A Miki
A Miki
A Miki
A Miki
Al mio papà
Al mio papà
Al mio papà
Al mio papà
1
INDICE
IL GLIOBLASTOMA ... 3
IL PATHWAY PI3K-AKT-PDK1 ... 6
AKT
... 6
MECCANISMO DI ATTIVAZIONE DI AKT
... 8
PROCESSI CELLULARI REGOLATI DA AKT
... 10
AKT NEL CANCRO
... 13
COMPONENTI DEL PATHWAY PI3K-AKT-PDK1
... 14
PDK1
... 15
PDK1 NEL CANCRO
... 18
PI3K
... 19
PI3K NEL CANCRO
... 20
PTEN
... 22
PTEN NEL CANCRO
... 23
RUOLO FISIOLOGICO DI mTOR
... 25
mTOR NEL CANCRO
... 26
PDK1 INIBITORI ... 28
BISINDOLMALEIMMIDI
... 29
INDOLONI
... 31
1-BENZIL-2-OSSI-1,2-DIIDROPIRIDIN-3CARBOSSAMMIDI
33
DERIVATI PIRIMIDINICI
... 35
4-ETEROCICLOALCHIL-2-AMINOPIRIMIDINE
... 37
DIBENZO[C, F][2,7]NAFTIRIDINE
... 39
ACIDO 3-IDROSSIANTRANILICO
... 41
CELECOXIB DERIVATI ... 42
PDK1 ATTIVATORI E MODULATORI ... 43
AKT INIBITORI ... 46
2
INIBITORI DEL DOMINIO PH
... 52
INIBITORI ALLOSTERICI
... 55
PI3K INIBITORI... 58
mTOR INIBITORI ... 63
INIBITORI DUALI PI3K/ mTOR
... 65
TRATTAMENTO STANDARD DEL GLIOBLASTOMA ... 67
TERAPIE MIRATE ... 68
INIBITORI DEL PATHWAY PI3K-AKT-PDK1 IN FASE
CLINICA PER IL TRATTAMENTO DEL GLIOBLASTOMA ... 70
3
IL GLIOBLASTOMA
Il glioblastoma multiforme è un tumore primario del cervello, invasivo, a rapida crescita e prognosi infausta; fa parte degli astrocitomi e tra questi è il più maligno (grado IV). Istologicamente è caratterizzato da astrociti scarsamente differenziati, nuclei atipici, mostruosità cellulari, intensa attività mitotica, trombosi vascolare, proliferazione micro vascolare e necrosi. Esistono due varianti di glioblastoma multiforme: primitivo, il più frequente, che si sviluppa ex-novo ed il secondario, che si sviluppa da neoplasie meno maligne, come astrocitomi diffusi (grado II) o anaplastici (grado III).
Rappresenta il più frequente tumore cerebrale, avendo un’incidenza del 12-15% tra tutte le neoplasie intracraniche e del 50-60% di tutti i tumori astrocitari. In Europa l’incidenza è di circa 2-3 nuovi casi ogni 100.000 abitanti/anno. In Italia vi sono circa 7000 nuovi casi l’anno. Il glioblastoma può manifestarsi a qualsiasi età, ma si presenta prevalentemente negli adulti con un picco d’incidenza tra 45-70 anni, è più frequente negli uomini che nelle donne con un rapporto di 1,5:1.
Ad oggi il glioblastoma multiforme è incurabile e le terapie disponibili riescono solo a prolungare la sopravvivenza di alcuni mesi. La prognosi dei pazienti affetti da tale neoplasia è particolarmente sfavorevole con exitus entro 3-6 mesi dalla diagnosi per i soggetti non trattati.
I pazienti sottoposti a trattamenti radioterapici e/o asportazione chirurgica, eventualmente coadiuvati da chemioterapia, hanno una sopravvivenza media di circa dodici mesi, meno del 25% di questi sopravvive fino a due anni, mentre la sopravvivenza a cinque anni è eccezionale.1,2
Il processo di cancerogenesi deriva, nella maggioranza dei casi, da danni causati da agenti chimici o fisici ai cromosomi, i quali riducono la capacità della cellula di regolare processi fisiologici quali crescita, proliferazione e sopravvivenza cellulare. La perdita dei meccanismi di regolazione è il risultato di un’alterata espressione genetica causata da mutazioni, delezioni,
4
come ad esempio proto-oncogeni e geni oncosoppressori.
I proto-oncogeni sono geni che in condizioni fisiologiche controllano positivamente la crescita cellulare, e che se modificati (oncogeni), inducono trasformazione neoplastica (per es. RAS Akt/PBK o ABL); i geni oncosoppressori sono geni che in condizioni fisiologiche controllano negativamente la crescita cellulare e la cui inattivazione favorisce la trasformazione neoplastica (per es. p53 o PTEN). Le mutazioni che avvengono nella sequenza del DNA dei proto-oncogeni sono "dominanti": basta che un solo allele sia mutato perché il proto-oncogene si trasformi in oncogene e la cellula sia stimolata a crescere in maniera incontrollata. Per quanto riguarda invece i geni oncosoppressori, si parla di mutazioni "recessive": è necessario che tutte e due gli alleli di quel gene siano mutati perché gli oncosoppressori siano inattivi (figura 1).
Figura 1. Proto-oncogeni e oncosoppressori.
L’alterazione genetica porta ad una riduzione dei meccanismi di riparazione del DNA e ad un conseguente aumento della proliferazione cellulare.
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Successive alterazioni geniche possono portare ad instabilità genomica e allo sviluppo di cellule neoplastiche che sfuggono ai normali meccanismi di regolazione cellulare. La proliferazione incontrollata delle cellule neoplastiche è il primo passo per la genesi delle patologie tumorali; infatti la progressione tumorale e il conseguente sviluppo di metastasi implicano rimodellamento e invasione tissutale, perdita di adesione cellulare e l’acquisizione dell’immortalità da parte di tali cellule.3
La maggior parte degli agenti oncogeni sono rappresentati da proteine chinasi, le quali mediano la trasduzione del segnale fosforilando residui di treonina, serina, tirosina in proteine che svolgono un ruolo chiave sia nei processi fisiologici sia nello sviluppo tumorale.
Le proteine chinasi coinvolte in questi processi possono essere schematicamente divise in due gruppi principali: tirosina chinasi e serina-treonina chinasi.
Le serina-treonina chinasi a loro volta fanno parte di due grandi famiglie, ACG e MAPK. Nella famiglia delle ACG ritroviamo PKA (cyclic AMP-dependent kinase), PKC (Ca2+ activated protein kinase), PDK1 (phosphoinositide-dependent protein kinase-1) e PBK (protein kinase B anche detta Akt), le quali sono attivate da secondi messaggeri prodotti dall’interazione di ligandi specifici (fattori di crescita, citochine, etc.) con la porzione extracellulare del recettore tirosin-chinasico (RTK) o di recettori accoppiati a proteine G.4 La
famiglia delle MAPK (mitogen-activated protein kinase) comprende tra le altre RAF, MEK, MEKK, ERK e SNK/p38 le quali sono attivate da RAS, proteina G.5
Attualmente sono in studio per il trattamento del glioblastoma, farmaci inibitori di proteine chinasi quali PDK1, Akt, PI3K (phosphoinositide-3-kinase); la scelta di queste chinasi come bersaglio molecolare per il trattamento farmacologico delle neoplasie deriva dal fatto che la loro iperattivazione, comune in molte forme neoplastiche, compreso il glioblastoma, aumenta la proliferazione, l’angiogenesi, la resistenza alle terapie farmacologiche e ai meccanismi apoptotici delle cellule tumorali.
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Il 50% circa dei tumori umani, tra i quali il cancro alla prostata, alla mammella, alle ovaie, al polmone e allo stomaco, possiedono mutazioni a livello dei geni che regolano la produzione di fosfatidilinositolo-3,4,5-trifosfato (PIP3); questo fa sì che nelle cellule cancerose vi siano dei livelli molto alti di secondi messaggeri lipidici.6,7 L’aumento di PIP3 è dovuto soprattutto ad una ridotta espressione del gene oncosoppressore PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on cromosome ten) e/o ad una iperattivazione di PI3K.8 Il secondo messaggero lipidico PIP3 controlla una complessa rete di segnali cellulari che regolano processi fisiologici quali crescita, proliferazione e sopravvivenza cellulare. I suoi bersagli sono proteine localizzate nel citosol, le quali traslocano alla membrana plasmatica e legano PIP3 tramite il dominio pleckstrin homology (PH) non appena aumentano i livelli di PIP3.9,10 Come conseguenza si ha una iperattivazione di proteine, incluse PDK1 e Akt, le quali accentuano la proliferazione, l’angiogenesi e la resistenza ai meccanismi apoptotici delle cellule tumorali.11
AKT
Akt (o PKB) è una serina-treonina chinasi appartenente alla famiglia ACG, è anche l’omologo dell’oncogene virale v-Akt che sembra provocare il timoma (tumore derivato dalle cellule epiteliali del timo) nel topo. Questo enzima controlla numerose funzioni cellulari tra cui la crescita, la sopravvivenza, la proliferazione e il metabolismo. Esistono tre isoforme di Akt: Akt1, Akt2, Akt3 le quali presentano un alto grado di omologia strutturale, circa l’80%. Nonostante l’alta omologia strutturale esiste comunque una grande variabilità nei ruoli fisiologici svolti dalle differenti isoforme come suggerito da studi effettuati su topi Akt1, Akt2, Akt3 knockout. Akt1 e Akt2 sono espresse ubiquitariamente, mentre l’espressione di Akt3 è limitata ad alcuni organi
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quali il cuore, i polmoni, testicoli, il rene, il muscolo scheletrico e il cervello.
