ e δ, rispettivamente) inoltre inibisce anche DNA-PK (IC50 =150 nM) e
mTOR (IC50=157 nm). Come nel caso di XL-147, la crescita del tumore è
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