12-15 Per la massima attivazione delle tre isoforme è necessaria la fosforilazione
contemporanea di due siti: treonina 308/309/305 e serina 473/474/472 (rispettivamente in Akt1/2/3).12
Ogni isoforma di Akt possiede un dominio N-terminale PH, un dominio catalitico centrale ed un dominio C-terminale (figura 2).
Figura 2. Isoforme di Akt
•
Dominio N-terminale o domino PH
Il dominio PH è costituito da circa 120 aminoacidi e lega con alta affinità il PIP3 e il PIP2 (fosfatidilinositolo-3,4-difosfato). Questo dominio contiene una sequenza di residui aminoacidici basici al centro di un loop posto tra due foglietti β. Questa zona denominata “head group” interagisce con una ben definita tasca di legame formando legami ad idrogeno multipli con i gruppi fosfato disponibili.16
•
Dominio catalitico centrale (chinase domain)
Il dominio catalitico mostra un’alta similarità con quello di altre proteine appartenenti alla famiglia delle chinasi ACG per es. PKA, PKC, SGK, RSK. In
8
essere fosforilato rispettivamente in Akt1, 2, 3 perché queste vengano attivate.
• Dominio regolatorio C-terminale
Il dominio C-terminale è un dominio regolatorio che contiene una sequenza idrofobica denominata HM (hydrophobic motif); questa sequenza è presente in tutte le chinasi della famiglia ACG. In questo dominio è presente il residuo di serina (S473, S474, S472) che deve essere fosforilato per l’attivazione massimale di Akt.16
MECCANISMO DI ATTIVAZIONE DI AKT
L’attivazione di Akt inizia dalla stimolazione del recettore RTK (receptor tyrosine kinase), posto sulla superficie della membrana plasmatica, da parte dei sui ligandi specifici (fattori di crescita, insulina, citochine, etc.). La stimolazione del recettore RTK porta all’attivazione di PI3K che fosforila l’ossidrile in posizione 3’ del PIP2 producendo PIP3 nella regione intracellulare della membrana plasmatica.
Il segnale mediato da PIP3 rimane attivo fino a quando esso non viene defosforilato a PIP2 ad opera di PTEN (figura 3).
9
Akt interagisce con questi fosfolipidi e ciò causa la sua traslocazione dal citoplasma alla membrana, dove può interagire con PDK1 anch’esso reclutato da PIP3 attraverso il dominio PH.
L’interazione dei 3-fosfoinositidi con il dominio PH di Akt provoca un cambiamento conformazionale nell’enzima con conseguente esposizione dei suoi due principali siti di fosforilazione. In particolare PDK1 fosforila il residuo di treonina 308 posto nel T-loop, che anche se indispensabile per l’attivazione dell’enzima, non è sufficiente per la completa attivazione di Akt. Ad opera di un’altra chinasi denominata PDK2 (che non è stata ancora identificata) o del complesso denominato mTORC2 (mammalian target of rapamycin complex 2)avviene la fosforilazione della serina 473 posta nella regione idrofobica c-terminale dell’enzima che provoca la completa attivazione dell’enzima.17,18 Akt una volta attivata è traslocata all’interno del
nucleo, dove sono localizzati molti dei suoi substrati implicati nella regolazione di crescita, sopravvivenza e proliferazione cellulare (figura 4).19
10
PROCESSI CELLULARI REGOLATI DA AKT
Akt possiede più di 50 substrati che sono coinvolti nella regolazione della progressione e della sopravvivenza cellulare, nei meccanismi apoptotici e nell’angiogenesi. Akt agisce sui suoi substrati fosforilando residui di serina e treonina, posti in una zona ricca di aminoacidi basici; infatti la sua sequenza minima consenso è R X R X X S/T Hyd (dove R è arginina, S serina, T treonina, X è un qualunque aminoacido mentre Hyd è un aminoacido idrofobico).
Akt è in grado promuovere la sopravvivenza cellulare sia fosforilando proteine che giocano un ruolo chiave nella cascata apoptotica sia fosforilando fattori di trascrizione che controllano l’espressione di geni pro- e anti-apoptotici.20,21
•
Regolazione dell’apoptosi
Numerosi substrati di Akt sono proteine e fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione dell’apoptosi come ad esempio Bad, caspasi-9 e i fattori di trascrizione forkhead.
Bad (BCL-antagonist of cell death) è un membro della famiglia bcl-2, un’importante classe di proteine coinvolte nella regolazione dell’apoptosi. Si lega alle proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-xL, bloccando così la loro funzione.22
Akt fosforila Bad a livello della Ser136, in seguito alla fosforilazione Bad è sequestrato nel citosol e questo gli impedisce di legarsi a Bcl-2 e Bcl-xL, viene ristabilita così la funzione anti-apoptotica di queste proteine.23,24
Caspasi-9, un’importante iniziatore ed effettore della cascata apoptotica, è inattivata da Akt. È stato dimostrato che Akt fosforila caspasi-9 a livello della Ser196, bloccandone l’attività proteasica.25
Tra i fattori di trascrizione bersagli di Akt ritroviamo FOXO1, FOXO2, FOXO3 membri della famiglia forkhead. Akt li fosforila e li sequestra nel citoplasma
11
bloccando la trascrizione di geni pro-apoptotici quali ligando Fas, BIM, TRAIL e TRADD.26
Anche il fattore di trascrizione pro-apoptotico YAP (
Yes
associated
protein
) viene fosforilato da Akt, ciò causa il suo sequestro nel citosol e l’inibizione della sua funzione.27Akt può inoltre fosforilare fattori di trascrizione con funzione anti-apoptotica, come CREB (cyclic AMP response element binding protein): la fosforilazione aumenta la sua attività trascrizionale e promuove l’espressione di importanti geni a funzione anti-apoptotica, come Bcl-2 e Mcl1.28
•
Regolazione del ciclo cellulare
Akt è un importante mediatore della proliferazione cellulare infatti promuove la progressione del ciclo cellulare, la sintesi del glicogeno e quella proteica. Akt fosforila direttamente e inattiva p21 cip1/waf1 e p27 kip1 inibitori del ciclo cellulare. La ritenzione citoplasmatica di p21 cip1/waf1 e p27 kip1 causata dalla
fosforilazione compromette la loro funzione di inibitori della ciclina/CDK, che svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della progressione del ciclo cellulare.29-31
Akt fosforila e inattiva GSK-3, la cui inibizione provoca l'attivazione della ciclina D1, che entra nel nucleo e promuove la progressione del ciclo cellulare.32
Inoltre, Akt è coinvolto nella via di segnalazione Raf-MEK-ERK. Akt fosforila direttamente e inattiva Raf, si ha così proliferazione cellulare anziché arresto della stessa.33,34 Akt fosforila e attiva eNOS, portando ad angiogenesi NO-mediata nelle cellule endoteliali.
Un importante bersaglio a valle di Akt è la serina/treonina proteina chinasi mTOR che regola la crescita e la proliferazione cellulare.35
12
Figura 5. Effetti biologici dell’attivazione di Akt
Akt è anche implicato nel metabolismo del glucosio insulino-mediato. Esistono diversi percorsi paralleli a valle di PI3K che sono coinvolti in questo processo.36 GSK-3, un regolatore negativo della sintesi del glicogeno, viene fosforilato ed inibito da Akt, dando inizio alla sintesi del glicogeno. 37,38
Inoltre, Akt sembra essere implicato nella traslocazione dei trasportatori del glucosio GLUT1/4 verso la membrana in risposta allo stimolo insulinico, sebbene l'esatto meccanismo non è ancora chiaro.39 Infine, Akt stimola la
glicolisi mediante fosforilazione e attivazione di diverse altre proteine coinvolte nella cascata del segnale dell’ insulina quali PFK2 e PDE-3B.40-42
13
AKT NEL CANCRO
Akt è una chinasi frequentemente iperespressa nei tumori umani nei quali promuove accrescimento, invasività, resistenza all’apoptosi e alla chemioterapia. Questo effetto è ampiamente prevedibile dato il ruolo fisiologico che Akt ricopre.
L'attività di Akt è regolata da PI3K e PTEN proteine ad azione, rispettivamente, chinasica e fosfatasica che regolano i livelli intracellulari di PIP3. PI3K promuove l’attivazione di Akt mentre PTEN la inibisce. In condizioni fisiologiche l’azione dei due enzimi è perfettamente bilanciata, mentre è stato dimostrato che in condizioni patologiche vi è uno squilibrio tra i due enzimi con conseguente iperattivazione di Akt (figura 6 A e B).
Figura 6. A)Regolazione di Akt nelle cellule normali B) Regolazione di Akt nelle cellule tumorali.
In alcuni tumori vi è l’iperattivazione di specifiche isoforme di Akt correlate e non ad amplificazione genetica. L’amplificazione del gene che codifica per Akt2 è stata riportata nei tumori ovarici e pancreatici;43,44 l’amplificazione di Akt1 nei tumori gastrici, 45 quella di Akt3 nel melanoma.46 L’iperespressione
14
Akt1 è stata riscontrata nei tumori della mammella,49 mentre aumentati livelli dell’mRNA di Akt3 sono stati ritrovati nel tumore della mammella estrogeno-indipendente50 e nel melanoma.46 Uno studio multicentrico su larga scala ha
rivelato che i pazienti con carcinoma ovarico in cui vi era elevata espressione di Akt2 presentano un tasso di sopravvivenza minore rispetto ai pazienti con normale espressione di Akt2.49Inoltre, la sovraespressione di Akt è stata trovata in molti tumori che presentano un fenotipo clinicamente più aggressivo e più resistente ai trattamenti, come NSCLC (non-small-cell lung cancer), i tumori della mammella e della prostata ormono-insensibili.50,51
COMPONENTI DEL PATHWAY PI3K-AKT-PDK1
L’attività di Akt, che svolge un ruolo principale in questa via di segnalazione, è regolata da quattro fattori principali: PDK1, PI3K, PTEN e mTOR.
15
PDK1
PDK1 è una serina-treonina chinasi appartenente alla famiglia delle proteine chinasi ACG; tale chinasi è ubiquitariamente espressa nei tessuti umani, e come gli altri membri di questa famiglia, necessita della fosforilazione a livello dell’activation-loop (serina 241) per essere attivata. Nei mammiferi PDK1 autofosforila il residuo di serina 241 tramite una reazione intermolecolare, questo rende l’enzima costitutivamente attivo.52,53
Questo enzima formato da 556 aminoacidi presenta un dominio catalitico N-terminale e una coda C-N-terminale contenente il dominio non catalitico pleckstrin homology (PH) (figura 8).54
Figura 8. Struttura cristallografica di PDK1
Studi biochimici e genetici hanno dimostrato che PDK1 è il principale regolatore di almeno 23 proteine chinasi facenti parte della famiglia ACG. Le
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treonina chinasi come ad esempio Akt (tutte le isoforme), p70SK1 (p70 ribosomal S6 kinase), RSK (p90 ribosomal S6 kinase), SGK (serum- and glucocorticoid-induced protein kinase) e PKC (figura 9). Queste chinasi mediano i diversi effetti che i fattori di crescita hanno sulla sopravvivenza e sulla proliferazione cellulare.55
Figura 9. Chinasi bersaglio di PDK1
In base al meccanismo con cui vengono fosforilate ad opera di PDK1, tali chinasi possono essere classificate in 4 gruppi principali.52
Il primo gruppo denominato “lipid-dependent substrates”, include le isoforme di Akt che sono convertite in substrati di PDK1 in seguito all’interazione con PIP3, e alcune isoforme di PKC, che possono essere convertite in substrati di PDK1 mediante l’interazione con esteri del forbolo, diacilglicerolo, fosfatidilserina, fosfatidilcolina o PIP3.56-58
Il secondo gruppo “ phosphorylation-dependent substrates” include p70S6K e le isoforme di SGK, che per poter interagire con PDK1 devono essere fosforilate a livello della loro porzione idrofobica.59-63
Del terzo gruppo “ Rho-dependent substrates” fanno parte PRK-1 e PRK-2, che interagiscono con le Rho-GTP tramite il loro dominio Rho-binding presente nella zona N-terminale. Questa interazione dà luogo ad un
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cambiamento conformazionale che consente a PDK1 di interagire e fosforilare questi enzimi.64
L’ultimo gruppo include enzimi quali PKA e p90RSK che vengono fosforilati da PDK1 non appena sono sintetizzati e la loro regolazione avviene dopo questa fosforilazione. PKA per esempio è regolata tramite la formazione di complessi con altre subunità proteiche, mentre p90RSK è attivato dalla fosforilazione di residui diversi, rispetto a quelli fosforilati da PDK1, nella via delle MAPK.65-69
18
PDK1 NEL CANCRO
Un aumento del numero di copie di PDK1 è spesso presente nel carcinoma mammario umano. Questo aumento è stato correlato con la presenza di mutazioni attivanti delle chinasi PI3K di classe I o con la sovraespressione di ERBB2. È stato dimostrato che la sovraespressione di PDK1 è sufficiente per indurre trasformazione neoplastica nelle cellule dell’epitelio mammario.
Alti livelli di PDK1 sono stati riportati nel 45% dei pazienti con leucemia mieloide acuta. Inoltre si pensa che PDK1 possa essere implicato nella progressione del cancro ovarico.
PDK1 ha un ruolo essenziale nella regolazione della migrazione cellulare specialmente quando vi è una carenza dell’oncosoppressore PTEN. È stato, infatti, osservato che PDK1 controlla la migrazione e la trasformazione maligna, ma non la crescita e la proliferazione cellulare, in linfociti in cui è stato deleto PTEN.70
La riduzione dei livelli di PDK1 in cellule di cancro al seno umano inibisce la migrazione e la formazione di metastasi. Infatti cellule endoteliali differenziate da cellule staminali embrionali di topo prive di PDK1 perdono completamente la loro capacità di migrare in vitro in risposta al fattore di crescita VEGF-A (Vascular endothelial growth factor A).
Dato il ruolo cruciale svolto dall’angiogenesi nella progressione del cancro, PDK1 potrebbe essere un valido bersaglio farmacologico per il trattamento di tumori altamente invasivi e metastatici.
19
PI3K
PI3K è membro di una famiglia di chinasi formata da otto isoforme che sono raggruppate in tre classi I, II, III. Le chinasi di classe I sono eterodimeri composti da una subunità catalitica (p110) ed una subunità regolatrice (p85). Questa Classe è ulteriormente suddivisa in due sotto classi:
1. IA, comprende chinasi attivate dai recettori protein-tirosin-chinasi (RTK) le quali sono formate da tre tipi di subunità catalitiche p110α, 110β, 110δ che formano eterodimeri con una delle tre subunità regolatrici p85α, p85β, p55γ.
2. IB, comprende chinasi la cui subunità catalitica p110γ, forma eterodimeri con la subunità regolatrice p84 o con quella p101, questa classe è attivata da recettori accoppiati a proteina G.
FIGURA 11: MECCANISMO DI ATTIVAZIONE PI3K DI CLASSE IA E IB
Le chinasi PI3K di classe II sono proteine monomeriche che comprendono le isoforme PI3KC2α, PI3KC2β e PI3K2Cγ.
Quelle di classe III sono eterodimeri formati da una subunità catalitica (Vsp34) ed una regolatrice (figura 12). 71,72
20
FIGURA 12. PI3K CLASSE I II e III
PI3K NEL CANCRO
L’iperespressione di PI3K è molto comune nei tumori umani ed è dovuta soprattutto all’amplificazione o alla mutazione del gene PIK3CA che codifica per la subunità catalitica p110α. Mutazioni a carico del gene PIK3CA sono state riscontrate nei tumori alle ovaie, al colon e alla mammella.73-76
Queste alterazioni genetiche causano l’aumento dell’attività enzimatica di PI3K che accentua la proliferazione, l’angiogenesi, la resistenza ai trattamenti chemioterapici nelle cellule tumorali.
Ad oggi non sono state riscontrate alterazioni a livello dei geni che codificano per le isoforme β, γ e δ della subunità p110, tuttavia è stato riscontrato un aumento dei livelli di queste isoforme in alcuni tumori del colon, della vescica e nel glioblastoma.77,78
Da studi effettuati su colture cellulari è emerso che l’iperespressione dell’isoforma p110α wild-type, non correlata con l’alterazione del gene PIK3CA, non è sufficiente ad indurre la trasformazione neoplastica; mentre
21
l’iperespressione delle isoforme p110 β, γ e δ wild-type è di per se sufficiente ad indurre tale trasformazione.79
Recenti studi hanno dimostrato che PI3K riveste un ruolo importante nella regolazione dell’angiogenesi sia nelle cellule normali che in quelle tumorali.80
L’angiogenesi è un passaggio cruciale nella genesi del tumore, infatti, la formazione di nuovi vasi sanguigni è indispensabile per mantenere un adeguato apporto di ossigeno e nutrienti alla massa in accrescimento.
Il ruolo che riveste PI3K nell’angiogenesi e nello sviluppo tumorale lo identifica come un ottimo target sia per la terapia antineoplastica sia per la terapia antiangiogenica.
22
PTEN
PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) anche noto come MMAC1 (mutated in multiple advanced cancers-1) o TEP1 (tensin-like Phosphatase-1), fu identificato nel 1997 da tre gruppi indipendenti guidati da Parsons, Steck, e Sun.
PTEN è una fosfatasi lipidica che defosforila la posizione 3 dell’anello inositolico del PIP3 convertendolo in PIP2. PTEN antagonizza gli effetti di PIP3 ed è quindi il principale modulatore negativo della cascata di segnalazione di Akt (figura 13).
23
Questa proteina formata da 403 aminoacidi presenta un dominio fosfatasico e un dominio C2. Il dominio fosfatasico contiene il sito attivo ed è responsabile della funzione enzimatica; mentre il dominio C2 lega i fosfolipidi di membrana, provvedendo all’ancoraggio dell’enzima alla membrana plasmatica.81
Figura 14. Struttura di PTEN
PTEN NEL CANCRO
PTEN è il principale modulatore negativo della cascata di Akt. Il gene che codifica per l’oncosoppressore PTEN è il secondo gene più frequentemente mutato nei tumori umani dopo p53.82 È stato dimostrato che cellule in cui si
ha una delezione di PTEN (per es. glioblastoma U87 PTEN-/-) possiedono elevati livelli di PIP3 ed elevata attività di Akt e p70S6K1.82,83 Inoltre è stato
osservato che modelli animali in cui manca una copia del gene PTEN (PTEN+/-) presentano crescita cellulare incontrollata.
Modificazioni nel gene codificante per PTEN sono state documentate in vari tumori umani quali mammella, prostata, endometrio, ovaie, colon, melanoma, linfoma e glioblastoma.84,85
24
mTOR (mammalian target of rapamycin) è una serina-treonina chinasi appartenente alla famiglia delle chimasi PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase related kinase) che regola la crescita, la proliferazione, la motilità e la sopravvivenza cellulare, la sintesi proteica e la trascrizione.86,87
mTor è un enzima formato da 2549 aminoacidi, nell’uomo è codificata dal gene FRAP1 e fa parte di due complessi mTOR complex1 (mTORC1) e mTOR complex2 (mTORC2).88
mTORC1 è composto da mTOR, dalla proteina G Rheb, da mLST8/GβL, una proteina simile alla subunità beta della proteina LST8/G dei mammiferi, da PRAS40 (proline-rich Akt substrate of 40 kDa ), DEPTOR (DEP domain-containing mTOR interacting protein) e raptor (regulatory-associated protein of mTOR).
mTORC2 è composto da mTOR, mLST8/GβL, DEPTOR, rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR), mSin1 (mammalian stress-activated map kinase-interacting protein1 ) e protor1 e 2 (protein observed with rictor 1 e 2) (Figura 15).
25
mTOR viene regolato da una grande varietà di segnali cellulari, tra cui ritroviamo fattori di crescita, come IGF-1 IGF-2 e EGF, ormoni come l’insulina e nutrienti come aminoacidi e glucosio. Un importante attivatore di mTOR è Akt, il quale fosforila il soppressore tumorale TSC2 e interrompe la sua interazione con TSC1, ciò porta ad un aumento dei livelli di Rheb e alla successiva attivazione di mTOR.89 Inoltre Akt fosforila e inattiva la proteina
raptor-binding PRAS40 eliminando la sua attività inibitoria su mTOR complesso mTOC1.90-92
RUOLO FISIOLOGICO DI mTOR
L’attivazione di mTOR stimola la sintesi proteica mediante fosforilazione e attivazione di S6K e fosforilazione ed inattivazione di 4E-BP1.
Dopo essere stato attivato da mTOR, S6K fosforila la proteina ribosomiale S6 portando ad un aumento della traduzione di mRNA.
4E-BP1 non fosforilato si lega strettamente al fattore eucariotico iniziante la trascrizione 4E (eIF4E), così previene il suo legame all’mRNA e il suo reclutamento al complesso di iniziazione ribosomiale. Dopo essere stato fosforilato da mTOR, 4E-BP1 rilascia eIF4E, permettendogli di dare inizio alla trascrizione.92
Questo enzima inoltre è uno dei fattori che coordinano la progressione del ciclo cellulare, esso regola positivamente la transizione dalla fase G1 alla fase S bloccando il turnover della ciclina D1 e stimolando la degradazione dell’inibitore della chinasi ciclina dipendente (CDK), p27.94
In particolare mTORC1, contribuisce allo sviluppo, alla differenziazione, e alla crescita dell'epitelio polmonare acinare, dei condrociti, dei miociti e degli adipociti.
In questi tessuti, mTOR media l'attivazione del fattore di trascrizione HIF-1α, (ipossia-inducibile factor-1α) e regola gli enzimi glicolitici, con conseguente aumento dell'assorbimento di glucosio e della glicolisi.95
26
polimerasi I e III, che sono responsabili della trascrizione di RNA ribosomiale e transfert.96
Figura 16. Effetti fisiologici di mTOR
mTOR NEL CANCRO
Le vie di segnalazione che attivano la chinasi mTOR sono alterate in molti tumori umani, ciò porta ad una alterata espressione sia di mTOR che dei suoi substrati.
Per esempio, S6K1 è iperespressa o costitutivamente attiva in numerose linee cellulari tumorali ed è amplificata in alcuni carcinomi della mammella. Generalmente, per i tumori che hanno una amplificazione di S6K1, vi è un corrispondente aumento delle proteine codificate da S6K1. 97
27
Il gene codificante per eIF4E positivamente regolato da mTOR, è modificato in numerosi tumori umani, inoltre sono stati riscontrati livelli elevati di eIF4E in alcuni carcinomi del colon, della vescica e della mammella.98-100
In questi tumori, è stato riscontrato anche un un corrispondente aumento del fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF).
28
PDK1 INIBITORI
I composti che hanno come bersaglio PDK1 hanno dimostrato, in vitro, di inibire la via di Akt. Questo blocco si traduce nell’inibizione della crescita e nell’induzione dell’apoptosi.
La protein chinasi PDK1 presenta due domini ben caratterizzati: un dominio PH al C-terminale e un dominio catalitico N-terminale costitutivamente attivo. Il dominio catalitico della protein chinasi PDK1 presenta tre siti di legame: quello per l’ATP, la tasca idrofobica regolatrice HM (nota anche come PIF) e il sito chinasico (Figura 17).101La maggior parte dei ligandi di PDK1 sono
inibitori competitivi che interagiscono con il sito di legame per l’ATP.
Questi inibitori appartengono a classi strutturali diverse quali bisindolmaleimmidi, indoloni, 1-benzil-2-ossi-1,2-diidropiridin-3-carbossammidi, derivati pirimidinici, dibenzo[c,f][2,7]naftiridine, derivati dell’acido 3-idrossiantranilico.
29
BISINDOLMALEIMMIDI
Tra i ligandi che presentano buona attività inibitoria nei confronti di PDK1 vi sono composti come LY333531, la staurosporina e UCN-01 (7- idrossi-staurosporina) che hanno un nucleo bisindolmaleimmidico.
FIGURA 18. Strutture di LY333531, STAUROSPORINE e UCN-01.
Nell’interazione con il sito di legame per l’ATP, LY333531 (IC50= 0.75 µM)
forma tre legami ad idrogeno tra i gruppi polari della regione maleimmidica (O5, N6 e O7) e gli aminoacidi della hinge region di PDK1 (Ala162, Ser160 e Thr222 rispettivamente). In questo caso, sia il legame O5---NH Ala162 che il legame N6---O Ser160 mimano l’interazione dell’ ATP con PDK1 (Figura 19).
30
e con Ser160, mentre la porzione amminica protonabile interagisce con Glu166; quest’ultima interazione mima il legame ad idrogeno tra il ribosio e PDK1 nell’interazione con l’ATP. Diversamente da quanto accade con LY333531, quando il ligando è la staurosporina, la Thr222 interagisce con l’ossigeno carbonilico della Val143.102
Il composto UCN-01, grazie alla presenza di un ossidrile in posizione 7, riesce a formare un terzo legame ad idrogeno con la Thr222 di PDK1 ed un’interazione con Gln220, inoltre la Val143 cambia posizione e non interagisce più con Thr222 (Figura 20).103
FIGURA 20. Interazione tra PDK1 e A) staurosporina, B) UNC-01
Fra questi composti, LY333531 presenta una debole attività inibitoria verso PDK1, la staurosporina possiede alta potenza ma bassa selettività, mentre UCN-01 presenta una buona potenza e una buona selettività ed è infatti in fase clinica.
31 INDOLONI
Nel 2006 i ricercatori di Bayer Schering Pharma AG hanno brevettato una classe di derivati indolonici come inibitori di PDK1. Questi composti possiedono come nucleo centrale il raggruppamento (3Z)-3- (1H-pirrol-2-il-metilen)-1,3-diidro-2H-indol-2-one (Figura 21), che è anche il nucleo presente nel sunitinib (SU11248), un multi-chinasi inibitore. 104
FIGURA 21. Composto 1 (3Z)-3-(1H-pirrol-2-ilmetilen)-1,3-diidro-2H-indol-2-one.
Questo composto inibisce in vitro PDK1 con IC50=0,52 µm e PKA a
concentrazioni nove volte maggiori (IC50=16 µm), inoltre sembra bloccare
l'attivazione di Akt nelle cellule tumorali.
L'ottimizzazione di questo lead compound ha successivamente portato a potenti e selettivi inibitori di PDK1.
In particolare, BX-517, che è un inibitore di PDK1 estremamente potente (IC50=5 nM) ed è 320 volte più selettivo per PDK1 rispetto a PKA.105
32
interazioni che si hanno a livello molecolare (Figura 23). Il nucleo pirrolo-indolonico forma tre legami ad idrogeno con la hinge region del dominio catalitico di PDK1: l’ azoto dell’indolone interagisce con il gruppo carbonilico della Ser160, l’ossigeno dell’indolone forma un legame a idrogeno con l’ammide del residuo di Ala162 e l'azoto del pirrolo forma un legame ad idrogeno con il gruppo carbonilico di Ala162. Quest’ultimo tipo d’interazione si verifica solo nel caso in cui BX-517 è nella configurazione 3Z dimostrando che la stereochimica del doppio legame è fondamentale per l’attività questo composto. Inoltre il gruppo ureidico in posizione 5 forma un legame ad idrogeno sia con le catene laterali di Lys111 sia con la funzione idrossilica di Thr222.
Figura 23. Interazione tra BX-517 e PDK1
L’interazione di BX-517 con Thr222 potrebbe spiegare la selettività per PDK1, infatti lo stesso tipo di interazione si ha con UCN-01 e non con la staurosporina in accordo con il fatto che UCN-01 è più selettivo per PDK1. 106
La maggiore selettività di BX-517 nei confronti di PDK1 rispetto a PKA può essere spiegata dalla presenza in PKA della Met120, un residuo molto ingombrante che è orientato in modo tale da impedire l’ingresso della porzione ureidica di BX-517 nella tasca di legame per l’ATP. In PDK1, invece,
33
vi è la Leu159 che essendo meno ingombrante permette a BX-517 di entrare nel sito di legame.
Tuttavia, BX-517 ha uno scarso profilo farmacocinetico che include una breve emivita, bassa stabilità metabolica, e scarsa solubilità in mezzi acquosi, quindi non può essere utilizzato a fini terapeutici.105
La modalità con cui BX-517 interagisce con PDK1 suggerisce possibili sostituzioni con gruppi idrofili sulla posizione 4' del pirrolo, perché tale porzione della molecola interagisce con una zona della tasca dell'ATP accessibile ai solventi. Tale posizione potrebbe perciò essere usata per aumentare l'idrosolubilità e ottimizzare le proprietà farmacocinetiche.
1-BENZIL-2-OSSI-1,2-DIIDROPIRIDIN-3-CARBOSSAMMIDI
I ricercatori della Sunesis Pharmaceuticals/Biogen Idec Inc. hanno studiato una serie di 1-benzil-2-ossi-1,2-diidropiridin-3-carbossammidi come potenti inibitori di PDK1.107
Questi inibitori presentano un linker flessibile (L) tra il nucleo carbossammidico e un raggruppamento donatore (HD)/accettore (HA) di legami ad idrogeno in grado di interagire con Ala162 e Ser160 della hinge region di PDK1 (figura 16).
La distanza tra la porzione HD e l’atomo di azoto dell’ammide deve essere circa di sei unità di carbonio (7-8 Å), mentre la distanza tra la porzione HA e l'azoto ammidico deve essere di otto unità di carbonio (8,5-9,5 Å).
Figura 24. Rappresentazione schematica delle 1- (3,4-difluorobenzil)-2-ossi-1,2-diidropiridin-3-carbossammidi.
34 in tabella 1.
Per determinare l'attività biologica di questi composti è stata valutata l’inibizione di PDK1 sia fosforilato che defosforilato, inoltre è stato valutato il livello di fosforilazione della Thr308 di Akt (Tabella 1). La potente inibizione di p-PDK1 indotta in vitro dai composti 2, 3, e 6 comporta significative diminuzioni di p-Akt (Thr308) nelle cellule esaminate.108
35
DERIVATI PIRIMIDINICI
Nel 2004 da alcuni ricercatori della Schering AG sono stati brevettati dei derivati a struttura N-fenilpirimidino-2-amminica (BX-320, BX-795 e BX-912) con una buona attività inibitrice nei confronti di PDK1.
Figura 25. Strutture dei composti, BX-795, BX-912 e BX-320
Bx-795 (IC50=0.3 µM) e BX-320 (IC50=1-3µM) inibiscono la fosforilazione di
Thr308 di Akt nelle linee cellulari del carcinoma prostatico umano (PTEN-/-
PC-3) che presentano Akt costitutivamente attiva. Inoltre i composti della serie BX determinano una diminuzione dei livelli di autofosforilazione della Ser241 di PDK1 (tabella 2).109
36
Le interazioni tra BX-320 e il sito attivo di PDK1 si hanno a livello del nucleo 2-aminopirimidinico che si lega al residuo Ala162 attraverso un legame ad idrogeno, inoltre l’ossigeno dell’ammide terminale forma un legame ad idrogeno con il gruppo ossidrilico della Ser94 (Figura 18). Sebbene BX-795 e BX-912 possiedono diversi raggruppamenti in questa posizione (tiofene e imidazolo rispettivamente) si hanno simili interazioni ligando-proteina con lo zolfo del tiofene e l’azoto dell’imidazolo entrambi ibridizzati sp2 ed entrambi in grado formare un legame ad idrogeno con la Ser94. 110
37
Figura 26. Interazione tra BX-320 e PDK1
4-ETEROCICLOALCHIL-2-AMINOPIRIMIDINE
Una classe interessante di inibitori di PDK1 è rappresentata dalle 4-eterocicloalchil-2-aminopirimidine progettate nei laboratori della Boehringer Ingelheim International GmbH (Tabella 3).
38
prostatico umano PC-3. Si pensa che la frazione 2-aminopirimidinica di questa serie, analogamente a quello che si verifica con strutture analoghe come BX-320, sia in grado di interagire con la hinge region formando legami ad idrogeno, mentre R1 e R3 interagiscono con le regioni idrofobiche della tasca di legame per l’ ATP.
39
DIBENZO[C, F][2,7]NAFTIRIDINE
Nel 2007 i ricercatori della Wyeth hanno sintetizzato una classe di dibenzo[c, f][2,7]naftiridine come potenti e selettivi inibitori di PDK1. 111
Il composto 7 (Figura 27) che ha mostrato IC50=0,06 µM per PDK1 è stato
scelto come lead compound.
Figura 27. Struttura composto 7
Questo composto inoltre sembra inibire potentemente la crescita di alcune cellule tumorali (tabella 4).
40
eseguiti studi di analisi strutturale ai raggi X del composto 7 complessato con PDK1 (Figura 28).
Figura 28. Interazione tra il composto 7 e PDK1.
Il nucleo dibenzo[c,f][2,7]naftiridinico si posiziona tra Leu212 e Leu88 formando legami ad idrogeno con la hinge region. In particolare, N8 instaura un legame ad idrogeno con l’NH ammidico di Ala162 mentre il gruppo amminico legato a C6 forma un legame ad idrogeno con l'ossigeno carbonilico di Ser160. Un terzo legame ad idrogeno si forma tra l'azoto N5 e il gruppo ossidrilico OH di Thr222 (simili interazioni si hanno tra PDK1-UCN-01 e BX-517-PDK1). Inoltre la funzione amminica in C-3 interagisce con la proteina tramite una molecola d’acqua. I residui coinvolti in quest’ultimo tipo d’interazione non sono stati ancora identificati, anche perché questa particolare interazione acqua-mediata tra il composto 7 e PDK1 non è riscontrabile in altri composti che si legano a PDK1. Tuttavia, si potrebbe ipotizzare che questo tipo di legami ad idrogeno in cui l’acqua fa da ponte può dare un importante contributo alla selettività di 7 nei confronti di PDK1. L’inserimento di opportuni gruppi funzionali in grado di mimare la molecola
41
d’acqua potrebbe portare a derivati dibenzo [c, f][2,7]naftiridinici con buona potenza e selettività nei confronti di PDK1.102
ACIDO 3-IDROSSIANTRANILICO
È stato dimostrato che l'acido 3-idrossiantranilico (HAA) inibisce l’autofosforilazione di PDK1 a livello della Ser241, in un intervallo di concentrazione compreso tra 50-200 µM. 112 Per quanto riguarda le
interazioni di HAA con la tasca di legame per l’ ATP (Figura 29), similmente alle comuni interazioni ligando-PDK1, si formano legami ad idrogeno con la hinge region tra la funzione ossidrilica e quella amminica e l'ossigeno carbonilico della Ser160. Contemporaneamente l’ossigeno della funzione ossidrilica instaura un legame ad idrogeno con Ala162. Un terzo legame ad idrogeno si forma tra il gruppo carbonilico di HHA e il gruppo ossidrilico di Thr222.
42
Un’interessante attività inibitoria nei confronti PDK1 è stata riportata per composti attivi su altri target come il celecoxib che è un inibitore della cicloossigenasi-2 (COX-2). È stato dimostrato che il celecoxib può bloccare l'attivazione di Akt 113 in diverse linee di cellule tumorali inibendo l'attività enzimatica di PDK1 con un IC50 di 3,5 µM.114 Il celecoxib sembra inibire PDK1
perché compete per il legame con l’ATP.
Sulla base di questo risultato sono stati identificati nuovi derivati del Celecoxib come OSU-03013 e OSU-0312 (figura 31) che hanno mostrato un’attività antiproliferativa leggermente migliorata (IC50 ꞊ 3µM).115
Celecoxib è attualmente in fase II / III di studi clinici come agente singolo o in combinazione con altri agenti terapeutici.
43
PDK1 ATTIVATORI E MODULATORI
Oltre allo studio sui classici inibitori competitivi sono stati fatti studi su attivatori allosterici di PDK1.116,117 L’interazione di questo tipo di composti con PDK1 non si ha a livello del sito di legame per l’ATP, bensì a livello della tasca idrofobica HM/PIF che attiva l'enzima allostericamente.
In PDK1 la tasca HM/PIF interagisce con la tasca HM dei sui substrati (ad esempio le chinasi RSK, p70S6K, e SGK) solo quando questi sono fosforilati. Questa interazione attiva l’enzima stesso che così è in grado di legare l’ATP e di fosforilare ulteriormente queste chinasi.118,119 Secondo questo modello di
attivazione allosterica il Glu130 presente nel sito HM/PIF correttamente posizionato si lega al residuo di Lys111 presente nel sito attivo che interagisce con l'α-fosfato di ATP (Figura 32).
44
possedere da un lato una porzione idrofobica per legare il motivo PIF/HM e dall'altro una porzione acida che mima il residuo fosforilabile del substrato. Nel 2004 i ricercatori di Phosphosites GmbH hanno riportato dei composti in grado di regolare le proteine chinasi.104 Successivamente, hanno dimostrato che cinque composti che hanno come nucleo centrale l’acido-3-ossi-1,3-difenilpropil-tioacetico 8 risultano essere modulatori selettivi di PDK1 (Tabella 5). 105 L'acido più potente 9 è in grado di attivare PDK1, ma non ha
mostrato alcuno effetto significativo sulla fosforilazione di S6K1, PKA, e altre chinasi AGC. Coerente con l'ipotesi che la parte acida è essenziale per l’ attività su PDK1 il composto 10 che presenta un estere metilico invece della funzione carbossilica libera è quasi inattivo. Avendo il nucleo 8 un atomo di carbonio chirale nella parte farmacoforica non è ancora chiaro se la miscela racemica o uno stereoisomero definito contribuisce all'attività.
45
Poiché i substrati SGK e S6K per essere fosforilati e attivati da PDK1 devono legarsi alla porzione HM/PIF, se vi è una porzione acida legata alla tasca PIF, al posto della funzione fosfato, si può inibire il loro legame con la tasca stessa e quindi la loro attivazione da parte PDK1. In linea con questa ipotesi la fosforilazione specifica di S6K1 e SGK1 catalizzata da PDK1 risulta bloccata dal composto 9 ad una concentrazione di 200 µM.
I composti derivati dall’acido 3-ossi-1,3-difenilpropil-tioacetico sono, quindi, simultaneamente attivatori di PDK1 e inibitori a livello della tasca HM/PIF, e possono dunque essere considerati come modulatori di PDK1.
46
AKT INIBITORI
La serina-treonina chinasi Akt gioca un ruolo importante nella proliferazione e nella sopravvivenza della cellula tumorale. Presenta, quindi, tutte le caratteristiche per essere un buon target per la terapia antitumorale.
Akt è una serin-treonin chinasi facente parte della famiglia ACG. Esistono tre isoforme di questo enzima: Akt1, Akt2, Akt3, ognuna delle quali possiede un dominio N-terminale PH (Pleckstrin homology), un dominio catalitico centrale ed un dominio C-terminale contenente una sequenza idrofobica denominata HM ( hydrophobic motif ). 16
Figura 33. Struttura di AKT
I principali Akt inibitori si possono classificare in: Inibitori del sito chinasico;
Inibitori del dominio PH; Inibitori allosterici.
47
Figura 34. Akt inibitori
INIBITORI DEL SITO CHINASICO
La maggior parte degli inibitori del sito chinasico sono inibitori competitivi dell’ATP in quanto si legano alla tasca di legame per l’ATP.
Negli ultimi anni sono stati sintetizzati numerosi inibitori di Akt competitivi dell’ATP appartenenti a diverse classi strutturali.
I ricercatori di Abbott Labs hanno scoperto una serie di piridine-3,5-disostituite che hanno mostrato una buona attività inibitoria di Akt . Questi inibitori sono stati ottenuti per ottimizzazione del lead compound 1 (figura 35) (Akt1 IC50=5,3 µM). 120-122
48
Studi di SAR su questi composti hanno dimostrato che il cloro in posizione 2 nel composto 1 non è necessario per l'attività. L’incorporazione di un gruppo arilico in posizione terminale della catena laterale (posizione 5) migliora nettamente l'attività su Akt. In particolare l’inserimento di una catena laterale contenente un gruppo indolico in posizione 3, come nel composto 2, determina un aumento dell’attività su Akt1 di circa 385 volte, rispetto al composto 1 (Figura 36) (Akt, IC50 = 14 nM).120
L’
N-
metilazione dell’indolo provoca una diminuzione dell’attività.L’ammina primaria presente nella catena laterale è essenziale per l’attività, infatti qualsiasi modifica del gruppo amminico, compresa la delezione, la sostituzione con un gruppo ossidrilico o con il gruppo metilico, ha determinato una significativa perdita di attività. Senza alcuna eccezione, tutti gli S-isomeri della serie sono da 20 a 150 volte più attivi rispetto ai corrispondente R-isomeri.
Figura 36. Struttura composto 2
Il derivato più potente di questa serie è il composto A-443654 (figura 37 A) (IC50=0.16 nM). È un potente induttore dell’apoptosi con buona attività
antiproliferativa, soprattutto quando associato ai chemioterapici classici, tuttavia non è somministrabile oralmente a causa della bassa biodisponibilità. Al fine di ottenere composti dotati di maggiore biodisponibilità, è stato sintetizzato A-674563, (figura 37 B) che presenta buona biodisponibilità ma ha un’attività 70 volte minore.
49
Figura 37. Strutture di A-443654 (A) e A-674563 (B)
Davies e colleghi della Astex Therapeutics hanno ottenuto strutture cristalline di A-443654 in complesso con Akt2. Un confronto strutturale tra l’inibitore complessato con PKA e Akt2 ha rivelato che A-443654 adotta una conformazione in Akt2 che differisce da quella adottata in PKA. Il metilindazolo e la piridina formano interazioni quasi identiche sia in PKA sia in Akt, mentre la conformazione dell’indolo è molto differente quando lega Akt, infatti, in questo caso l'anello indolico è diretto verso la parte anteriore della tasca di legame per l’ATP dove si trova una regione idrofobica formata dalle catene laterali di Met282, Phe439 e Val166. In questa conformazione, l'anello indolico forma legami non-polari di Van der Waals con la catena laterale di Met282, ciò non si verifica in PKA che presenta la Leu173 al posto della Met282. È interessante inoltre notare che in Akt il gruppo fenilico di Phe54 occupa la tasca idrofobica posta sotto la zona ricca di glicine che nel caso di PKA è occupata dall'anello indolico di A-443654 (Figura 38). 123
L'azoto indolico è ad una distanza di ~3.5 Å dall'ossigeno carbossilico di Glu236, questo spiega perché l’N-metilazione del indolo è dannosa per l'attività su Akt .120
50
Figura 38. Interazione tra PKA e A-443654 (A) e AKT2 e A-443654 (B)
Nei laboratori della GlaxoSmithKline è stata sintetizzata una serie di imidazo[4,5-c]piridine che sono risultati essere buoni inibitori di Akt. Il capostipite di questa classe è il composto GSK 690693 (figura 39) .124 Questo derivato causa una riduzione dei livelli di fosforilazione di numerosi substrati di Akt e inibisce la crescita delle metastasi in vari tumori. E' un potente inibitore di tutte le isoforme di Akt (Akt1, IC50 = 2nM; Akt2, IC50 =13nM;
Akt3, IC50 =9nM),125 e attualmente è in Fase I di sperimentazione clinica per
il trattamento di tumori solidi e linfomi.126
51
La continua ricerca di nuovi inibitori all’Astex Therapeutics ha portato alla sintesi di altri composti a struttura generale indicata in figura 40. 127-130 Il gruppo amminico basico richiesto per l’attività può essere primario, secondario o inserito in un eterociclo (fig.40 A e B).
Figura 40. Struttura generale dei Derivati della Astex Therapeutics.
Tra i composti di questa serie, quelli che hanno mostrato un’attività migliore (IC50< 100 nM), sono i composti 4 e 5 (figura 41) in cui X=Cl, n=2 e
Ar=pirazolo e che presentano, rispettivamente, un’ammina primaria e una secondaria.129
52
Gli inibitori del domino PH impediscono l’interazione di Akt con la membrana e la sua conseguente attivazione.
Mentre il dominio ATPasico è presente in tutte le chinasi, il dominio PH, N-terminale, è presente in un numero minore di chinasi, quindi l’utilizzo di tale dominio come bersaglio farmacologico potrebbe portare alla sintesi di inibitori più selettivi.
Il substrato naturale del dominio PH di Akt è PIP3. Lo sviluppo di analoghi di PIP3 che competono con esso per il legame con il dominio PH rappresenta un approccio innovativo per la sintesi di molecole dotate di attività inibitoria nei confronti di questo pathway. Questi ligandi dovrebbero ridurre la traslocazione di Akt sulla membrana e quindi la sua attivazione.
Sulla base di questa ipotesi, Kozikowski et al. hanno sintetizzato il DPI (1D3-deossifosfatidil-inositolo, figura 42, b) in cui, rispetto al fosfatidilinositolo (PtdIns, figura 42, a), manca un gruppo ossidrilico.131,132 DPI ha mostrato una modesta attività anti-proliferativa contro le cellule di carcinoma umano e nessuna attività in vitro verso PI3K a concentrazioni inferiori a 250 µM;133 in modo simile si comporta il derivato clorurato (figura 42, c). Al contrario il 3-deossi-3-fluoro-PtdIns (figura 42, d) inibisce PI3K con IC50=30 µM,
suggerendo l’importante ruolo della natura elettronica e dell’ingombro sterico del sostituente in C3. 134
53
Nel tentativo di aumentare la stabilità alle fosfolipasi sono stati sintetizzati anche dei derivati con un gruppo carbonato al posto del fosfato, i quali però sono risultati scarsamente attivi.
Tra gli analoghi eterei fosfoinositolici finora sintetizzati (PIAs), il composto più attivo è il PX-316 (Prolx Pharmaceutical, figura 43) che si trova in fase preclinica e sembra essere un inibitore potente e 10 volte più selettivo verso Akt (IC50= 1.5 µM) rispetto a PI3K (IC50= 14.8 µM). 135 PX-316 ha mostrato
una buona attività antiproliferativa contro diverse linee di cellulari di cancro umano con valori di IC50 nell’ordine del micromolare.
Figura 43. Struttura di PX-316
Importante agente antitumorale appartenente a questa classe, somministrabile oralmente, è la perifosina (figura 44), un alchilfosfolipide che ricorda la struttura dei fosfolipidi. La perifosina inibisce l'attivazione di Akt senza inibire direttamente PI3K e PDK1, inoltre ha dimostrato una forte attività antitumorale in vitro contro molte linee cellulari tumorali 138-140 e la capacità di rendere sensibili varie linee cellulari tumorali agli agenti citotossici.141-144 Studi preclinici farmacocinetici hanno dimostrato un'elevata biodisponibilità orale e lunga emivita nel topo e nel ratto [165-166].145,146
La perifosina sembra essere attiva anche in alcuni tipi di metastasi, sia da sola che somministrata con altri agenti antitumorali26, ed è attualmente in
54 della mammella e melanoma.147,148
Figura 44. Struttura della perifosina.
Perifosina è in corso di valutazione in più di 10 studi clinici, fino ad oggi più di 1200 pazienti sono stati trattati con questo antitumorale in studi clinici condotti sia negli Stati Uniti che in Europa.147 Il profilo di sicurezza sembra essere nettamente diverso da quello della maggior parte degli agenti citotossici, infatti la perifosina non causa i tipici effetti collaterali che si hanno frequentemente con le chemioterapie esistenti (mielosoppressione, trombocitopenia, rash cutaneo, sintomi simil-influenzali o alopecia). I principali effetti collaterali della perifosina sono stati nausea, vomito, diarrea e affaticamento, che comunque risultano di lieve entità o inesistenti alle dosi efficaci a indurre la regressione del tumore .146,149,150
Alcuni studi di fase II per valutare l'efficacia della somministrazione orale quotidiana della perifosina in combinazione con radioterapia o con altri agenti antitumorali (come la gemcitabina, paclitaxel, docetaxel, imatinib mesilato desametasone e trastuzumab) sono attualmente in corso.26
55
INIBITORI ALLOSTERICI
Recentemente, nei laboratori della Merck sono stati sintetizzati due inibitori allosterici di Akt (composti 6 e 7, figura 45). 152-156 Questi due composti presentano un’elevata selettività: il composto 6 è attivo solo verso Akt1 (Akt1 IC50 = 4,6 µM) mentre il composto chinossalinico 7 è attivo sia verso Akt1
che verso Akt2 (IC50 = 2,7 e 21 µM, rispettivamente). Nessuno dei due
composti presenta attività nei confronti di Akt3 o qualsiasi altro membro della famiglia delle AGC chinasi (come PKA, PKC o SGK) a concentrazioni fino a 250 µM.157 Questi dati indicano che questa classe d’inibitori mostra un livello
di specificità per Akt che finora non era mai stato raggiunto.
Figura 45. Struttura dei composti 6 e 7.
Studi sul meccanismo d’azione di questi composti hanno rivelato che non sono inibitori competitivi per l’ATP e agiscono con potenza simile a quella degli inibitori chinasici di Akt, bloccando la fosforilazione di Akt1 e Akt2 sulla Thr308 da parte di PDK1, senza interferire con la fosforilazione degli altri substrati peptidici.26
È stato inoltre dimostrato che questi ligandi non sono attivi su nessuna delle tre isoforme di Akt se in queste manca il dominio PH; è stato ipotizzato, quindi, che questi inibitori si leghino a tale dominio.
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seguente meccanismo d’azione: questi inibitori si legano sia al dominio PH che al dominio catalitico, (in un sito diverso da quello deputato al legame con l’ATP), formando un complesso che stabilizza la forma “chiusa” di Akt, così che l’enzima né può essere attivato da PDK1 né può esercitare la propria attività chinasica.26 Gli inibitori allosterici sembrano colpire preferenzialmente
le cellule tumorali rispetto a quelle sane, ed inoltre sono molto attivi come chemiosensibilizzanti.158
Lo studio dei rapporti struttura attività dei derivati chinossalinici ha evidenziato che tale nucleo è un gruppo farmacoforico dotato di alta potenza. Sono stati sintetizzati vari composti che presentano un gruppo parafenilalchilamminico sul C2 della chinossalina (figura 46) a cui sono state legate varie catene laterali.
Figura 46. Modifiche strutturali e struttura dei composti 8 e 9.
Il composto più interessante è quello che presenta come catena laterale quella benzimidazolon-piperidinica e che ha mostrato un aumento della potenza di circa 10 volte con valori di IC50 di 0,29 µM e 2,1 µM per Akt1 e
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Inoltre sono stati sintetizzati altri composti ottenuti da modifiche a livello della porzione chinossalinica. Il miglior derivato sintetizzato è l’eterociclo 9 (composto 9, figura 46), che presenta una buona attività, un’aumentata solubilità e permeabilità cellulare.159 Tale composto sensibilizza numerose
linee cellulari tumorali agli agenti citotossici e agli stimoli apoptotici. la sua sensibilità aumenta nella somministrazione con Rapamicina.160
Il sostituente fenilico in posizione C3 sembra essere essenziale per l’attività ed è stato mantenuto in tutti i derivati sintetizzati.
Un altro composto molto interessante è MK-2206 (figura 47), il quale possiede una buona potenza con valori di IC50 nell’ordine del nanomolare,
sulle 3 isoforme di Akt. Questo composto provoca una riduzione della fosforilazione di Akt e PRAS40 nelle cellule tumorali, in quelle ematiche e nei follicoli piliferi. MK-2206 è attualmente in fase I di studio clinico per il trattamento dei tumori solidi.160 In vivo dopo somministrazione di MK-2206 a pazienti affetti da tumori del pancreas, neuroendocrini e melanoma è stata riscontrata riduzione della massa tumorale. I principali effetti collaterali dovuti a questo composto sembrano essere rash cutaneo e iperglicemia transitoria.
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PI3K INIBITORI
PI3K è membro di una famiglia di chinasi formata da otto isoforme che sono raggruppate in tre classi I, II, III, la classe più studiata è la I. Le chinasi di classe I sono eterodimeri composti da una subunità catalitica (p110) ed una subunità regolatrice (p85).
Questa Classe è ulteriormente suddivisa in due sotto classi:
1. IA, comprende chinasi attivate dai recettori protein-tirosin-chinasi (RTK) le quali sono formate da tre tipi di subunità catalitica p110α, 110β, 110δ che formano eterodimeri con una delle tre subunità regolatrici p85α, p85β, p55γ.
2. IB, comprende chinasi la cui subunità catalitica p110γ, forma eterodimeri con la subunità regolatrice p84 o con quella p101, questa classe è attivata da recettori accoppiati a proteina G.
La subunità catalitica contiene diversi domini tra cui: un dominio per il legame della subunità regolatrice p85, un dominio RAS-binding (RBD), un dominio C2 (proteinkinase C homology-2), un dominio a elica e uno catalitico (figura 48).
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Figura 48. Subunità catalitica di PI3K.
Gli inibitori di PI3K sviluppati fino ad ora vanno ad interagire con tutte le isoforme enzimatiche appartenenti alla I classe. I due inibitori di PI3K meglio caratterizzati sono wortmannin e LY294002 (figura 49).
Figura 49. Strutture di Wortmannin e LY29002
Wortmannin è un metabolita a struttura furano-steroidea isolato dal fungo Penicillum funiculosum. È stato identificato come potente inibitore di PI3K, in
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nM; (PI3Kβ) = 0.7 nM; (PI3Kδ) = 4.1 nM; (PI3Ky) = 9.0 nM). Wortmannin è un inibitore irreversibile di PI3K e agisce legandosi covalentemente ad un residuo di lisina che è normalmente coinvolto nel legame con il fosfato.161 Ha
attività antitumorale sia in vivo che in vitro, è solubile in solventi organici, ma è molto instabile in ambienti acquosi, ciò ne limita l'uso terapeutico.
LY294002 è un derivato flavonoide e, diversamente dal wortmannin, è un inibitore competitivo reversibile dell'ATP con una IC50 di 1.4 µM. Molti studi
hanno dimostrato che possiede attività antiproliferativa e proapoptotica in vitro,162 e buona efficacia nel trattamento delle metastasi in vivo.163
Entrambi i derivati inibiscono le diverse isoforme enzimatiche di PI3K con differente affinità e sebbene abbiano già di per sé attività antiproliferativa, la combinazione con farmaci citotossici tradizionali e radioterapia ne aumenta l'efficacia .164
L’ottimizzazione del wortmannin ha portato alla scoperta di due nuovi composti PWT-458 e PX-866(figura 50).
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PWT-458 è un derivato pegilato del wortmannin che ha mostrato un indice terapeutico migliore in studi preclinici su modelli animali rispetto al wortmannin. Dopo somministrazione endovenosa, la porzione polietilene-glicolica (PEG) viene scissa e viene rilasciato il 17-idrossi-wortmannin. Attività antitumorale in vivo è stata riportata in diversi modelli di tumori umani. PX-866 è un derivato semisintetico del wortmannin che inibisce potentemente e in modo irreversibile PI3Kα, γ e δ (IC50= 5,5, 9,0 e 2,7 nM
rispettivamente). Diversamente dal wortmannin, mostra un certo livello di selettività (IC50 (PI3Kβ)> 300 nM), una maggiore stabilità e provoca una
inibizione più prolungata di PI3K. PX-866 ha dimostrato attività antitumorale contro diversi modelli di tumori solidi umani quando usato da solo (2 mg/kg, per via orale) o in combinazione con agenti chemioterapici antitumorali (per esempio, paclitaxel o gefitinib). Effetti collaterali dovuti alla somministrazione di PX-866 sono perdita di peso, leucocitosi ed iperglicemia; questi sintomi sono dose-dipendente e reversibili dopo l’interruzione del trattamento.165 Dall’ottimizzazione strutturale di LY29400 si è giunti al suo profarmaco idrosolubile SF-1126 (Figura 51). Il composto inibisce tutte le isoforme di PI3K (IC50= 0,5-5,7 µM) e altri membri della famiglia di chinasi PI3K, in
particolare DNA-PK e mTOR. SF-1126 blocca la fosforilazione e l'attivazione di AKT in vivo con valori di IC50=2,4 µM. La somministrazione del profarmaco
sembra aumentare la biodisponibilità dell’inibitore attivo nelle cellule tumorali, ciò comporta una significativa attività antitumorale in modelli di tumore umano. Oltre alla sua diretta attività sulle cellule tumorali, l’analisi della densità dei microvasi nel tessuto tumorale ha dimostrato che il composto ha significativa attività antiangiogenica in vivo. La sicurezza di SF-1126 negli esseri umani è attualmente in fase I di sperimentazione clinica, i pazienti sono trattati due volte a settimana con infusione endovenosa, in cicli di trattamento di 4 settimane.165
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Figura 51. Struttura di SF -1126
XL147 e XL765 (strutture non divulgate) sono inibitori di PI3K in fase I di sperimentazione clinica.
XL-147 è attivo contro le PI3K di classe I (IC50=39,383,23,36 nM,
rispettivamente per α, β, γ e δ),inibisce la via di PI3K in cellule tumorali in coltura e blocca la crescita vascolare indotta dal fattore endoteliale.166,167 La
somministrazione orale di XL-147 rallenta la crescita o induce diminuzione del tumore in modelli preclinici di tumori della mammella, del polmone, dell'ovaio, della prostata e gliomi.
Una maggiore inibizione della crescita tumorale è stata ottenuta combinando questo PI3K inibitore con farmaci antitumorali noti (per esempio, carboplatino, paclitaxel o erlotinib).
XL-765 ha attività verso la classe I di PI3K (IC50 = 39, 113, 9 e 43 nM per α,
β, γ e δ, rispettivamente) inoltre inibisce anche DNA-PK (IC50 =150 nM) e
mTOR (IC50=157 nm). Come nel caso di XL-147, la crescita del tumore è
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mTOR INIBITORI
mTOR è una serina treonina chinasi appartenente alla famiglia delle PIKK. Questo enzima possiede un dominio chinasico, un dominio FBR (FKBR12-rapamicin-banding), un dominio FAT (FRAP-ATM-TRRAP), un dominio FATC (FAT C-terminale) al C-terminale e nella zona N-terminale ritroviamo ripetuto il motivo HEAT.88
Figura 52. Struttura di mTOR
Gli unici inibitori specifici per mTOR fino ad oggi conosciuti sono la rapamicina e suoi derivati. La rapamicina è un antibiotico macrolide prodotto da Streptomyces hygroscopicus che agisce anche da inibitore allosterico di mTOR. Essendo un solido bianco cristallino insolubile in soluzioni acquose, non è stato possibile sviluppare una formulazione parenterale.170
La rapamicina è stata approvata dalla US FDA (Food and Drug Administration) nel 1990, come immunosoppressore nel trattamento di pazienti trapiantati di rene, in quanto inibisce efficacemente e in modo specifico la proliferazione delle cellule T. Tuttavia, la scarsa stabilità chimica ne ha limitato l'uso clinico, e ha portato allo sviluppo di tre analoghi sintetici temsirolimus, everolimus e deforolimus che possiedono migliori proprietà farmacocinetiche. Questi analoghi hanno mostrato un’azione antiproliferativa
